התעניינות גוברת בלימוד מבנים רב-תאיים גדולים הובילה לפיתוח טכניקת סליקה אופטית זו, המאפשרת הדמיה תלת מימדית וכמות של מבנים גדולים בתוך איברים שקופים. פרוטוקול זה מספק כלי פשוט, זול, קל להקמה ומקיף לחקור רקמות בשלושה ממדים. טבע רב שכבתי של מחלה לא תמיד יכול להיות מדומה על ידי טכניקות דו מימדיות מסורתיות.
ניתוח תלת מימדי של רקמות יכול לעזור לאבחן ולנטר טוב יותר מחלות. שיטה זו אינה מוגבלת רקמת הכליה והוא יכול להיות מיושם על כל רקמה נורמלית וחולה. פרוטוקול פשוט זה קל לעקוב אחר כל מדען עם ניסיון בטיפול בבעלי חיים.
חשוב לבדוק נוגדנים שונים במקרה של תיוג נוגדנים לקוי, ולבצע בקרות נוגדנים משניות בלבד. התחל על ידי הכנת הפרין המכיל PBS ו 3.0% paraformaldehyde ב 1X PBS על פי הוראות כתב היד והעברת הפתרונות מזרקי פלסטיק נפרדים 50 מ"ל. Paraformaldehyde הוא רעיל צריך להיות מוכן ברדס אדים.
לאסוף ולכבד את הכליה על פי הוראות כתב היד. לאחר מכן, להסיר את הקפסולה לחתוך את הכליה לפרוסות קורונטל בעובי מ"מ אחד. לטבול את פרוסות הכליה עם פתרון paraformaldehyde מוכן בצינור חרוט 15 מ"ל.
לאחר קיבעון, לשטוף את פרוסת הכליה פעמיים עם חיץ לשטוף 1X במשך שעה אחת על נדנדה אופקית ולאחר מכן להמשיך עם אחזור אנטיגן. מחממים 300 מ"ל של פתרון חשיפה אנטיגן 1X ב מקור 500 מ"ל. לאחר מכן, לתקף פרוסת כליה בקלטת הטבעה חדירה חיץ מחומם ומערבבים אותו במשך שעה אחת ב 92 עד 98 מעלות צלזיוס.
חשוב לשמור על הטמפרטורה יציבה בין 92 ל 98 מעלות צלזיוס עבור שלב אחזור אנטיגן זה. לאחר מכן מעבירים את הפרוסה ל-10 מ"ל של חיץ כביסה 1X עם 0.1% טריטון X-100 ומטלטלים אותה בן לילה. למחרת, לשטוף את הפרוסה פעמיים עם 10 מ"ל של חיץ לשטוף 1X טרי במשך שעה אחת.
לדלל את הנוגדן העיקרי ב 500 microliters של דילול נוגדנים נורמלי. מטלטלים בעדינות את פרוסת הכליה בנוגדן ראשוני מדולל במשך ארבעה ימים ב-37 מעלות צלזיוס. לאחר הדגירה, לשטוף את פרוסת הכליה ב 10 מ"ל של חיץ לשטוף 1X לילה בטמפרטורת החדר, שינוי החיץ פעם אחת אחרי שמונה שעות.
מדללים את הנוגדנים המשניים ב-500 מיקרוליטרים של דלואנט נוגדנים רגיל ומדגרים בפרוסת הכליה במשך ארבעה ימים ב-37 מעלות צלזיוס. שים לב כי מצעד זה ואילך, יש להגן על פרוסת הכליה מפני אור. לאחר הדגירה עם נוגדנים משניים, לשטוף את פרוסת הכליה ב 10 מ"ל של חיץ לשטוף 1X לילה בטמפרטורת החדר.
כדי לייבש את פרוסת הכליה, להעביר אותו לחמישה מ"ל של אתנול בדרגה גבוהה 100% ולנענע אותו במשך שעתיים בטמפרטורת החדר, מרענן את האתנול לאחר שעה. לטבול את פרוסת הכליה בשני mL של אתיל cinnamate ורוק בעדינות לילה. כאשר מוכנים לדמיין את הרקמה, מוסיפים 600 עד 1000 מיקרוליטרים של אתיל סינמט לתוך צלחת תחתית זכוכית ומעבירים את פרוסת הכליה לתוך המנה.
מניחים תלוש כיסוי עגול על פרוסת הכליה ואוטמים את המנה עם סרט פרפין. מניחים את המנה על פלטפורמת הדמיית המיקרוסקופ ומדמיין את הרקמה בהתאם לכיווני כתב היד. פרוטוקול זה שימש כדי לבצע בהצלחה ניתוח 3D על רקמת הכליה ולהעריך תפקודי תאים ואינטראקציות.
השיטה עלולה לגרום לכתב פלואורסצנטי מרווה, אך חלבונים פלואורסצנטיים חזקים אחרים עשויים להתנגד לתיווס אותות. שפע של כאבי בטן יכול לשפר את דיפוזיה נוגדנים. במקרים מסוימים, חדירת נוגדנים לקויה גורמת לאות שטחי.
זה יכול להיות מתוקן עם ריכוזים גבוהים יותר או חידוש של נוגדנים. משלוח תוך וסקולרי צריך להילקח בחשבון אם אנטיגן של עניין מתבטא כלי דם בכליות. עם זאת, נוגדנים המכוונים לחלבונים בממברנה האפילית של תאי אפיתל צינוריים אינם חוצים את מחסום הסינון גלומרולרי וגורם לאותות לא ספציפיים.
הרקמה יכולה להיות מסומנת בנוגדנים כדי לזהות אוכלוסיית תאים ספציפית או לדמיין מקטעי צינור שלמים. יתר על כן, קולוקליזציה של חלבונים תלת מימד יכול להיות מושגת על ידי שילוב של נוגדנים מרובים. חשוב לזכור כי ניתן לשפר את תיוג הנוגדנים עם שפע כליות טוב, שימוש בשלב אחזור אנטיגן וריכוז נוגדנים גבוה.
כמה חלבונים כתב חזק עשוי להתנגד מרווה של אות פלואורסצנטי בעקבות פרוטוקול זה. כדי לבדוק זאת, דלג על שלבי אחזור האנטיגן ותיוג הנוגדנים. טכניקה זו מכבדת את האופי התלת מימדי של מבנים ופותחת תחומים חדשים רבים למחקר.
היא מבטלת הנחות והפרעות נדרשות הקשורות לניתוח דו-ממדי מסורתי.
