Растущий интерес к изучению крупных, многоклеточных структур привел к разработке этого метода оптической очистки, который позволяет трехмерной визуализации и количественной оценки крупных структур в прозрачных органах. Этот протокол обеспечивает простой, дешевый, простой в настройке и всеобъемлющий инструмент для исследования тканей в трех измерениях. Многослойная природа болезни не всегда может быть смоделирована традиционными двумерными методами.
Трехмерный анализ тканей может помочь лучше диагностировать и контролировать заболевания. Этот метод не ограничивается почечной тканью и может быть применен к любой нормальной и больной ткани. Этот простой протокол легко следовать для любого ученого с некоторым опытом в обращении с животными.
Важно проверить различные антитела в случае плохой маркировки антител, и проводить вторичные антитела только контроль. Начните с подготовки гепарина, содержащего PBS и 3,0%paraformaldehyde в 1X PBS в соответствии с рукописными указаниями и передачи растворов в отдельные пластиковые шприцы 50 мл. Параформальдегид токсичен и должен быть подготовлен в дымовом капоте.
Сбор и обильное использование почек в соответствии с рукописными указаниями. Затем удалите капсулу и разрежьте почку на один мм толщиной корональных ломтиков. Погрузите ломтики почек с подготовленным раствором параформальдегида в коническую трубку 15 мл.
После фиксации, мыть ломтик почки дважды с 1X мыть буфер в течение одного часа на горизонтальной рокер, а затем приступить к поиску антигена. Нагрейте 300 мл антигенного раствора 1X в стакане 500 мл. Затем завяйте кусочек почки в встраиваемую кассету, проницаемую для нагретого буфера, и перемешайте его в течение одного часа при 92-98 градусах Цельсия.
Важно сохранить температуру стабильной между 92 и 98 градусов по Цельсию для этого антигена поиска шаг. Затем перенесите ломтик в 10 мл буфера для мытья 1X с 0,1%Triton X-100 и качай его на ночь. На следующий день, мыть ломтик дважды с 10 мл свежего буфера 1X мыть в течение одного часа.
Разбавить первичное антитело в 500 микролитров нормального разбавления антител. Аккуратно раскачивайте ломтик почки в разбавленном первичном антителе в течение четырех дней при 37 градусах Цельсия. После инкубации, мыть ломтик почки в 10 мл буфера 1X мыть на ночь при комнатной температуре, изменяя буфер один раз после восьми часов.
Разбавить вторичные антитела в 500 микролитров нормального разбавления антител и инкубировать с ломтиком почки в течение четырех дней при 37 градусов по Цельсию. Обратите внимание, что от этого шага вперед, ломтик почки должен быть защищен от света. После инкубации со вторичными антителами, мыть ломтик почки в 10 мл 1X мыть буфер на ночь при комнатной температуре.
Чтобы обезвоживать ломтик почки, перенесите его на пять мл высококачественного этанола и качай его в течение двух часов при комнатной температуре, освежая этанол через час. Погрузите ломтик почки в два мл этилового циннамата и осторожно рок на ночь. Когда вы будете готовы к изображению ткани, добавьте от 600 до 1000 микролитров этилового циннамата в стеклянную нижнюю тарелку и перенесите ломтик почки в блюдо.
Поместите круглую крышку скольжения на ломтик почки и запечатать блюдо с парафиновой пленкой. Поместите блюдо на платформу для визуализации микроскопа и изображение ткани в соответствии с рукописными указаниями. Этот протокол был использован для успешного выполнения 3D-анализа тканей почек и оценки клеточных функций и взаимодействий.
Метод может вызвать флуоресцентные репортер утоления, но и другие сильные флуоресцентные белки могут противостоять сигналу закалки. Абдоминальный аортальный изобилие может улучшить диффузию антител. В некоторых случаях плохое проникновение антител приводит к поверхностному сигналу.
Это может быть исправлено с более высокими концентрациями или пополнением антител. Внутрисосудистые роды следует учитывать, если антиген интереса выражается в сосуды почек. Однако антитела, нацеленные на белки в апиальной мембране тубулы эпителиальных клеток, не пересекают гломерулярный фильтрациорный барьер и не вызывают неспецифических сигналов.
Ткань может быть помечена антителами для обнаружения конкретной популяции клеток или визуализации целых сегментов труб. Кроме того, колокализация белков в 3D может быть достигнута путем объединения нескольких антител. Важно помнить, что маркировка антител может быть улучшена с хорошим изобилием почек, использованием антигенного шага поиска и высокой концентрацией антител.
Некоторые сильные белки репортера могут сопротивляться закалке флуоресцентного сигнала после этого протокола. Чтобы проверить это, пропустите антиген поиска и антитела маркировки шаги. Этот метод уважает трехмерный характер структур и открывает много новых областей для исследований.
Он устраняет необходимые предположения и помехи, связанные с традиционным двумерным анализом.
