Описанный здесь протокол измеряет эффероцитоз макрофага легких после воздействия критерия озона загрязнителя воздуха. Эти данные свидетельствуют о том, что воздействие озона уменьшает альвеолярный макрофаг эффероцитоз и, таким образом, может быть механизмом, почему повышенные уровни озона увеличивают заболеваемость болезнями легких. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет in vivo оценки альвеолярного макрофага эффероцитоз без каких-либо манипуляций ex vivo макрофагов, которые могут изменить их фенотип или функции.
Этот метод выявил новый механизм, с помощью которого легкие не могут восстановить себя после воздействия загрязнения воздуха. Кроме того, этот метод может выявить новые пути к целям, которые изменяют эффероцитоз в легких. Этот метод может быть применен к любой модели травмы легких или воспаления.
Тем не менее, пользователю нужно будет оптимизировать, когда лучше всего оценить эффероцитоз после травмы легких. Выполнение аспирации ороглотки может быть технически сложной задачей. Я бы посоветовал работать с вашим ветеринарным персоналом, чтобы убедиться, что вы оптимизировали свою технику для выполнения этой процедуры.
Начните с культивирования Т-клеток Юрката в среде базально-клеточной культуры, дополненной в соответствии с рукописными указаниями при 37 градусах Цельсия и 5%углекислом газе. Jurkat T клетки подвески клеточной линии, которые могут быть сохранены путем пропуска в предварительно разогретых культивирования средств массовой информации каждые три дня. Подготовка апоптотических клеток, выращивая их до 90% слияния, которое занимает от трех до четырех дней после прохода.
Выращивайте клетки в пяти колбы T75, чтобы получить достаточное количество ячеек для этого протокола. Как только клетки будут готовы, аспирировать содержимое колбы около 24 миллилитров и передать их в 50 миллилитров конической трубки. Подсчитайте клетки с помощью Trypan Blue окрашивания и гемоцитометра.
Пеллет клетки центрифугации в 271 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта. Затем, повторного перерасхода клеток в средствах массовой информации, чтобы получить три миллиона клеток на миллилитр. Aliquot клетки в 100 на 20 миллиметров ткани культуры блюда путем передачи пяти миллилитров клеток на блюдо.
Приготовьте около девяти культурных блюд. Установите одно блюдо в сторону в качестве неэкспонированного контроля и подвергать остальные блюда УФ. Установите УФ-кросслинкер на правильный уровень энергии, нажав кнопку энергии и введя 600 с номером колодки. Облучение всех блюд с клетками, за исключением контроля убедившись, чтобы удалить верхнюю крышку ткани культуры блюдо во время УФ-облучения.
Затем инкубировать все блюда в инкубаторе клеточной культуры при 37 градусах по Цельсию и 5%углекислом газе в течение четырех часов. После инкубации объединить все облученые клетки в 50 миллилитровую коническую трубку и гранулировать их центрифугой в 271 раз г в течение пяти минут. Откажитесь от супернатанта и повторно посовелите клетки в 24 миллилитров стерильных PBS.
Центрифуга трубки снова и удалить супернатант. Подготовьте клетки для досирования мышей путем повторного перерасхода их в PBS в соответствующей концентрации. После того, как мышь правильно анестезируется, поместите его в полу-лежачий положение на спине.
Используйте хирургическую строку, связанную между колышками на наклонной акриловой доске листа, чтобы приостановить мышь челюстно-максиллярными резцами. Используйте пару тупых не-риджевых типсов, чтобы слегка захватить и вытащить язык мыши и привить апоптотические клетки в полость рта с P200 пипеткой. Дозирование успешно, когда мыши делают треск шума от одной до двух секунд после получения дозы.
С пальцем в перчатках, осторожно покрыть нос мыши, пока он не вдыхает в то время как язык убирается. Держите нос покрыты до тех пор, пока жидкость не видна в полости рта и мышь приняла два или более вдохов. Удалите мышь с доски для прививки и верните ее в клетку, чтобы она можно было оправиться от анестезии, убедившись, что поместите мышь на спину, чтобы предотвратить мусор от блокирования nares.
После того, как все мыши проснулись от анестезии, подождите 90 минут, чтобы альвеолярные макрофаги поглотили приток апоптотических клеток. Для сбора жидкости для лаважа подготовьтесь к усыпанной мыши в соответствии с рукописными указаниями. Медленно нажмите PBS в легкие, позволяя им надувать, а затем вытащить тот же объем обратно убедившись, что PBS не выходит из ноздрей.
Соберите объединились лаваж с каждой мыши в 15 миллилитров трубки. Центрифуга бронхоалвеолярного лаважа или BAL в 610 раз g в течение шести минут при четырех градусах Цельсия, собирать супернатант в 1,5 миллилитровую трубку, и заморозить его при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Гранулы представляют клетки из бронхоальвеолярного пространства.
Добавьте один миллилитр буфера лиза красных кровяных телец ACK к грануле, чтобы удалить остаточные красные кровяные тельца. Vortex и лиза в течение одной минуты на льду, а затем добавить четыре миллилитров PBS, чтобы остановить реакцию лиза. Центрифуга клеток в 610 раз g в течение шести минут при четырех градусах Цельсия и аспирировать супернатант с вакуумным аспиратором.
Затем, повторного перерасхода клеток в один миллилитр PBS с 10%FBS и рассчитывать клетки на гемоцитометре без Trypan Blue. Центрифуга 120 микролитров каждого образца на слайдах в 12 раз г в течение трех минут с использованием среднего ускорения и цитоцентрифуга. Оставьте горки высохнуть на ночь.
На следующий день, пятно слайды с гематоксилином и эозином для того, чтобы вычислить как эффероцитные и дифференциальные счета клеток. Затем просмотрите слайды под установкой Brightfield на биологическом микроскопе с помощью цели 20X или 40X. Рассчитайте эффероцитатический индекс на основе соотношения альвеолярных макрофагов, которые фагоцитозные апоптотические Т-клетки Jurkat к альвеолярным макрофагам без поглощения апоптотических клеток убедившись, что рассчитывать по крайней мере 200 клеток с каждого слайда.
Этот протокол был использован для исследования влияния воздействия озона на воспаление легких. Озон подвергается мышей отображается увеличение макрофагов и нейтрофилов в воздушном пространстве по сравнению с фильтрованной группы управления воздухом и увеличение белка BAL, маркер альвеолярной эпителиальной дисфункции. До досирования мышей, апоптоз в клетках Jurkat T был подтвержден цитометрией потока.
Уровень УФ-облучения в 60 милли-джоуле и четырехчасовое инкубационое время привели к повторяющимся результатам примерно 75%апоптотических клеток. Эффероцитные макрофаги были определены как макрофаги, которые охватили Т-клетку Джурката по сравнению с обычными альвеолярными макрофагами. Произошло значительное снижение эффероцитического индекса группы озоновых воздействий по сравнению с фильтрованным воздушным управлением, что свидетельствует о том, что вызванное озоном воспаление легких связано со снижением клиренса апоптотических клеток.
Внимание к деталям и запись любых наблюдаемых различий имеет решающее значение во время этой процедуры. Также рекомендуется ослепить образцы для анализа и иметь двух разных людей рассчитывать макрофаги. После изоляции, BAL клетки могут быть использованы для анализа мРНК, окрашенных для дополнительных маркеров иммунофторесценции, и / или запустить на поток цитометра различать фенотипические изменения.
