通过抗原肽和Fc-III三氧化二甲物的双功能结合阻断靶向抗体

这可能有助于回答有关如何合成具有靶向抗体中和的DCAF分子的关键问题。该技术为合成高生产率的DCAF分子提供了最简单的方法。世界认为DCAF分子在治疗登革热和米热病等疾病时对抗体有潜在的干预作用。

该方法可应用于具有不同表位的其他DCAF分子，以靶向同源抗体。演示程序将是薛白，一个高级技术人员从我实验室。要将 2-氯树脂转换为从肽合成容器顶部衍生的 2-氯树脂，在 0.25 毫摩尔 2-氯树脂中加入 5 毫升 DMF。

将盖子放回去，轻轻摇动容器 15 秒钟，然后将盖子排在熨斗架上。再重复两次 DMF 洗涤。然后向容器中加入五毫升 DCM，重新戴上盖子，轻轻摇动容器 15 秒钟，然后将其排在铁支架上。

重复 DCM 洗涤两次，然后重复 DMF 洗涤三次。接下来，在 DCM 上加入 6 毫升 50% 体积浓度为 50% 的 DMF，使树脂膨胀 30 分钟，然后排空。现在，将六毫升5%体积浓度的氢化物和DF转移到反应容器中。

以 120 RPM 和 30 摄氏度的速度在摇床上放置 30 分钟，然后通过真空泵排空溶液。要净化Fc-III肽的氢化物衍生物，请使用HPLC系统以每分钟1毫升的流速，通过30分钟的梯度表示洗脱来净化肽。根据手稿进行蛋白质纯化后，将每毫升SUMO标记蛋白的两毫升两毫升加入新管中，一毫升SUMO蛋白酶，一毫升10XSUMO蛋白酶缓冲液，以及六毫升的双蒸馏水，以准备反应溶液。

在4摄氏度下孵育混合物12至16小时。然后将混合物加入8个1.5毫升Eppendorf管中，在4摄氏度下以15，000倍G离心，10分钟。使用移液器丢弃底部的集料，然后放入 10 毫升清除的超钠中，在 50 毫摩尔 PBS 中加入 50%镍 NTA 珠浆中的 0.5 毫升。

将管子以 200 RPM 和 4 摄氏度的旋转摇床放置，轻轻混合 60 分钟。接下来，将利萨德和镍 NTA 混合物装入带底部出口盖的柱中。取下底盖，将流量保存到 15 毫升离心管中。

HIS TAG SUMO 蛋白与柱上结合。链接器抗原部分，从 CIS 开始进行原生化学结扎反应，在流中。现在重量1.8毫克的氢氨酸衍生物Fc-III肽到两毫升Eppendorf管中，并在pH3的0.2摩尔单钠磷酸盐溶液中加入0.8毫升的六摩尔氯化碳。

漩涡溶解粉末。在室温下将管在7，200次G下离心1分钟后，将上经器转移到新管中。在管中加入搅拌棒，将管子放在磁性搅拌器上的冰盐浴中，轻轻搅拌溶液15分钟。

然后加入40微升0.5摩尔亚硝酸钠溶液，氧化氢氨酸组。在冰盐浴中轻轻搅拌溶液 15 分钟。在11毫克的HPLC纯化和冷冻干链接剂抗原部分，和13.6毫克的MPAA进入冰盐浴的反应管。

搅拌五分钟，然后用六摩尔氢氧化钠在温带室将 pH 值调整为 6.8 至 7.0。原生化学结扎最关键的步骤是仔细调整pH值以启动结扎反应。在冰盐浴中12小时后，向反应系统加入0.4毫升0.1摩尔TCEP中性溶液，搅拌20分钟以终止反应。

离心和HPLC纯化后，获得脱硫的偶联峰III。在 0.2 摩尔钠磷酸盐溶液中溶解在 50 微升的 6 摩尔氯化碳中。然后添加 50 微升的一摩尔 TCEP、10 微升的三丁醇和五个微升的 0.1 摩尔 VAO 用于四个解决方案。

将溶液的最终 pH 调节至 6.9，并在摇床上将溶液保持 37 摄氏度约 5 小时。离心机并再次净化。将准备好的肽溶解在200微升32毫摩尔醋酸银中，然后在室温下搅拌反应混合物4小时。

要将肽上的硫化银转化为自由硫醇，在六摩尔氯二氧化二甲中加入三个摩尔DTT微升，在pH 7中加入0.2摩尔钠磷酸盐。在全扫描模式下操作质谱仪，将 m/z 范围设置为 300 到 2，000，分辨率设置为 60，000。打开质谱数据，并在每个步骤中查找产品的峰值，以确认化学反应已成功执行。

要对DCAF1和4G2抗体之间的相互作用进行ELISA测定，在100微升涂层缓冲液中，用一个抗GST抗体将每孔96孔的微蒂特板涂覆。用密封胶带密封板，并在摇床上孵育4摄氏度。在早上块每个井与200微升1%BSA和PBS。

密封盘子，在摇床上温带孵育一小时。然后使用 PBS 与 0.05%Tween 20 洗每个井四次。在此协议中，将原生化学结扎法用于DCAF1分子的半合成。

质量谱显示最终的DCAF1分子具有11，053的去卷分子重量。在ELISA测定中，抗原肽Fc-III和DCAF1具有竞争性地抑制4G2抗体结合。抗原肽和DCAF1显著阻断4G2结合，而Fc-III肽不影响抗原抗体相互作用。

经过这一开发，这项技术为介入有害抗体相关疾病铺平了道路。用于肽合成和原生化学结扎的区域的地段具有剧毒性。请务必在化学罩中进行这些实验。