분화를 위해 주요 세포에 대한 모든 줄기 세포주 또는 분화 프로토콜에 적용될 수 있는 간단한 치료법이다. 모든 것은 세포 배양 유지 배지에 1-2%에서 DMSO를 추가하는 것입니다. 이 기술의 주요 장점은 분화를 위해 세포를 프라이밍하여 선택되는 모든 계보로 다능성 줄기 세포의 분화 잠재력을 크게 증가시킬 수 있다는 것입니다.
DMSO 치료는 세포가 세포 대체 요법, 질병 모델링 및 약물 스크리닝에 사용될 수 있도록 환자 유래 iPSC와 분화할 가능성을 증가시킵니다. 배아 발달 중 하위 증식, 분화 및 사양을 제어하는 규제의 초기 발병을 야기할 수 있습니다. 우리는 DMSO 처리가 거의 50명의 인간 적인 배아 및 유도된 다능성 줄기 세포주에서 분화를 향상시킨다는 것을 보여주었습니다.
그밖 실험실은 마우스와 영장류와 같은 그밖 종의 줄기 세포에 유익하다는 것을 보여주었습니다 동안. 차별화가 시작되기 하루 전, 일반적인 유지 보수 매체에 24시간 동안 1~2%의 농도로 DMSO를 추가합니다. DMSO 치료 후 24시간 후, 매체를 교체하고 일반적인 분화 프로토콜을 진행합니다.
원고 의 지시에 따라 세포를 성장. 세포가 적절한 연결성에 도달하면 이를 분리하고 단일 세포 현탁액을 준비합니다. 트라이팬 블루와 같은 생존 가능성 마커를 사용하여 혈전계 또는 자동 셀 카운터로 라이브 셀을 계산합니다.
24시간 DMSO 전처리 내에서 80-90%의 인플루언서를 달성하기 위해, 잘 100만 개의 세포의 밀도로 코팅된 6웰 플레이트에 세포를 플레이트한다. 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 세포를 배양합니다. 그런 다음 미디어를 흡인하고 1-2% DMSO 솔루션으로 대체합니다.
세포가 분화 하기 전에 24-28 시간 동안 배양 할 수 있도록합니다. 48시간 동안 인큐베이팅하는 경우 24시간 후에 미디어를 신선한 DMSO 솔루션으로 교체하십시오. 3D 배양 분화를 달성하기 위해 세포 현탁액에서 세포를 성장시키고 수집합니다.
살아있는 세포를 계산하고 ROCK 억제제가있는 줄기 세포 매체에서 코팅되지 않은 저부착 6 웰 플레이트에 접시를 놓습니다. 전형적으로, 3D 인간 만능 줄기 세포 구체는 24 시간 안에 형성될 것입니다. 세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 24시간 동안 배양하도록 허용합니다.
원고 방향에 따라 미리 따뜻워진 줄기 세포 매체에서 1-2%DMSO를 준비합니다. 인큐베이션 후 미디어를 교체하려면 플레이트를 30도에서 45도 각도로 기울여 세포 구가 우물 바닥에 정착할 수 있도록 합니다. 세포에서 미디어를 흡인하고 DMSO 용액에서 부드럽게 다시 일시 중단합니다.
이산화탄소 인큐베이터에서 세포가 섭씨 37도에서 24-48시간 동안 배양하도록 허용합니다. 2D 배양에 대해 설명된 바와 같이 DMSO로 세포를 사전 처리하고, 노긴 및 SB431542 스톡 솔루션을 준비한다. 미디어 변경 3~4일 동안 DMEM에서 충분한 10%의 녹아웃 세럼 교체 또는 KOSR을 준비합니다.
원고에 설명된 바와 같이 사전 따뜻하게 된 KOSR 녹아웃 DMEM에 노긴및 SB431542를 추가하여 자궁 분화 매체를 준비한다. DMSO 전처리 후, 세포에서 미디어를 흡인하고 각 웰에 분화 매체의 2 밀리리터를 추가합니다. 세포가 이산화탄소 인큐베이터에서 섭씨 37도에서 3~4일 동안 배양하여 매일 미디어를 신선한 분화 요인으로 대체하도록 허용합니다.
DMSO 전처리는 비처리된 세포에 비해 세포 성장속도에서 일시적이고 용량 의존적인 감소를 초래한다. 이 감소 증식은 세포 대 세포 접촉의 증가와 연관됩니다, 이는 2% DMSO 처리된 세포에서 특히 발음됩니다. 세포가 각 세균층의 발대마커에 대해 고정및 염색될 때, 2%DMSO 전처리가 분화 배아층 세포의 증가된 비율로 초래된다는 것을 알 수 있다.
예를 들어, SOX17은 엔도름 세포를 시각화하기 위해 염색되었다. 중추 신경계 전구 세포 유형으로의 분화에 대한 DMSO의 효과를 조사하기 위해 인간 유발 만능 줄기 세포는 신경 전구 세포 또는 올리고드렌드로키테 전구 세포로 분화될 수 있다. 대조군 세포에 비해, 2%DMSO 전처리는 신경 전구 세포 마커 Pax6의 발현을 증가시킨다.
유사하게, 전처리는 올리고드렌드로시테 전구 세포 마커 Olig2를 발현하는 세포의 비율을 증가시킨다. 더욱이, 초기 DMSO 치료는 생체 내 이식에 이어 인간 배아 줄기 세포 유래 세포 기능을 향상시킨다. 분화된 췌장 전구 세포가 면역 결핍 마우스로 이식될 때, 그들의 기능은 포도당 도전 또는 KCl 자극에 응하여 시험될 수 있습니다.
세포 기능에 있는 개선은 2 주에서 16 주 이식 후 분명합니다. 고려해야 할 가장 중요한 고려 사항은 줄기 세포의 사이클링 또는 두 배로 증가하는 시간입니다. DMSO 치료의 길이는 세포의 사이클링 시간과 동일해야합니다.
초기 DMSO 치료에 이어, 세포 증식과 세포 주기가 줄기 세포에서 어떻게 조절되는지 이해할 수 있으며, 이는 치료가 세포 주기의 G1 단계에서 성장 체포를 촉진하는 데 도움이 되기 때문이다. 분화된 세포는 질병 관련 메커니즘을 이해하고, 다른 세포 유형과 공동 배양하기 위해, 종양성 작용제에서, 및 기능성 작용또는 이식 연구에서 분화된 세포가 질병 표현형을 구출할 수 있는지 를 결정하는 데 사용될 수 있다.
