Это простое лечение, которое может быть применено к любой линии стволовых клеток или дифференциации протокола премьер-клеток для дифференциации. Все, что нужно сделать, это добавить DMSO на 1-2% в среде обслуживания культуры клеток. Основным преимуществом этой техники является то, что она позволяет значительно увеличить потенциал дифференциации плюрипотентных стволовых клеток в любую линию выбора путем грунтовки клеток для дифференциации.
Лечение DMSO увеличивает вероятность того, что клетки будут отличаться от производных от пациента iPSCs, что позволяет использовать их для заместительной терапии клеток, моделирования заболеваний и скрининга лекарств. Это может привести к раннему началу регулирования, которое контролирует субпролиферацию, дифференциацию и спецификацию во время эмбрионального развития. Мы показали, что лечение DMSO улучшает дифференциацию почти в 50 эмбриональных и индуцированных плюрипотентных линиях стволовых клеток.
В то время как другие лаборатории показали, что это полезно для стволовых клеток других видов, таких как мышь и примат. За день до начала дифференциации добавьте DMSO с концентрацией 1 или 2% в течение 24 часов в типичную среду обслуживания. Через 24 часа после лечения DMSO, заменить средний и приступить к обычной дифференциации протокола.
Выращиваем клетки в соответствии с рукописными указаниями. Когда клетки достигают соответствующего слияния, отмежеваться от них и подготовить одну подвеску клетки. Подсчитайте живые клетки с гемоцитометром или автоматическим счетчиком ячейки, используя маркер жизнеспособности, такой как trypan blue.
Для того, чтобы достичь 80-90% слияния в течение 24-часового предварительного лечения DMSO, пластины клеток на покрытием шесть хорошо пластины при плотности от 500000 до 1 миллиона клеток на колодец. Инкубировать клетки в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода. Затем, аспирировать средства массовой информации и заменить его на 1-2%DMSO решение.
Разрешить клетки инкубировать в течение 24-28 часов до дифференциации. При инкубации в течение 48 часов замените средства массовой информации через 24 часа свежим раствором DMSO. Для достижения дифференциации 3D культуры, расти и собирать клетки в клеточной подвески.
Подсчитайте живые клетки и пластины их в неокрашенных, с низким уровнем крепления шесть хорошо пластины в стволовых клетках средств массовой информации с ингибитором ROCK. Как правило, 3D человеческие плюрипотентные сферы стволовых клеток образуются в течение 24 часов. Разрешить клеткам инкубировать в течение 24 часов при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода.
Подготовка 1-2%DMSO в предварительно разогретых стволовых клеток средств массовой информации в соответствии с рукописными направлениями. Чтобы заменить средства массовой информации после инкубации, наклоните пластину под углом от 30 до 45 градусов и позвольте клеточным сферам осесть в нижней части хорошо. Аспирировать средства массовой информации из ячеек и аккуратно повторно приостановить их в решении DMSO.
Разрешить клетки инкубировать в течение 24-48 часов при 37 градусов по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода. Предварительное лечение клеток с DMSO, как описано для 2D культур, и подготовить noggin и SB431542 фондовых решений. Подготовка достаточно 10%knockout замены сыворотки, или KOSR, в нокаут DMEM в течение трех-четырех дней изменения средств массовой информации.
Подготовьте эктодермальные средства дифференциации, добавив noggin и SB431542 к предварительно разогретому нокауту KOSR DMEM, как описано в рукописи. После предварительной обработки DMSO, аспирировать средства массовой информации из клеток и добавить два миллилитров дифференциации средств массовой информации для каждого хорошо. Разрешить клеткам инкубировать в течение трех-четырех дней при 37 градусах по Цельсию в инкубаторе двуокиси углерода, заменяя средства массовой информации ежедневно свежими факторами дифференциации.
Предварительное лечение DMSO приводит к переходному и зависящему от дозы снижению темпов роста клеток по сравнению с необработаваемыми клетками. Это снижение пролиферации связано с увеличением контакта между клетками, который особенно выражен в 2%DMSO обработанных клеток. Когда клетки фиксируются и окрашиваются для прототипных маркеров каждого зародышевых слоя, видно, что 2%DMSO до лечения приводит к увеличению доли дифференцированных клеток зародышевых пластов.
Например, SOX17 был окрашен для визуализации эндодермальных клеток. Для того, чтобы исследовать влияние DMSO на дифференциацию к типам клеток-предшественников центральной нервной системы, индуцированные человеком плюрипотентные стволовые клетки могут быть дифференцированы либо в нейронные клетки-предшественники, либо в клетки-предшественники олигодендроцитов. По сравнению с контрольными клетками, 2%DMSO предварительное лечение увеличивает экспрессию нейронных маркеров клеток-предшественников Pax6.
Аналогичным образом, предварительное лечение увеличивает долю клеток, выражаюющих олигодендроцитов прародителя клеточный маркер Olig2. Кроме того, первоначальное лечение DMSO улучшает функцию клеток стволовых клеток человека, полученных после трансплантации in-vivo. Когда дифференцированные клетки-предшественники поджелудочной железы пересажены в иммунодефицитных мышей, их функциональность может быть проверена в ответ на вызов глюкозы или стимуляции KCl.
Улучшения в функциональности клеток очевидны от двух недель до 16 недель после трансплантации. Наиболее важным фактором, чтобы принять во внимание это езда на велосипеде или удвоение времени ваших стволовых клеток. Продолжительность лечения DMSO должна быть такой же, как время езды на велосипеде клеток.
После первоначального лечения DMSO, можно понять, как пролиферацию клеток и клеточный цикл регулируются в стволовых клетках, так как лечение способствует росту ареста в фазе G1 клеточного цикла. Дифференцированные клетки могут быть использованы для понимания связанных с болезнями механизмов, для совместного культивирования с другими типами клеток, в анализах опухолевой геногенности, а также в функциональных анализах или трансплантации исследований, чтобы определить, если дифференцированные клетки могут спасти фенотип болезни.
