В этом протоколе описаны ключевые шаги в генерации и оптимизации эффективных векторов sgRNA. Наше предвкушение кандидата sgRNA цели относительного времени и вывода. Основным преимуществом этого протокола является то, что он позволяет анализировать впечатления кодирования ДНК для каждого из sgRNAs без редактирования эндогенных генов.
Этот метод предварительного отбора также может быть применен к другим мерам редактирования генов с помощью двухочередных перерывов. Начните с разбавления лиофилизированных олигонуклеотидов до конечной концентрации 10 микромолей в двойной дистиллированной воде. Смешайте вперед и обратное олигонуклеотиды в тонкостенной трубке ПЦР в соотношении один к одному без добавления дополнительного буфера.
Инкубировать смесь при температуре 95 градусов по Цельсию в течение пяти минут, а затем нарастить вниз температуры до 72 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Удалите смесь олигонуклеотида из машины ПЦР и дайте ему остыть при комнатной температуре. Чтобы переварить вектор pX330-xCas9, с Bbs1, объединить вектор, фермент и буфер пищеварения в объеме 50 микролитров и инкубировать реакцию при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.
После выполнения преобразования клеток, выбрать от пяти до 10 бактериальных колоний из пластины LB и использовать каждый из них, чтобы привить один миллилитр ЛБ сми с 60 миллиграммов ампициллина в 1,5 миллилитровой трубки. Затем инкубировать трубки на роторный шейкер в течение двух-трех часов. Выполните ПЦР для проверки рекомбинантных плазмидов, описанных в текстовой рукописи, а затем запустите продукты на 2%Agarose гель под 10 вольт на сантиметр.
После выявления положительных плазмидов используйте их вместе с вектором репортеров для совместной трансфектирования соответствующей клеточной линии. Чтобы вылить клетки, удалить среду роста из культурных клеток. Аккуратно промыть поверхность культурного сосуда с помощью PBS и распределить 100 микролитров PLB в каждую культуру хорошо, чтобы полностью покрыть монослой клетки.
Пусть пластина инкубировать при комнатной температуре в течение 20 минут, а затем передать ликат в трубку или флакон для дальнейшей обработки или хранения. Для выполнения двойного анализа люциферазы, запрограммировать люминометры, чтобы обеспечить две секунды предварительной задержки чтения следуют 10 второй период измерения. Затем выпределите 100 микролитров реагента люциферазы в соответствующее количество люминометровых трубок.
Аккуратно добавьте 20 микролитров лизата клетки в люминометровую трубку и перемешайте с помощью трубок два или три раза. Поместите трубку в люминометр и инициировать чтение. Удалите образец трубки из люминометра.
Добавить 100 микролитров стоп-реагента и вихря кратко перемешать. Верните образец на люминометр и инициируем чтение. Запись активности Рениллы Люциферазы, нормализованной для активности Светлячка Люциферазы, в частности, взаимного соотношения, отображаемого на экране.
Откажитесь от реакционной трубки, когда закончите. Этот метод был использован для генерации трех векторов sgRNA для овец DKK2 Exon 1. sgRNA и xCas9, выражаюющие векторы, были построены путем предварительного переваривания векторного костяка, за которым последовала лигатирование его в серии коротких, двухструнные фрагменты ДНК через анналирование олиго пар.
Семь бактериальных колоний были проверены с помощью специфической грунтовки с гидом ПЦР и были обнаружены положительные колонии. Возможности таргетинга генов pX330-xCas9 T1, T2 и T3 были одновременно обнаружены с помощью анализа двойной люциферазы. Последний вектор sgRNA отображал самый высокий сигнал обнаружения и впоследствии использовался для исследования редактирования генов овец.
Следуя этому протоколу, можно проследовать анализ T7EI или анализ рибонуклеазы. Эти дополнительные меры дают более точные впечатления от редактирования эндогенных генов.
