Questo metodo fornisce istruzioni dettagliate su come generare organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo mediante differenziazione in endoderma definitivo, quindi epitelio intestinale posteriore e, infine, il trasferimento in condizioni di coltura 3D. I risultati ottenuti da organoidi intestinali derivati da cellule staminali pluripotenti indotte dall'uomo dimostrano una maggiore traducibilità rispetto ai dati provenienti da colture monocellulari, pur essendo più pratici degli organoidi derivati da tessuti primari, che possono essere difficili da mantenere in coltura a lungo termine. Dopo la generazione di cellule intestinali umane da iPSC differenziate, utilizzare una pipetta sierologica da 5 millilitri per staccare il monostrato cellulare da ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti.
E raggruppa le cellule in un'unica provetta da 15 millilitri per la centrifugazione. Risospendere il pellet nel terreno di crescita intestinale integrato con fattori di crescita. E aggiungere il volume appropriato di matrice extracellulare in base al numero di pozzetti da piastrare.
Aggiungere 30 microlitri di sospensione cellulare al centro del numero appropriato di pozzetti di una piastra a 48 pozzetti. Assicurarsi che l'ECM sia posizionato al centro del pozzetto è molto importante per la stabilità a lungo termine di quel campione. Se l'ECM tocca la parete del pozzo, potrebbe collassare e i campioni possono andare persi.
Posizionare la piastra nell'incubatore per colture cellulari per almeno 5 minuti. Quando la matrice extracellulare si è solidificata, aggiungere 300 microlitri di terreno di crescita intestinale fresco integrato con fattori di crescita a ciascun pozzetto e riportare la piastra nell'incubatore per colture cellulari. Dopo 48 ore, utilizzare un microscopio ottico per controllare la formazione di organoidi nei pozzetti.
Dopo 7 giorni di coltura, aspirare il terreno di coltura e sostituirlo con DPBS ghiacciato. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 millilitri per staccare meccanicamente gli organoidi e la sfera della matrice extracellulare dalla piastra. Quindi, raggruppare gli organoidi in una singola provetta da centrifuga da 15 millilitri.
Raccogliere gli organoidi mediante centrifugazione e aspirare il surnatante fino alla parte superiore dello strato ECM visibile. Risospendere il pellet in 15 millilitri di DPBS ghiacciato e centrifugare nuovamente le cellule. Dopo aver aspirato il surnatante come dimostrato, sospendere nuovamente il pellet in 1 millilitro di PBS ghiacciato e utilizzare una pipetta P200 per rompere manualmente gli organoidi intatti.
Confermare una completa dissociazione degli organoidi. Ruotare gli organoidi dissociati e risospenderli nel volume richiesto della matrice extracellulare prima di placcarli su una nuova piastra a 48 pozzetti, come dimostrato. Quindi, rimettere la piastra nell'incubatrice per 5 minuti.
Dopo 5 minuti, rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere il terreno basale intestinale con fattori di crescita e inibitore ROCK. Cambiare supporto ogni 2-4 giorni. Per innescare una risposta infiammatoria negli organoidi intestinali, sostituire il surnatante in ogni pozzetto della coltura di organoidi con 300 microlitri di terreno basale appena preparato integrato con 40 nanogrammi per millilitro di TNF alfa.
Quindi, rimettere la piastra nell'incubatore per colture cellulari per 48 ore per replicare un ambiente pro-infiammatorio. L'espressione genica può essere monitorata nel corso del differenziamento IPSC umano utilizzando marcatori di pluripotenza che sono altamente espressi il giorno 0 e sono rapidamente sottoregolati durante il processo di differenziamento definitivo dell'endoderma. Il giorno 2 di differenziamento, i geni definitivi dell'endoderma dovrebbero iniziare ad essere espressi e l'espressione dovrebbe raggiungere il picco al giorno 3.
Durante la specificazione dell'intestino posteriore, l'espressione di CDX2 e HNF4alfa dovrebbe essere indotta e aumentare nel tempo. 48 ore dopo il trasferimento dei fogli cellulari 2D, i fogli di cellule dovrebbero iniziare ad auto-organizzarsi in strutture sferoidi 3D più compatte che sono inizialmente piccole, ma che aumentano gradualmente di dimensioni e complessità nei successivi 7-10 giorni di coltura. Gli organoidi non devono essere fatti passare fino a quando non hanno raggiunto una chiara morfologia sferoidale dell'organoide con epitelio evidente e con il lume rivolto verso il centro della struttura.
Quando le strutture raggiungono questo stadio, l'immunocitochimica può essere eseguita per confermare l'espressione di marcatori intestinali, come la villina e il CDX2. Per modellare l'infiammazione, il TNF alfa può essere aggiunto al terreno di coltura tissutale per 24-48 ore, il che in genere si traduce nell'espressione di marcatori pro-infiammatori in combinazione con la sottoregolazione dei marcatori epiteliali intestinali. Gli organoidi intestinali pluripotenti derivati da cellule staminali indotte dall'uomo possono essere utilizzati per la scoperta di farmaci, la modellazione di malattie, l'editing genetico, lo studio del microambiente tumorale e il profilo trascrittomico, proteomico ed epigenetico di qualsiasi malattia di interesse.
Questo metodo può aiutare molti laboratori a stabilire gli organoidi intestinali come sistema modello, fornendo loro un metodo aggiuntivo per la loro ricerca.
