Этот протокол обеспечивает основу для изучения включения экзогенных жирных кислот из сложных источников хозяина в бактериальные мембраны, особенно золотистый стафилококк. Протокол использует объективный липидомный анализ и частицы липопротеинов, изолированные от куриных яичных желтков в качестве экономического источника сложных жирных кислот для количественной оценки включения жирных кислот в бактериальные липиды. Методы масс-спектрометрии, описываемые здесь, предлагают беспрецедентную перспективу профиля жирных кислот из липидов золотистого стафилококка, но могут быть адаптированы для изучения других бактериальных мембран.
При выполнении этого протокола следует позаботиться о том, чтобы каждый шаг фракциоции выявлял и сохранял фракцию, содержащую ЛПНП. Удаление сульфата аммиака из плазменной фракции имеет решающее значение для применения в нижнем течении LDLs. Обеспечить достаточно места в трубе и изменить воду по мере необходимости, чтобы позволить эффективный диализ.
Для начала, мыть два яичных желтка в два раза с 30 миллилитров стерильного фосфата буферного солевого раствора для удаления остаточного альбумин. Проколите вителлиновую мембрану стерильным наконечником пипетки и слейте содержимое мембраны в стерильную 50-миллилитровую коническую центрифугу. Добавить примерно от 24 до 30 миллилитров или 17 молярного раствора хлорида натрия при рН семь в яичный желток и энергично перемешать.
Затем поместите трубку на качалку, чтобы смешать при четырех градусах по Цельсию в течение 60 минут. Центрифуга разбавления яичного желтка при 10 градусах Цельсия при 10 000 раз г в течение 45 минут. Перенесите супернатантную плазменную фракцию в стерильную 50-миллилитровую коническую трубку, оставив за собой гранулированную гранулированную гранулированную фракцию.
И снова центрифуга. Во-первых, смешать плазменную фракцию с 40 массой процента аммония сульфата на качалки шейкер или аналогичное устройство при четырех градусах по Цельсию в течение 60 минут. После регулировки рН центрифуга плазменной фракции при четырех градусах Цельсия и 10 000 времени г в течение 45 минут.
Удалите верхнюю полутвердую желтую фракцию в семь килодальтонных пор размером с диализную трубку. Предоставьте минимум 25% дополнительной комнаты в трубе, чтобы она зыбь. Поместите диализные трубки в три литра ультрапурной воды, чтобы парализовать ночь при трех градусах по Цельсию, чтобы удалить сульфат аммония.
После диализа центрифуга раствора при четырех градусах Цельсия, как описано ранее. Аккуратно удалите верхнюю, полутвердую желтую фракцию в стерильную трубку и храните при четырех градусах Цельсия. После ночной инкубации культуры, передача 500 микролитров в два стерильных 250 миллилитров сбит с толку колбы, содержащие 49,5 миллилитров 1%триптон бульон.
Инкубировать в течение примерно четырех часов при 37 градусах по Цельсию со тряской, чтобы достичь середины длинной фазы. Передача 100 миллилитров культуры в 25 миллилитров шагом в четыре стерильных 50 миллилитров центрифуг трубки и центрифуги четыре трубки на 10000 раз г гранулы клеток. Удалите супернатант и повторно приостановите каждую ячейку гранулы в 750 микролитров 1%триптон бульона.
Объедините четыре 750 микролитровых клеточных суспензий в одну 15-миллилитровую трубку. И aliquot 350 микролитров клеточной подвески в шесть стерильных 1,5 миллилитров центрифуг труб. Используйте пипетку, чтобы добавить 30 микролитров LDLs в 1,5 миллилитр центрифуги трубки для достижения желаемой конечной концентрации 5% И инкубировать при 37 градусов по Цельсию с встряхивания в течение четырех часов.
Центрифуга культур при четырех градусах по Цельсию при 16 000 раз г в течение двух минут. И повторно приостановить клеточные гранулы в 330 микролитров стерильных фосфат-буферных солевой раствор для мытья. Повторите эту стирку еще раз.
Завещайте вес шести гранул влажных клеток, вычитая вес пустой трубки. Привязать заморозить ячейки гранулы на сухом льду. Сначала добавьте одну мерную ложку 5-миллиметровых бусинок оксида циркония поверх каждой клеточной гранулы.
Добавьте 740 микролитров метанола класса 75% HPLC, охлажденных до минус 80 градусов по Цельсию непосредственно в каждую трубку. Затем добавьте два микролитров 50 микромолящих димиристойл фосфатидилхолина в качестве внутреннего стандарта. Поместите образец, содержащий 1,5 миллилитровые центрифуги трубок в доступный порт на пуля блендер ткани гомогенизатора.
Гомогенизировать образцы на низкой скорости. Установка два-три в течение трех минут. Визуально проинспектировать образцы на однородность.
Если скопления клеток видны, продолжайте гомогенизацию в пулевом блендере двумя минутами. Далее добавьте 270 микролитров хлороформа к каждому образцу в химическом дымовом капюшоне. Вихрь образцов энергично в течение 30 минут.
Центрифуга образцов в центрифуге на скамейке до 30 минут при минимуме 2 000 раз г. В химическом вытяжке дыма, собирать монофазный супернатант и передать его в новую пробирку, тщательно избегая белка гранулы в нижней части извлечения трубки. Перенесите разбавленные липидные экстракты, ранее подготовленные к соответствующему автозапомохаму.
Для анализа на основе впрыска потока поместите флаконы autosampler в контролируемый температурой автоамперлер системы HPLC, способной к капиллярных приложений потока. Настройка системы HPLC в соответствии с рукописью. Элуент вводится от линии передачи HPLC к масс-спектрометру через источник ионизации электроспрей, оснащенный низкотекутной металлической иглой 34 калибра.
В программном обеспечении для управления приборами Thermo Tune Plus установите напряжение ионизации до 4000 вольт и газ оболочки до пяти. Аналогичным образом, установите температуру капилляра до 150 градусов по Цельсию и S-объектив до 50%Нажмите кнопку определения сканирования, и в меню анализатора, выберите FTMS. Установите поле диапазона массы в нормальное русло и в поле разрешения, выберите 100 000.
Убедитесь, что тип сканирования установлен в полном объеме. В меню диапазонов сканирования введите 200 в первом массовом поле и введите 2000 в последнем массовом поле. После дальнейшего определения наблюдаемой точности массы, средний сигнал через широкий пик в общей ионой хроматограмме.
Право нажмите значок thumbtack в окне просмотра массового спектра и выберите список спектра представления. Из того же меню выберите параметры отображения, а затем все пики переключить окно в меню дисплея. Нажмите кнопку "Хорошо", чтобы закрыть окно просмотра.
Право нажмите значок thumbtack в окне просмотра массового спектра снова и выберите экспорт буфер обмена точной массы. Вставьте экспортируемую ячейку данных A1 первого листа в новую таблицу Excel и продолжайте в соответствии с рукописью. Для выполнения точной массовой идентификации липидов откройте программное обеспечение LIMSA.
Из основного меню выберите пиковый список под меню типа спектра. Выберите положительный режим или отрицательный режим, чтобы соответствовать полярности, в которой были получены данные масс-спектрометрии. В пиковой полной ширине в половине максимума и над окном z введите желаемое окно массового поиска для пиковой находки.
В этом протоколе содержание ЛПНП в плазменной фракции было дополнительно обогащено осадками бета-левитинов от 30 до 40 килоталтонов. Наличие белковых полос на 140, 80, 65, 60 и 15 килодалтонов коррелирует с апопротеинами ЛДЛ. Лечение триклозаном тормозит рост стафилококка в среде, свободной от жирных кислот.
Дополняя культуры плазмой яичного желтка в качестве экзогенных источников жирных кислот, мы преодолеваем ингибирование роста, вызванное триклозаном. Аналогичным образом, добавки триклозан обработанных культур с обогащенным яичным желтком LDL восстанавливает рост. Кроме того, добавление яичного желтка LDLs поддерживает рост ранее охарактеризованных S.aureus жирной кислоты, auxotroph.
Предварительно жирной кислоты содержание было измерено в 1%триптон бульон или куриный яичный желток ЛПНП с использованием потока инъекций высокого разрешения точной масс-спектрометрии. Было обнаружено минимальное количество свободных жирных кислот. Ортогональный частичный наименее квадратов дискриминантный анализ обильного стафилококка ауреус мембраны фосфолипиды продемонстрировали четкое разделение класса, с жирной кислоты состав необработанных и куриный яичный желток LDL обработанных условиях.
Обогащение LDLs из куриного яичного желтка обеспечивает недорогой источник сложных жирных кислот для изучения взаимодействия между бактериальными патогенами и липопротеинов хозяина. Хлороформ и метанол, используемые при приготовлении липидных экстрактов, опасны. Пожалуйста, не забудьте использовать эти реагенты в химическом капоте дыма и содержать все потоки отходов.
