Наш протокол может быть использован для улучшения качества и количества данных экспрессии генов, полученных из образцов РНК, полученных FFPE, особенно в неоптимальных образцах качества. Этот метод оценивает качество РНК в образцах тканей FFPE и позволяет оптимизацию их обработки вниз по течению для улучшения количества и качества данных секвенирования выборки. Этот метод позволяет получить всеобъемлющую характеристику стенограммы в биологическом и клиническом образце и может дать представление о функциональных элементах генома в развитии и болезни.
Деградация FFPE-РНК и выборка методов отбора проб КК, подготовки библиотек и анализа данных могут быть очень сложными. Будьте дотошны при выборе правильных методов и соответствующих элементов управления. Визуальная демонстрация позволяет зрителям наблюдать за небольшими тонкими изменениями и мерами предосторожности, необходимыми при планировании, оценке и процессе секвенирования, особенно для плохо сохранившихся образцов FFPE.
Чтобы проверить качество образца РНК, запустите образец по системе РНК КК в соответствии с инструкциями производителя и используйте соответствующее программное обеспечение биоанализа для анализа распределения фрагментов РНК в образце и расчета доли фрагментов более 100 и 200 нуклеотидов. Основываясь на метриках КК, идентифицировать образцы с менее чем 40% фрагментов длиннее 100 нуклеотидов, чтобы исключить эти образцы из обработки. Для секвенирования оттаивать соответствующие наборы секвенирования реагентов в соответствии с параметрами пробега в ванне с водой комнатной температуры и поместить реагент лоток при четырех градусах Цельсия после оттаивания.
Поместите пакет ячейки потока при комнатной температуре в течение 30 минут. Пока пакет нагревается, откройте приложение Illumina Experiment Manager и выберите лист Create Sample. Выберите секвенсор для использования и нажмите Далее.
Введите штрих-код комплекта реагентов и другие соответствующие параметры рабочего процесса. Затем загрузите образец листа, созданного в соответствии с критериями последовательности Illumina. Чтобы подготовить библиотеку образцов и библиотеку управления PhiX, денатурировать и разбавить библиотеки до соответствующих концентраций и смешать библиотеки управления образцом и PhiX, чтобы получить соотношение громкости контроля 5%PhiX.
Когда клетки потока будут готовы, удалите обертку, очистите стеклянную поверхность без ворсинок спиртом и высушите стекло с низкой лабораторной тканью ворса. Удалите реагент картридж из четырех градусов по Цельсию хранения и инвертировать картридж пять раз, чтобы смешать реагенты. Аккуратно коснитесь картриджа на скамейке, чтобы уменьшить пузырьки воздуха и загрузить денатурированный и разбавленный образец в реагент картриджа в назначенном резервуаре.
Загрузите ячейку потока, буферный картридж и картридж реагента на систему. Затем выполните автоматизированную проверку и просмотрите выход, чтобы убедиться, что параметры запуска проходят проверку системы. Когда автоматизированная проверка будет завершена, выберите начало запуска секвенирования.
Чтобы визуализировать результаты кк и после выравнивания, запустите мульти-КК для создания агрегированного отчета в формате HTML. Для определения эффектов пакетов и оценки качества карты данного набора данных используйте R-скрипт для работать с основным анализом компонентов. Анализ корреляции выборки может быть проведен с использованием корреляции Пирсон между различными образцами.
Оценка доли фрагментов, более 100 нуклеотидов, более полезна, чем оценка фрагментов длиной более 200 нуклеотидов, поскольку она более чувствительна для точного измерения доли меньших размеров фрагментов для сильно деградированных образцов РНК. Учитывая высокую степень деградации набора выборки, рекомендуется общий метод подготовки библиотеки РНК. Например, здесь показаны библиотеки секвенирования, подготовленные из четырех различных образцов.
Здесь показаны обзоры качества секвенирования необработанных файлов Fast и содержимого адаптера образца. Быстрый скрининг может помочь обнаружить загрязнение, такое как бактериальное или мышиное загрязнение в образцах. Выравнивание STAR может быть использовано для определения доли считывалось на эталонный геном, процент считывался однозначно отображенный на эталонный геном, и доля считывалась, которые не были отображены, или которые были отображены на несколько локусов.
Статистика карты и РСЕЦ может быть использована для определения процентов РНК мессенджера, нетронных и интергенных оснований, присутствующих в картографических считывах. Для этих репрезентативных анализов некоторые деградированные библиотеки имели три основных смещения, в которых больше читает были отображены ближе к трем премьер, чем к пяти премьер-конец. Кроме того, можно провести анализ основных компонентов для определения процента от общего объема вариаций, захваченных основными компонентами для биологических репликаций каждого образца.
Позаботьтесь, чтобы избежать деградации выборки, подготовить репликации и несколько слоев для каждого образца, использовать соответствующие метрики для оценки качества выборки, и использовать правильный метод подготовки библиотеки. Используя эту методологию, более крупные исследования NGS могут быть выполнены с ранее непригодными для использования образцами FFPE с различным временем хранения и условиями, чтобы получить представление о различных состояниях болезни. Этот метод проложил путь для исследователей для изучения существующих больших архивов образца FFPE с богатой клинической информацией и может значительно повысить популяционых исследований рака.
