Мы оптимизировали высококвалифицированный и клинически применимый метод для расширения цитокиных Т-клеток, полученных из ПБМК, и для оценки их цитотоксичности против рака. Преимущество этого метода заключается в том, чтобы обеспечить стандартную операционную процедуру для техников и клиницистов для количественной оценки потенции цитокинов индуцированных клеток-убийц как в научных исследованиях, так и в клинической оценке. Начните эту процедуру с подготовки клеток CIK, как описано в текстовом протоколе, а затем мыть клетки CIK с 10 миллилитров стерильных PBS.
Центрифуга в течение 10 минут при 300 раз G и от 18 до 20 градусов по Цельсию. Аспирировать супернатант и повторное распределение клеток с пятью миллилитров PBS. Подсчитайте числа ячееок и проверьте жизнеспособность ячейки с помощью анализа trypan blue exclusion.
Aliquot клетки CIK в шесть стерильных 1,5 миллилитровых труб при плотности примерно от 5 до одного миллиона клеток на миллилитр PBS. Этикетка и лечение ячеек, как подробно описано в текстовом протоколе. Аккуратно смешайте клетки CIK с антителами, аккуратно трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза с одним миллилитровым стерильным пипеткой.
Инкубировать клетки в течение 15 минут при комнатной температуре в темноте. Центрифуга труб в течение 10 минут при 300 раз G и 18 до 20 градусов по Цельсию. После центрифугации, аспирировать супернатант и повторно гранулы клетки с одним миллилитром PBS, а затем осторожно пипетки клетки вверх и вниз, по крайней мере три раза с одним миллилитров стерильной пипетки.
Передача клеточной подвески в стерильные пять миллилитров полистирола круглой нижней трубки с крышкой клетки ситечко, мягко трубы через крышку, а затем поместить трубки на карусели в порядке. Откройте программное обеспечение для анализа цитометрии потока и создайте экспериментальную папку, а затем нажмите кнопку нового образца, чтобы добавить образец и трубку в эксперимент. Назовите трубки, перечисленные в текстовом протоколе.
Чтобы создать систему рассеяния для популяций ячеек CIK, сначала выберите трубку одну и нажмите на кнопку точечного участка для создания участка FSCA SSCA. Нарисуйте прямоугольные ворота над всей популяцией клеток с порогом FSCA более 5000, чтобы исключить клеточный мусор. Выберите параметр FSCA FSCH для нового точечного участка и нарисуйте полигональные ворота вокруг всех одиночных ячеек.
Выберите количество по сравнению с FITC-спряженный CD3 и подсчитайте по сравнению с параметром CD56, спряженным APC, для нового сюжета гистограммы. Выберите спряжку CD3 с FITC по сравнению с параметром CD56 с APC и нарисуйте четыре квадрантных ворот для определения четырех субпопуляций. Завехать данные с 20 000 одиночных ячеек в каждом экземпляре.
Нажмите кнопку образца нагрузки, чтобы сначала проанализировать пустой образец управления. Определите всю популяцию клеток CIK с помощью параметров канала CD56 и CD3. Откройте файлы, содержащие статистические значения отдельного образца, для анализа популяций клеток CIK и перепечатки их в файлы анализа.
Для выполнения цитотоксического анализа, кокультура CIK и человека хронический миелоидный лейкоз K562 клетки, добавив один миллилитр клеток K562 к каждому хорошо в шесть хорошо пластины при плотности 5 миллионов клеток на миллилитр, а затем добавить один миллилитр базальной среды с или без клеток CIK в шесть хорошо пластины, как у перечислены в текстовом протоколе. Смешайте подвески клеток, аккуратно трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза. Поместите тарелку в инкубатор на 24 часа.
Теперь, кокультура CIK и яичников OC-3 клеток, добавив один миллилитр базальной среды с или без клеток CIK на шесть хорошо пластины, перечисленные в текстовом протоколе. Смешайте подвески клеток, аккуратно трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза. Поставь тарелку в инкубатор на 24 часа.
После инкубации, урожай CIK K562 клеточной подвески непосредственно в 15 миллилитров стерильной трубки. Для сбора как суспензии, так и клеток соблюдения из групп CIK OC-3 сначала перенесите подвесную клетку в стерильную трубку на 15 миллилитров. Вымойте колодец одним миллилитров стерильного PBS, соберите PBS, и добавить его в трубку, а затем добавить 5 миллилитров раствора фермента диссоциации клеток и инкубировать в течение пяти минут при 37 градусов по Цельсию.
Добавьте один миллилитр раствора из той же трубки в соответствующий колодец и аккуратно смешайте клетки, трубя вверх и вниз по крайней мере три раза с помощью одноми миллилитров стерильной пипетки. Соберите все клетки в одной трубке. Центрифуга 300 раз G в течение 10 минут.
Аспирировать супернатант и повторное распределение клеток в один миллилитр стерильных PBS. Пеллет клетки в 300 раз G в течение 10 минут, а затем аспирировать супернатант и повторного перерасхода клеток в 100 микролитров стерильных PBS. Добавьте пять микролитров 7-ААД красителя к клеточной подвеске.
Аккуратно смешайте клетки, трубя вверх и вниз, по крайней мере три раза с одним миллилитровым стерильным пипеткой. Инкубировать в течение 10 минут и оставить в темноте до анализа. Для выполнения анализа цитолитических возможностей смешайте подвеску клетки и повторите подготовку к цитометрии потока.
Нажмите на новую кнопку образца, чтобы добавить образец и трубку в эксперимент. Назовите трубки, перечисленные в текстовом протоколе. Чтобы создать систему рассеяния для цитолитических анализов, сначала выберите трубку одну и нажмите на кнопку точечного участка, чтобы создать участок FSCA SSCA.
Нарисуйте прямоугольные ворота над всеми событиями с порогом FSCA более 50 000, чтобы исключить клеточный мусор. Выберите параметр SSCA CFSE для нового точечного участка, затем выберите параметр 7-AAD CFSE для нового точечного участка и нарисуйте четыре квадрантных ворот для определения четырех субпопуляций. Нажмите кнопку образца нагрузки, чтобы сначала проанализировать пустой образец управления.
Отрегулируйте напряжение SSCA и FSCA. Определите популяцию мертвых клеток с помощью параметров канала CFSE и 7-AAD. Запись данных из более чем 20 000 положительных клеток CFSE в каждом образце.
Откройте файлы, содержащие статистические значения каждого отдельного образца, чтобы проанализировать необязаемые популяции клеток и экспортировать данные в файлы анализа. Репрезентативные результаты стратегии анализа субпопуляции положительных Т-клеток CD-3 CD56 у здоровых доноров показаны статистическим анализом доли CIK от трех особей. Cd-3 положительная положительная доля клеток CD56 значительно увеличилась после 14 дней расширения.
Это видно через 65% для оригинального PBMC, который увеличился до 27,4% для клеток CIK, собранных на 14-й день. В этой системе культуры, клетки CIK дали около половины сотни раз изменения по сравнению с первоначальным числом PBMCs. K562 клетки были окрашены нефлуоресцентным красителем CFSE, который расщепляется внутриклеточных эстера в жизнеспособных клетках и становится высоко флуоресцентным красителем.
Иллюстрируются размеры и детализация клеток CIK и CFSE.positive. Клетки CFSE, окрашенные K562, были совместно обработаны клетками CIK в соотношении ноль к одному, пять к одному и 10 к одному. Эти клетки были окрашены 7-AAD красителя в качестве зонда жизнеспособности для исключения мертвых клеток.
Оценивались 7-AAD положительные клетки положительных клеток CFSE K562. Клетки, окрашенные CFSE OC-3, были совместно обработаны клетками CIK в соотношении 10 к одному. Очевидная цитотоксичность CIK против клеток OC-3 демонстрируется здесь после 24 часов инкубации.
CIK Т-клеток, как сообщается, оказывают значительное цитотоксическое воздействие против раковых клеток и уменьшить неблагоприятные последствия хирургии, радиации и химиотерапии в лечении рака. Иммунотерапия является перспективным методом лечения ряда видов рака. CIK может быть эффективно расширен в пробирке путем инкубации пациентов полученных PMBCs в GMP-класса состояние для дальнейшего аутологичного вливания.
Следуя этому протоколу, мы могли бы выполнить иммунную клеточную терапию в GTP-или GMP-классе для дальнейшего клинического лечения рака.
