Классическим методом, при котором мембранные белки извлекаются для их изучения, является простая растворимая в моющих средствах. Хотя это обеспечивает простой и универсальный метод, моющие средства, как было показано, изменить родную структуру, функцию и активность этих чувствительных белков. Здесь мы представляем Peptidisc как решение для стабилизации мембранных белков в растворе, свободном от моющих средств.
Система Peptidisc спонтанно адаптируется к размеру, форме и типологии множества мембранных белков. Это контрастирует с другими мембранными миметиками, которые часто требуют утомительной оптимизации. FhuA, белок внешней мембраны E.coli, будет использоваться в качестве модели целевого белка, который будет восстановлен в этом протоколе.
Внешние мембранные пузырьки будут изолированы с последующим добавлением моющего средства для раствора мембранных белков. Пептид Peptidisc добавляется в solubilization и моющее средство разбавляется прочь, спонтанно образуя частицы Peptidisc. Эти стабилизированные растворимые частицы в настоящее время подложки для многочисленных приложений вниз по течению.
Этот протокол будет изучать биослойную интерферометрию как применение технологии Peptidisc. Этот протокол будет сосредоточен на методе восстановления Пептикуика, полезном методе, который облегчает одновременное очищение и восстановление мембранных белков. Метод восстановления бисера Pepti'uquick выполняется в стандартной гравитационной колонке Nickel-NTA IMAC, предварительно уравновешенной в моющих средствах.
Солубилизованная мембрана загружается на смолу, а нецелеумные белки смываются. После этого пептид добавляется в колонку и моющее средство разбавляется быстро. Гидрофобная сторона пептида Пептидиска ассоциируется с открытыми гидрофобными областями.
Гидрофильная сторона пептида сохраняет белок растворимым в растворе. Избыток пептида смывается. Имидазол добавляется к elute восстановленной ярости.
Эшафот Peptidisc может быть функционализирован, чтобы косвенно маркировать белки памяти и таким образом открыть дверь к более широкому набору анализов вниз по течению. Здесь мы эксплуатируем биотинилированный пептид для присоединения к датчикам с покрытием стрептавидина для анализа BLI. Биослойная интерферометрия является мощным методом без этикеток для изучения биомолекулярных взаимодействий в растворе.
Помимо простой демонстрации взаимодействий, этот метод дает кинетическое считывание в режиме реального времени и позволяет вычислить постоянную диссоциацию связывания. С помощью этого протокола мы устраняем необходимость в моющих средствах во время анализа BLI, так как это может изменить активность. Интерферометрия biolayer анализирует помехи, проходящие от датчика, или наконечника, и связанные макро молекулы во время взаимодействия.
Для измерения взаимодействий наконечник чувства передается между решениями и сигналом, записанным на каждом шагу. Каждый совет затем дает свой собственный след на сенсограмме. Во-первых, устанавливается только базовый уровень буфера.
Во-вторых, лиганд связан. В этом случае, FhuA и биотинилированные Peptidiscs связывает стрептавидин encoated отзыв. Далее, кончик промывается в буфер, чтобы удалить любые неограниченные FhuA.
Теперь наконечник перемещается в раствор с известной концентрацией аналита, здесь ColM. Если взаимодействие происходит, это даст привязку кривой. Наконец, наконечник перемещается в буфер и измеряется диссоциация.
Наблюдаемые показатели ассоциации и диссоциации при концентрации каждого столбца могут быть использованы для расчета постоянной диссоциации. Гексахистидин с тегами FhuA выражается в штамме E-coli AW740 в течение 18 часов в амина СМИ. Бактерии собирают с помощью центрифугации при 5 000 Г в 10 минут при четырех градусах Цельсия.
Полученные клеточные гранулы повторно подвешен в буфере TSG, а затем dounced разбить клеточные сгустки и обеспечить тщательныйлиз. TMSF добавляется в повторно приостановленные клетки к окончательной концентрации одного миллимолара незадолго до лиза. Клеточныйлиз достигается тремя проходами через микрофлюидатор в 15 000 PSI или французский пресс в 8000 PSI.
Лисированные клетки собираются и низкая скорость центрифугации на 5000 Г в течение 10 минут при четырех градусах выполняется. Супернатант от медленного вращения загружается в ротор TI70 ultracentrifuge и центрифугирован на 200 000 G в течение 40 минут при четырех градусах, чтобы гранулировать сырую мембрану E.coli. После ультрацентрифугации супернатант отбрасывается, а гранулы сырой мембраны повторно подвешаются в минимальном количестве буфера TSG.
Сырая мембрана dounced для того чтобы обеспечить свою однородность. Bradford Assay выполняется для проверки концентрации белка повторно приостановленной сырой мембраны. Буфер TSG используется для разбавления сырой мембраны примерно до трех миллиграммов на миллилитр до solubilization.
Triton X-100 добавляется в повторно приостановленную сырую мембрану при конечной концентрации 1%, чтобы избирательно solubilize бактериальной внутренней мембраны. Solubilization выполняется в течение одного часа при четырех градусах, с нежным качания. Не-solubilized внешняя мембрана изолирована ультрацентрифугации на 200,000 G's в течение 40 минут, при четырех градусах.
В результате супернатант, содержащий solubilized внутренней мембраны отбрасывается. В то время как гранулы, содержащие внешнюю мембрану, повторно приостановлено, как и прежде в TSG. LDAO добавляется к окончательной концентрации 1%к повторно приостановленной внешней мембраны, и solubilized в течение одного часа при четырех градусах.
Наконец, ультрацентрифугация выполняется, как и прежде, для гранул нерастворимого материала. В результате супернатант содержит solubilized внешней мембраны, в том числе нашей цели, его помечены FhuA, в настоящее время готовы к одновременной очистки IMAC и Peptidisc восстановления. Гравитационная колонка Nickel-NTA IMAC предварительно уравновешена двумя томами столбца буфера стирки IMAC.
Имидазол добавляется при конечной концентрации в пять миллимоля в solubilized внешней мембраны, разбавленной до 0,04%LDAO. Солубилизованная внешняя мембрана загружается на смолу Никель-НТА, и поток через собранные. Этот поток через перезаряжается на смолу, чтобы увеличить связывание смолы FhuA.
После погрузки смолу промывают 250 миллилитров буфера для мытья IMAC и собирают первые 50 миллилитров. После мытья, мыть буфер осушенных чуть выше высоты смолы кровать и колонка стопкок закрыт. Один миллилитр концентрированного, 10 миллиграмм на миллилитр, пептид Peptidisc добавляется в колонку.
После добавления концентрированного пептида, добавляется 50 миллилитров разбавления, один миллиграмм на миллилитр, пептид Пептидиска в TSG. Смола перемешивают, чтобы вновь приостановить бусы в TSG, ниже CMC LDAO, таким образом образуя частицы Peptidisc. После захвата Peptidisc, смола может осесть и один миллиграмм на миллилитр пептид раствор сливается через смолу.
Смола промывается 50 миллилитров TSG, чтобы удалить избыток пептида Peptidisc. Наконец, частицы Peptidisc разбавляются 50 миллилитров 600 миллимолярный имидазол в TSG. Собрано 1 миллилитровая фракция и добавлено 10 микролитров 0,5 мларного ЭДТА, ключевой свет выщелачивает ионы никеля.
Начало, поток через, мыть, и ускользает фракций загружаются на 12%SDS гель и электрофорез в течение 30 минут на 60 миллиампер. Гель окрашивается и визуализируется на гелевом сканере. В результате гель показывает истощение FhuA в потоке через, и обогащение в elution.
Незначительные загрязняющие полосы также наблюдаются в ускользах фракциях. Фракции от трех до семи выбраны для хроматографии исключения размера для подтверждения хуа Пептидиск solubility и истощения загрязняющих веществ. 30 Kilodome отрезал центробежный концентратор используется для концентрации фракций от трех до семи.
Один миллилитр объединенных фракций IMAC elusion вводится в колонку S200 со скоростью потока 0,25 миллилитров в минуту в буфере TSG. Собраны одна миллилитровая фракция и запущен 12%SDS гель фракций. Соответствующие фракции объединяются и теперь могут использоваться в приложениях ниже по течению.
BLI был проведен в ForteBio Octet RED96. Этот инструмент перемещает BLI булавки через 96 хорошо пластины, которая впервые создана вручную. Все скважины заполнены до конечного объема в 200 микролитров.
Столбец один загружается с буфером кинетики, чтобы советы уравночные и сформировать базовый сигнал. Колонка 2 загружается с заранее определяемой концентрацией буфера лиганда и кинетики. В этом случае FhuA является лигандом и добавляется к концентрации 2,5 микрограмма на миллилитр.
Наконечник в строке E будет использоваться в качестве эталона и загружается только буфером. Колонка три загружается с буфером кинетики для мытья избыточного FhuA от кончика. Двукратные серийные разбавления аналита, в данном случае ColM, загружаются сверху вниз в колонке четыре.
Самая высокая из этих концентраций используется для эталонного ряда для измерения неспецифической привязки аналита к кончику. Колонка 5 загружается буфером. Здесь ColM будет разобщаться, и диссоциация измеряется.
После того, как пластина подготовлена, датчик наконечник лоток и подготовленная пластина загружаются в инструмент BLI. Открыто программное обеспечение для сбора данных BLI и запущен новый кинетический эксперимент. Вкладка Определение плиты используется для ввода макета 96-хорошо пластины в программное обеспечение.
Здесь лиганд FhuA вводится в качестве нагрузки в то время как анализ ColM вводится в качестве образца. Вкладка Assay Definition используется для определения продолжительности времени и скорости вращения пластины для каждого шага эксперимента. Здесь мы включаем базовый шаг в 60 секунд, а затем шаг загрузки 250 секунд, второй базовый шаг в 300 секунд, шаг ассоциации аналитиков 450 секунд, и, наконец, шаг диссоциации 900 секунд.
Эти шаги индивидуально назначаются каждому столбецу в пластине 96-колодец, выбрав нужный шаг и нажав правой кнопкой Add Assay на каждом столбце. Вкладка назначения датчика используется для обеспечения того, чтобы инструмент Octet принимал контакты BLI из их правильного расположения в лотке датчика. Вкладка «Эксперимент по обзору» предоставляет окончательный обзор эксперимента перед выполнением.
BLI теперь будет осуществляться Octet RED. Это позволит подготовить необработанные данные сенсограммы для анализа. Анализ проводится путем первого открытия программного обеспечения octet биоданных анализа.
Вкладка «Выбор данных» используется для определения местонахождения эксперимента и проверки экспериментального резюме. Здесь вводятся концентрации аналита ColM. Далее вкладка обработки используется для вычитания эталонного сигнала из экспериментальных данных.
Базовый уровень определяется для выравнивания оси Y, как если бы ее скорость де-сплава была применена. Наконец, выбираются данные процесса. Данные изолированы для этого эксперимента, и Fit кривые выбран.
Выбрана частичная установка кривой ассоциации и диссоциации. Kd рассчитывается из этой примерки. Хроматограмма исключения размера используется для проверки восстановления амбута.
Хроматограмма показывает один симметричный пик, предполагая монодисперсный белковый препарат. Пик elutes несколько миллилитров после пустоты объем, что указывает на не агрегированных растворимых частиц Peptidisc. Белковые агрегаты будут elute на пустоту объема, в то время как избыток моющих средств и пептида будет elute после основного пика.
Увеличенное мытье сформированных Peptidiscs пока все еще прикреплено к шарикам никель-NTA должно истощить этот последний пик. Белковые агрегаты часто являются результатом подвергая белки памяти моющего средства без раствора до восстановления. Эта последняя хроматограмма исключения является полезной диагностикой для устранения неполадок в восстановлении.
После обработки экспериментальных данных кривая подходит к сенсограмме. Точность этой установки имеет важное значение для расчета постоянной диссоциации. Участок остаточного представления описывает разницу между экспериментальными данными и вычислительной установкой.
Это показывает, что для четырех различных концентраций столбца три кривых хорошо подходят. Однако, для самой высокой концентрации кривая не производит хорошую пригонку. Это говорит о том, что при такой более высокой концентрации существует неоднородное связывание столбца с штифтом.
Таким образом, этот сигнал наибольшей концентрации не включен из кинетического анализа, как отмечается в приложении ForteBio. Остальные три кривые используются для кинетического анализа. Константа диссоциации между FhuA и ColM, определяемая с помощью метода BLI и Peptidisc, согласуется с константами, определяемыми другими методами.
Изотермальная калорийность и нанодиски, а также микромасштабный термофорез и Пептидиск дали константы диссоциации, не существенно отличаемые от нашего установленного значения. Эта консистенция подтверждает метод Peptidisc BLI для измерения кинетики взаимодействия. Итак, после просмотра этого видео, мы надеемся, что вы получили практическое понимание силы и предостережения методов Пептикурик.
Мы нашли этот метод особенно полезным для количественной оценки взаимодействия FhuA ColM в полном отсутствии моющих средств. И мы подозреваем, что тот же рабочий процесс может быть применен для характеристики любого другого взаимодействия рецептор-лиганд. Удачи в ваших экспериментах.
