Это может помочь ответить на ключевые вопросы о том, как синтезировать молекулы DCAF с целевой нейтрализации антител. Этот метод обеспечивает самый простой способ синтеза молекул DCAF с высокой производительностью. Мир решает, что молекулы DCAF имеют потенциальное вмешательство в антитела в таких заболеваниях, как лихорадка Денге и миастения.
Этот метод может быть применен к другим молекулам DCAF с различными эпитопами для целевой cognate антител. Демонстрация процедуры будет Сюэ Бай, старший техник из моей лаборатории. Для преобразования 2-хлорной смолы в гидразин, полученную из 2-хлорной смолы, из верхней части сосуда пептидного синтеза добавьте пять миллилитров DMF в 0,25 миллимоле 2-хлорной смолы.
Положите крышку обратно, осторожно встряхните сосуд в течение 15 секунд, а затем слейте его на железный стенд. Повторите DMF стирки еще два раза. Затем добавьте в сосуд пять миллилитров DCM, налейте крышку обратно, аккуратно встряхните сосуд в течение 15 секунд, а затем слейте его на железный стенд.
Повторите dcM стирки еще два раза, а затем повторить DMF мыть еще три раза. Далее добавьте шесть миллилитров 50%-томной концентрации DMF над DCM, чтобы набухать смолы в течение 30 минут, а затем процедить его. Теперь перенесите шесть миллилитров 5%-томной концентрации гидразина и DMF в реакционной сосуд.
Поместите его на шейкер при 120 об/мин и 30 градусов по Цельсию в течение 30 минут, а затем слейте раствор вакуумным насосом. Чтобы очистить производную гидразина от пептида Fc-III, используйте систему HPLC для очистки пептида 30-минутным градиентным аллюзионом элюционом со скоростью потока в миллилитр в минуту. После очистки белка в соответствии с рукописью, добавить в новую трубку два миллилитров по одному миллиграмму на миллилитр SUMO помечены белка, один миллилитр SUMO протеазы, один миллилитр 10X SUMO протеазы буфера, и шесть миллилитров двойной дистиллированной воды для подготовки реакции раствора.
Инкубировать смесь в течение 12 до 16 часов при четырех градусах по Цельсию. Затем aliquot смесь в восемь 1,5 миллилитров Eppendorf труб, и центрифуга смеси на 15000 раз G в течение 10 минут при четырех градусах по Цельсию. Используйте пипетки, чтобы отказаться от агрегатов в нижней части, а затем в 10 миллилитр очищены supernatants, добавить 0,5 миллилитров 50%nickel NTA шарик суспензии в 50 миллимолярной PBS.
Поместите трубку на роторный шейкер при 200 об/мин и четыре градуса по Цельсию, чтобы аккуратно перемешать в течение 60 минут. Затем загрузите лизад и смесь никеля NTA в столбец с нижней крышкой розетки. Снимите нижнюю крышку и сохранить поток через в 15 миллилитров центрифуги трубки.
Белок HIS TAG SUMO является обязательным для колонки. Связь антиген часть, которая начинается с СНГ для родной химической реакции перевязки, находится в потоке до конца. Теперь вес 1,8 миллиграмма гидразина производной fc-III пептида в две миллилитровые трубки Eppendorf и добавить 0,8 миллилитров шести молар гуанидин хлорид в 0,2 молира раствора фосфата натрия при рН 3.
Вихрь, чтобы растворить порошок. После центрифугирования трубки в 7, 200 раз G в течение одной минуты при комнатной температуре передачи супернатанта в новую трубку. Добавить перемешать бар в трубке и положить трубку в ванну соляной лед на магнитный мешалка, чтобы нежно агитировать раствор в течение 15 минут.
Затем добавьте 40 микролитров 0,5 нитрита натрия моляра в раствор для окисления группы гидразина. Аккуратно агитировать раствор еще 15 минут в ледяной соляной ванне. Взвешивание в 11 миллиграммов HPLC очищены и заморозить сушеные linker антигенной части, и 13,6 миллиграммов MPAA в реакционной трубке в ледяной соляной ванне.
Перемешать в течение пяти минут, а затем настроить значение рН до 6,8 до 7,0 в комнате умеренной с шестью молярного гидроксида натрия. Наиболее важным шагом для родной химической перевязки является тщательное корректировка значения рН, чтобы инициировать реакцию перевязки. После 12 часов в ледяной соляной ванне, добавить 0,4 миллилитров 0,1 молярного TCEP нейтральный раствор в системе реакции, и перемешать в течение 20 минут, чтобы прекратить реакцию.
После центрифугации и очистки HPLC, получить конъюгировать пик III для десульфуризации. Растворите его в 50 микролитров шести хлорида молярного гуанидиния в растворе 0,2 молярного фосфата натрия. Затем добавьте 50 микролитров одного молярного TCEP, 10 микролитров терт-бутилтиола и пять микролитров 0,1 моларного ВАО на четыре раствора.
Отрегулируйте окончательный рН раствора до 6,9 и держите раствор на уровне 37 градусов по Цельсию на шейкере около пяти часов. Центрифуга и очистить снова. Растворите подготовленный пептид в 200 микролитров 32 миллимолярный ацетат серебра, а затем перемешать реакционной смеси при комнатной температуре в течение четырех часов.
Чтобы преобразовать серебряные тиолаты на пептиде в свободные тиолы, добавьте три микролитера одного молярного DTT в шесть хлорида молярного гуанидиния и 0,2 молярного фосфата на рН 7. Работайте масс-спектрометр в полном режиме сканирования и установите диапазон м/з на уровне от 300 до 2000, а разрешение на 60 000. Откройте данные о массовых спектрах и найдите пики продукта на каждом шагу, чтобы подтвердить успешную реакцию химической реакции.
Для выполнения elISA анализ взаимодействия между DCAF1 и 4G2 антитела, пальто каждый колодец 96-ну микротитр пластины с одним пикомол анти-GST антитела в 100 микролитров покрытия буфера. Печать пластины с уплотнением ленты и инкубировать его при 4 градусах по Цельсию на ночь на шейкере. В утреннем блоке каждая колодец с 200 микролитров 1%BSA и PBS.
Печать пластины и инкубировать его комнате умеренной в течение одного часа на шейкере. Затем используйте PBS с 0,05%Tween 20 мыть каждый хорошо четыре раза. В этом протоколе для полусинтеза молекулы DCAF1 был использован родной метод химической перевязки.
Массовый спектр показывает, что окончательная молекула DCAF1 имеет деконволюционный молекулярный вес 11 053. Во время анализа ELISA пептид антигена Fc-III и DCAF1 конкурентоспособно подавляют связывание антител 4G2. Оба пептида антигена и DCAF1 значительно заблокировали связывание 4G2, в то время как пептид Fc-III не повлиял на взаимодействие антигенных антител.
После этого развития, этот метод проложил путь для вмешательства вредных антител связанных заболеваний. Лот из регионов, используемых для синтеза пептидов и родной химической перевязки являются высокотоксичными. Убедитесь в том, чтобы принять эти эксперименты в вашем химическом капюшоне.
