Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы изучить и количественно оценить регенерацию мышц в модели мышечного заболевания рыбок данио. Этот метод обеспечивает высокопроизводительный конвейер, который не только экономически эффективен, но и хорошо воспроизводим в оценке регенеративного потенциала больной мышцы в условиях in vivo. Продемонстрировать процедуру со мной будет Авника Рупарелия, научный сотрудник Австралийского института регенеративной медицины.
Для генотипирования живого эмбриона очистите прозрачную защитную пленку с верхней поверхности 24-камерного чипа экстракции ДНК и используйте 20-микролитровый фильтрующий наконечник с разрезанным наконечником для переноса одного анестезированного эмбриона в 13 микролитрах эмбриональной среды в каждую камеру чипа. Когда все эмбрионы будут загружены, аккуратно установите чип на платформу генотипирования эмбрионов рыбок данио, поместив сначала одну сторону, а затем остальную часть чипа. Прикрепите крышку магнитной платформы к чипу, чтобы предотвратить испарение эмбриональной среды во время протокола экстракции ДНК, и закройте крышку.
Установите базовый блок на 2,4 вольта, 0,051 ампера и 0,12 Вт и запустите протокол извлечения ДНК. Платформа должна начать вибрировать, что можно оценить, осторожно прикоснувшись к крышке. Во время работы программы подготовьте 24-луночную пластину, добавив один миллилитр эмбриональной среды в каждую лунку, и пометьте восьмистворчатые полосатые трубки, которые будут использоваться для сбора материала ДНК из каждого эмбриона.
После восьми минут извлечения нажмите кнопку вкл/выкл, чтобы остановить вибрацию платформы, аккуратно снимите магнитную крышку и поднимите чип с платформы. Перенесите 10 микролитров эмбриональной среды из одной камеры в соответствующий колодец восьмияменной полосчатой трубки и сразу же добавьте в камеры две капли свежей эмбриональной среды. Перенесите эмбрион из камеры в соответствующий колодец из предварительно подготовленной 24-скважинной пластины.
Когда все эмбрионы будут перенесены, поместите пластину в инкубатор с 28 градусами Цельсия. Выполните соответствующие анализы генотипирования на генетическом материале, собранном в восьмискважных ленточных трубках, чтобы определить генотип каждого эмбриона. После того, как генотип каждого эмбриона был идентифицирован, перенесите эмбрионы в 90-миллиметровые чашки Петри, содержащие 25 миллилитров средней воды, и высиживают пластины при 28 градусах Цельсия до травмы мышц.
Через четыре дня после оплодотворения используйте пипетку, чтобы перенести одну обезболенную личинку в новую чашку Петри и осторожно удалить любую лишнюю среду из чашки под рассекающим микроскопом. Ориентируйте рыбу так, что голова находится слева, хвост справа, дорсальная область вверх, а вентральная область опущена, и используйте иглу 30 калибра, чтобы сделать быстрый точный удар в один-два сомита в эпаксиальной мышце над анальной порой и горизонтально к миосектуму. Нанесите каплю эмбриональной среды на травмированную рыбку данио и осторожно перенесите личинку в одну лунку из 24-луночной пластины, содержащей один миллилитр свежей эмбриональной среды на лунку.
Когда все личинки будут повреждены, поместите пластину в инкубатор с 28 градусами Цельсия, пока рыбки данио не будут сфображены. Чтобы количественно оценить регенерацию мышц, откройте однодневное изображение после травмы в соответствующей программе для анализа изображений и используйте полигональный инструмент, чтобы нарисовать форму вокруг места раны. Используйте программное обеспечение для измерения площади и средней интенсивности двулучепреломления области и скопируйте эти значения в ячейки D3 и E3 предоставленного шаблона.
Нарисуйте две дополнительные области, каждая из которых охватывает от одного до двух неповредимых сомитов, и измерьте площадь и среднюю интенсивность двулучепреломления каждой из этих областей. Скопируйте эти значения в ячейки D4 и D5, E4 и E5 в шаблоне. Затем повторите измерение для тех же областей на трехдневном изображении после травмы.
Когда двулучепреломления было измерено одинаково на всех изображениях, рассчитайте нормализованное двулучепреломления для каждой области, разделив среднюю интенсивность двулучепреломления каждой области на ее площадь. Для каждой точки времени рассчитайте среднее нормализованное двулучепреломление двух неповредимых областей, чтобы обеспечить точку отсчета для неповредимой мышцы. Чтобы определить степень мышечной травмы в первый день после травмы, разделите нормализованное двулучепреломение области повреждения на среднее нормализованное двулучепреломления неповредимых областей.
Чтобы определить степень регенерации мышц, разделите нормализованное двулучепреломение травмированной области на трехдневном послетравмном изображении на среднюю нормализованную интенсивность неповредимых областей на этом этапе. Наконец, рассчитайте регенеративный индекс, разделив значение степени регенерации мышц на третий день после травмы на значение степени мышечной травмы в первый день после травмы. В этом репрезентативном анализе кладка эмбрионов из помесья между двумя гетерозиготными рыбками данио Lama2 была перенесена на чип экстракции ДНК и впоследствии генотипирована.
В то время как мышечная травма приводит к снижению интенсивности двулучепреломления в первый день после травмы, успешная регенерация мышц приводит к увеличению двулучепреломления в той же области. Также примечательно, что в то время как личинки дикого типа демонстрируют равномерную интенсивность двулучепреломления из-за нормального мышечного паттерна, интенсивность двулучепреломления в мышце личинок нокаута Lama2 неравномерна и очень спорадична, вероятно, из-за снижения целостности мышц. Как уже отмечалось, как дикий тип, так и личинки с дефицитом Lama2 демонстрируют значительно повышенную интенсивность двулучепреломления в месте раны через три дня после травмы по сравнению с одним днем после травмы, что указывает на то, что мышца регенерировалась.
Определение регенеративного индекса показывает, что личинки с дефицитом Lama2 демонстрируют поразительное увеличение регенерации мышц по сравнению с животными дикого типа. Хотя этот протокол позволит нам идентифицировать любые изменения в способности мышц к регенерации в моделях мышечных заболеваний, необходимо выполнить клеточный и молекулярный анализ для выявления механизмов, которые отвечают за наблюдаемые изменения. Этот метод позволил нам определить, как нарушение функции мышечных стволовых клеток и нарушение связанных с ними нишевых элементов способствует патогенезу мышечных заболеваний, что позволяет нам идентифицировать новые механизмы заболевания.
