قمنا بتحسين طريقة مؤهلة تأهيلا عاليا وقابلة للتطبيق سريريا لتوسيع الخلايا التائية القاتلة المشتقة من PBMC من السيتوكين، وتقييم السمية الخلوية ضد السرطان. وميزة هذه التقنية هي توفير إجراء تشغيلي موحد للفنيين والأطباء لتحديد مدى فاعلية الخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكين في كل من البحث العلمي والتقييم السريري. ابدأ هذا الإجراء بإعداد خلايا CIK كما هو موضح في بروتوكول النص ، ثم غسل خلايا CIK بـ 10 ملليلتر من PBS العقيم.
جهاز طرد مركزي لمدة 10 دقائق في 300 مرة G و 18 إلى 20 درجة مئوية. pirate عظمى و resuspend الخلايا مع خمسة ملليلتر من برنامج تلفزيوني. عد أرقام الخلية واختبار صلاحية الخلية باستخدام اختبار استبعاد trypan الأزرق.
Aliquot الخلايا CIK في ستة أنابيب 1.5 ملليلتر معقمة في كثافة ما يقرب من 5 إلى مليون خلية لكل ملليلتر من برنامج تلفزيوني. تسمية الخلايا ومعالجتها كما هو مفصل في بروتوكول النص. خلط بلطف الخلايا CIK مع الأجسام المضادة عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقمة ملليلتر واحد.
احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب لمدة 10 دقيقة في 300 مرة G و 18 إلى 20 درجة مئوية. بعد الطرد المركزي، وpirate فائقة و resuspend بيليه الخلية مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، ثم الماصات بلطف الخلايا صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقم ملليلتر واحد.
نقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقمة خمسة ملليلتر البوليسترين جولة أسفل مع غطاء مصفاة الخلية عن طريق الأنابيب بلطف من خلال الغطاء، ثم وضع الأنابيب على دائري في النظام. فتح تدفق برنامج تحليل القياسات البولية وإنشاء مجلد تجريبي، ثم انقر فوق زر العينة الجديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة. اسم الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص.
لإنشاء نظام مبعثر الغسور للسكان الخلية CIK، أولاً حدد أنبوب واحد وانقر على زر مؤامرة نقطة لإنشاء مؤامرة FSCA SSCA. رسم بوابة مستطيل فوق مجموعة الخلايا بأكملها مع عتبة FSCA أكبر من 5000 لاستبعاد حطام الخلية. حدد FSCA FSCH المعلمة لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة مضلع حول جميع الخلايا الفردية.
حدد العدد مقابل FITC-الاقتران CD3 والعد مقابل APC-مترافق CD56 المعلمة لمؤامرة المدرج التكراري الجديد. حدد فيتC-مترافق CD3 مقابل APC-مترافق CD56 المعلمة لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة رباعية أربعة لتحديد السكان الفرعية الأربعة. تسجيل البيانات من 20،000 خلية واحدة في كل عينة.
انقر فوق الزر نموذج التحميل لتحليل نموذج عنصر تحكم فارغ أولاً. تعريف مجموعة خلايا CIK بأكملها باستخدام معلمات قناة CD56 و CD3. افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية للعينة الفردية لتحليل مجموعات خلايا CIK وإعادة طباعتها في ملفات التحليل.
لأداء فحص السامة للخلايا، CIK تربية ثانية والبشرية المزمنة سرطان الدم النخاعي K562 الخلايا عن طريق إضافة ملليلتر واحد من الخلايا K562 إلى كل بئر في لوحة ستة جيدا في كثافة 5 ملايين خلية لكل ملليلتر، ثم إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية مع أو بدون خلايا CIK إلى لوحة ستة جيدا كما هو مبين في بروتوكول النص. خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا على الأقل ثلاث مرات. ضع الطبق في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
الآن، CIK coculture والخلايا OC-3 المبيض عن طريق إضافة ملليلتر واحد من المتوسطة القاعدية مع أو بدون خلايا CIK إلى لوحة ستة جيدا كما هو مبين في بروتوكول النص. خلط تعليق الخلية عن طريق الأنابيب بلطف صعودا وهبوطا على الأقل ثلاث مرات. ضع اللوحة في الحاضنة لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة، وحصاد CIK K562 تعليق الخلية مباشرة في أنبوب معقم 15 ملليلتر. لحصاد كل من خلايا التعليق والالتزام من مجموعات CIK OC-3، قم أولاً بنقل تعليق الخلية إلى أنبوب معقم 15 ملليلتر. غسل البئر مع ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيمة، وجمع برنامج تلفزيوني، وإضافته إلى الأنبوب، ثم إضافة 5 ملليلتر من محلول انزيم تفكك الخلايا واحتضان لمدة خمس دقائق في 37 درجة مئوية.
إضافة ملليلتر واحد من المحلل من نفس الأنبوب إلى البئر المقابلة، وخلط بلطف الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقمة ملليلتر واحد. جمع كل الخلايا في نفس الأنبوب. جهاز طرد مركزي في 300 مرة G لمدة 10 دقائق.
استلهمت من فوق ونعيد الخلايا في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني عقيم. بيليه الخلايا في 300 مرة G لمدة 10 دقائق، ثم الpireate فائقة و resuspend الخلايا في 100 ميكرولترات من برنامج تلفزيوني عقيمة. إضافة خمسة microliters من صبغة 7-AAD إلى تعليق الخلية.
خلط بلطف الخلايا عن طريق الأنابيب صعودا وهبوطا ثلاث مرات على الأقل مع ماص معقمة ملليلتر واحد. احتضان لمدة 10 دقائق وترك في الظلام قبل التحليل. لإجراء فحص القدرة الخلوية ، اخلط تعليق الخلية وكرر التحضير لعملية استئصال الخلايا المتدفقة.
انقر فوق زر العينة الجديدة لإضافة عينة وأنبوب إلى التجربة. اسم الأنابيب كما هو موضح في بروتوكول النص. لإنشاء نظام مبعثر جسور للمكاصيرية، أولاً حدد أنبوب واحد وانقر على زر مؤامرة نقطة لإنشاء مؤامرة FSCA SSCA.
رسم بوابة مستطيل على جميع الأحداث مع عتبة FSCA أكبر من 50،000 لاستبعاد حطام الخلية. حدد المعلمة CFSE SSCA لمؤامرة نقطة جديدة، ثم حدد المعلمة CFSE 7-AAD لمؤامرة نقطة جديدة ورسم بوابة رباعية أربعة لتحديد الـ 4 الـ 1000. انقر فوق الزر نموذج التحميل لتحليل نموذج عنصر تحكم فارغ أولاً.
ضبط الجهد من SSCA و FSCA. تحديد عدد الخلايا الميتة باستخدام معلمات قناة CFSE و 7-AAD. تسجيل البيانات من أكبر من 20،000 الخلايا الإيجابية CFSE في كل عينة.
افتح الملفات التي تحتوي على القيم الإحصائية لكل عينة على حدة لتحليل مجموعات الخلايا غير القابلة للحياة، ثم تصدير البيانات إلى ملفات التحليل. تظهر النتائج التمثيلية لاستراتيجية البوابات لتحليل السكان الفرعيين للخلايا T-الإيجابية CD-3 إيجابية CD56 من المتبرعين الأصحاء مع التحليل الإحصائي لنسبة CIK من ثلاثة أفراد. زادت نسبة الخلايا الإيجابية CD56 إيجابية CD-3 بشكل ملحوظ بعد 14 يوما من التوسع.
وهذا واضح من خلال 65٪ لBBMC الأصلي الذي زاد إلى 27.4٪ للخلايا CIK التي تم حصادها في اليوم 14. في هذا النظام الثقافي، أسفرت خلايا CIK عن حوالي نصف مائة مرة من التغييرات مقارنة مع العدد الأصلي من PBMCs. كانت تلطخت خلايا K562 مع CFSE صبغة غير فلورية، والتي هي مشقوق من قبل استراس داخل الخلايا داخل الخلايا القابلة للحياة ويصبح صبغة فلورية عالية.
يتم توضيح حجم و حبيبي الخلايا الإيجابية CIK و CFSE. وقد تم علاج خلايا K562 الملطخة بـ CFSE مع خلايا CIK بنسبة صفر إلى واحد وخمسة إلى واحد و10 إلى واحد. كانت هذه الخلايا ملطخة بصبغة 7 AAD كمسبار قابل للتطبيق لاستبعاد الخلايا الميتة.
تم تقييم الخلايا الإيجابية 7-AAD من خلايا CSE إيجابية K562. وقد تم علاج خلايا OC-3 الملطخة بـ CFSE مع خلايا CIK بنسبة 10 إلى واحد. يظهر السمية الخلوية الواضحة لـ CIK ضد خلايا OC-3 هنا بعد 24 ساعة من الحضانة.
وقد أفيد CIK الخلايا التائية لممارسة آثار السامة للخلايا كبيرة ضد الخلايا السرطانية والحد من الآثار السلبية للجراحة, الإشعاع, والعلاج الكيميائي في علاجات السرطان. العلاج المناعي هو علاج واعد لعدد من أنواع السرطان. يمكن توسيع CIK بكفاءة في المختبر عن طريق احتضان PMBCs المشتقة من المريض في حالة GMP الصف لمزيد من التسريب الذاتي.
بعد هذا البروتوكول، يمكننا تنفيذ العلاج الخلوي المناعي في منشأة من طراز GTP أو GMP لمزيد من العلاج السريري للسرطان.
