Используя этот протокол, любая лаборатория, которая имеет стандартный конфокальный микроскоп, оснащенный 405 нанометровый лазер может выполнять лазерные абляции волосяных клеток и контролировать их регенерацию. В отличие от электроабляции, эта техника ограничивает повреждения окружающих клеток и является более доступной, чем мощная импульсная ультрафиолетовая лазерная установка. Конфокальные изображения также могут быть выполнены непосредственно до и после абляции.
Этот метод позволяет нам лучше понять регенеративное поведение сенсорных прародителей, которые могут помочь в разработке методов лечения потери слуха человека. Для монтажа, первый пипетка три-четыре личинок анестезии в небольшой капли E3 tricaine раствор в центре 35-миллиметровой блюдо, с 14 миллиметровым числом 1,5 покрытия скольжения дна. Удалите избыток раствора так, чтобы личинки оставались в небольшой капле достаточно большой, чтобы содержать их.
И поместите блюдо на сцену бинокулярного стерео микроскопа. Манипулируйте зумом и фокусом так, чтобы все личинки были в поле зрения и используйте переносную пипету, чтобы добавить тонкий слой агро-решения на крышку скольжения. Удалите избыток агро до тех пор, пока жидкость просто заполняет колодец в нижней части блюда, заботясь, чтобы не аспирировать личинок.
И используйте нож для волос, чтобы быстро сориентировать личинки в агро-раствор с ростральной стороны, обращенной влево. Аккуратно прижимайте личинки к стеклу, чтобы личинки лежали в профиль с правой стороны лицом вниз. Примерно через 60 секунд агро начали затвердевать и личинки не смогут быть переориентирована.
Через пять минут, используйте передачу пипетки, чтобы заполнить блюдо на полпути с E3 дополняется 1X трикаин. Чтобы найти потенциальные цели, включите мощность лазерной сканирующей системы конфокальные микроскопии и инициализируйте лазер с помощью интегрированного программного обеспечения для визуализации. Выберите цель погружения масла 63X Plan-Apochromat и нанесите масло погружения на объектив.
Защитите блюдо в круговой стадии вставки с ростральным аспектом личинок, обращенных влево. Используя яркое поле или дифференциальное интерференционное контрастное освещение, выберите одну из установленных личинок для визуализации и используйте ручку фокусировки, чтобы привести кожу на стороне рыбы ближе всего к крышке скольжения в фокусе. Переключитесь на эпифлуоресцентное освещение в канале GFP и найдите заднюю боковой линию по выражению GFP вдоль горизонтального миосепта.
Кольца флуоресцентных клеток свидетельствуют о нейромастовых мантийных клетках, а удлиненные нити клеток являются межнейроматическими клетками. Начиная с первой мигрирующей первобытной нейромасты, используйте джойстик управления этапом, чтобы визуально сканировать caudally вдоль горизонтального миосепта. После строки межнейромастовых клеток до тех пор, пока область между третьей и четвертой мигрирующих изначальные нейромасты не будет достигнута.
Если несколько личинок должны быть изображены, выберите положение, чтобы установить положение первой ступени. После того, как тела клеток в L3, L4 области были определены, переключиться на режим приобретения и использовать соответствующий лазер для активации GFP изображения трек. Чтобы добавить передаваемый световой канал к активированной лазерной дорожке, нажмите на коробку T-PMT в меню высадки изображений.
Для изображения личинок ET20, выберите 488 нанометровый лазер, установите мощность лазера до 6%от размера скважины до одного эквивалента единицы области и цифровой прирост до 750. Отрегулируйте выгоды таким образом, чтобы тела клеток были насыщены, чтобы запечатлеть в противном случае тусклые проекции и филоподию. И установить размер кадра до 1024 на 1024 пикселей, в среднем до двух и цифровой зум до 0,7.
Проверьте поле стека, чтобы принести вверх по меню высадки позиции. При быстром сканировании сосредоточьтесь до тех пор, пока межнейромаста клетки просто не в фокусе и установить первый срез. Сосредоточьтесь на образце до тех пор, пока межнейромаста клетки снова из фокуса и установить последний срез.
Затем нажмите стоп и нажмите кнопку начать эксперимент, чтобы захватить предварительно абляции стек. Если позиции этапа были добавлены, актививируете параметр позиций так, чтобы только текущее положение было изображено, и сохраните файл после его захвата. Для лазерной абляции целевых тел клеток, нажмите показать все инструменты в интерфейсе приобретения и в меню настройки изображений, выберите добавить новый трек.
Нажмите краситель и выберите DAPI. По каналам выберите 405 для настройки лазера и увеличьте мощность лазера до 75%Unclick канал DAPI, чтобы выключить лазер во время сканирования для тела клеток-кандидатов для абляции. Нажмите в прямом эфире и с телом межнейромастовой клетки, центряющейся в поле зрения, увеличьте масштаб сканирующей рамы до 20-22X.
Остановите живое сканирование, как только тело клетки заполнит поле зрения. Проверьте 405 нанометровый лазерный затвор поле, чтобы активировать трек и установить таймер в течение 45 секунд. Затем активируйте непрерывное сканирование и запустите таймер.
Немедленное прекращение сканирования на 45 секунд. Для визуализации клеток органов после абляции, в соответствии с меню каналов, unclick DAPI трек инактивировать абляционный лазер и открыть меню режима приобретения. Нажмите увеличить и уменьшить зум до 0,7.
Чтобы оценить успех абляции клеток, быстро сканируйте поле зрения. Используя те же настройки, что и для визуализации до абляции, захват и сохранение изображения после абляции. Осмотрите переданное изображение канала трубки света photomultiplier для того чтобы более далее подтвердить клетчатое повреждение.
Поврежденные клетки продемонстрируют гранулированный вид и ядра часто набухают или появляются нерегулярно по форме. Для оценки восстановления тела после абляции активируйте как положение этапа, так и варианты времени для захвата изображений замедленного действия и установите параметры времени до соответствующей экспериментальной точки времени и 15-минутных интервалов. Затем начните эксперимент по приобретению изображений и сохранению полученного файла после завершения.
В этом репрезентативном эксперименте была выявлена область боковой линии, расположенной между третьей и четвертой мигрирующими первобытными нейромастами, и были сняты предабляционные изображения. После абляционное сканирование подтвердило, что в абляционной области не осталось тел клеток. Оставляя зазор между удлиненными проекциями смежных межнейромных клеток.
Анализ передаваемого света фотомультипельный канал трубки после абляции, выявляет поврежденные и умирающие клетки. Отмечен опухшими ядрами неправильной формы и гранулированным внешним видом. Набор крупных амебоидных клеток, которые, вероятно, макрофаги также могут наблюдаться.
В этом эксперименте абляция нескольких клеток в двойных трансгенных личинках создала значительные пробелы в струне межнейромастов, но практически не повлияла на боковой линейный нерв. После лазерной абляции можно измерить размеры зазора. В диапазоне от нескольких микрон до 100 микрон, в зависимости от ширины, что отдельные клетки нейромаста и сколько клеток выбраны для абляции.
После абляции, некоторые межнейромаста клетки восстановить в течение первых нескольких часов визуализации. С вероятностью закрытия разрыва отрицательно коррелирует с размером разрыва. Даже в межнейромаста клетки, которые не в состоянии восстановить однако, формирование длинных проекций из соседних межнейромастовых клеток, которые могут напоминать расширение нейрональных конусов роста можно наблюдать.
Важно тщательно проверить канал Т-ПМТ на поврежденные клетки, экспонирование ядра неправильной формы и детализации, и дать достаточно времени для того, чтобы эти показатели гибели клеток стали видимыми. Дальнейший анализ полученных данных по микроскопии замедленного действия потенциально может выявить новое клеточное поведение, вызванное лазерной абляцией, и может направлять разработку экспериментов по выявлению регуляторов регенерации. Этот метод позволил нам изучить молекулярные регуляторы регенерации межнейромастовых клеток, предоставив быстрый и экономически эффективный метод выборочного повреждения этих клеток.
