Этот протокол демонстрирует полезность стволовых клеток, полученных кишечной органоидной системы для моделирования эпителиального вторжения кишечных патогенов, и модификации этого процесса с использованием цитокинов. Микро-инъекция позволяет возбудителя интерес быть доставлены непосредственно в люменальной полости органоидов, реплицируя более тесно процесс инфекции in vivo. Этот метод может быть применен к изучению различных патогенных микроорганизмов или альтернативных цитокинов, представляющих интерес.
Я хотел бы предложить завершить пробный запуск процедуры с фенол красный только для того, чтобы освоить микро-инъекции техники до использования патогенов. На второй день начните дифференциацию, изменив средства массовой информации на 10 миллилитров среды культуры стволовых клеток, дополненные факторами роста. На шестой день, изменить средства массовой информации на 10 миллилитров RPMI-B27 средств массовой информации, дополненный шестью микромолярной CHIR99021, а также три микромолярной ретинойной кислоты, чтобы начать узор задней эндодермы к задней части.
В день дифференциации 10, вставлять hindgut в подвале мембраны матрицы. Во-первых, удалить средства массовой информации из задней пластины, и мыть пластину с кальцием магния, свободной ОТПП один раз. Добавьте пять миллилитров раствора коллагеназы в тарелку и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение пяти минут.
Затем инактивировать коллагеназу, добавив пять миллилитров органоидных средств роста базы к пластине. Клетки хиндгута должны плавать в этой точке. Соберите подвеску заднего лота в 15-миллилитровой конической трубке.
Затем центрифуга в 240 раз-G в течение одной минуты. После центрифугации, пипетка от супернатанта, добавить 10 миллилитров органоидных средств роста базы, разбить задний на мелкие кусочки, мягко пипетки, и центрифуга снова в 95 раз-G в течение одной минуты. Вымойте клетки в органоидной базы роста средств массовой информации в два раза.
Перезагноейте клетки в 300-500 микролитров среды базового роста и добавьте около 100 микролитров этого раствора в 1,5 миллилитров мембранной матрицы подвала. Установите 24-хорошо пластины на пластине нагреватель при 37 градусов по Цельсию. и обнаружить 60 микролитров смеси матрицы задней части клетки в один колодец из 24-хорошо пластины.
Дайте ему кратко установить и проверить плотность под микроскопом. После пятнистости из остальной части матрицы в 24-хорошо пластины, инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут. Затем добавьте 800 микролитров базовых средств роста, содержащих факторы роста, к каждой колодец из 24-хорошо пластины.
Чтобы пройти органоиды, сначала удалить средства массовой информации из них, и заменить его 500 микролитров на колодец клеточного подъемного раствора. Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 40-50 минут, после чего органоиды должны плавать в растворе. Аккуратно пипетка органоидов и клеточный подъемный раствор в 15-миллилитровые конические трубки, стараясь не разгонять органоиды.
После того, как органоиды оседают в течение трех-пяти минут, удалить супернатант и одиночные клетки. Resuspend органоидов в пять миллилитров среды роста базы, и пипетки их осторожно мыть. Центрифуга при 95-времени-G в течение двух минут.
Затем установите 24-хорошо пластины на пластине нагреватель при 37 градусов по Цельсию в капюшоне, и удалить супернатант из органоидных гранул. Затем, используя P1000 пипетки, повторно органоидов в 300 до 500 микролитров базовых средств роста, чтобы разбить органоиды на более мелкие куски. Поместите около 100 микролитров органоидов в 1,5 миллилитров мембранной матрицы подвала и пипетку кратко перемешать.
Найми 60 микролитров мембранной матрицы подвала в один колодец из 24-хорошо пластины. Оставив его затвердеть в течение 30 секунд, проверьте плотность под микроскопом. После обнаружения остальной части матрицы в 24-хорошо пластины, поместите пластину в инкубатор на 37 градусов по Цельсию в течение 10 минут, а затем наложить его с 800 микролитров среды роста базы с факторами роста в соответствии с рукописью.
Для микро-инъекционных анализов с рекомбинантным человеческим IL-22 предварительной стимуляции, добавить рекомбинантных человека IL-22 в культурные средства массовой информации до окончательной концентрации 100 нанограмм на миллилитр 18 часов до инъекций. Загрузите микро-инъекцию блюдо, содержащее органоиды на стадии микроскопа, удалить крышку, и привести органоиды в фокусе, готовы к инъекции, чтобы начать. Включите инжектор и станции управления рукой.
Убедитесь, что инжектор установлен на давление 600 килопаскалей и время впрыска 0,5 секунды. Если он еще не отступил от стадии микроскопа, поверните руку инъекции, чтобы убедиться, что это так, и удалите его сцепление головой. Загрузите кончик сверла 10 микролитров инокулума, сжимая кончик сверла мягко на его тупом конце.
Поместите наконечник сверла в рукоятку и прикрепите его к микро-инъекционной руке. Аккуратно переместите руку в положение, когда игла расположена на один-два сантиметра выше микро-инъекционного блюда. Используйте управление рукой, чтобы распоставить кончик иглы в центре блюда и опустить его, пока он не будет только над поверхностью среды.
Программа станции управления рукой, чтобы вернуть иглу к этой точке после всех инъекций. Сосредоточьте микроскоп на органоидах и выберите цель для инъекций. Распоить иглу чуть выше и право органоида, который будет введен, и переместить иглу вниз и боковой в органоидный люмен.
Нажмите кнопку впрыска на микро-инжектор, чтобы фенол-окрашенные бактерии смесь выйти из иглы. И вводить каждый органоид три раза. Когда все необходимые органоиды вводятся, удалить микро-инъекции пластины со сцены, заменить крышку, и инкубировать пластины при 37 градусов по Цельсию в течение 90 минут.
После инкубации, аспирировать рост средств массовой информации и заменить его на три миллилитров клеточного подъемного раствора. Затем инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 45 минут. Затем аккуратно переместите органоиды и клеточный подъемный раствор в 15-миллилитровую коническую трубку, содержащую пять миллилитров DPBS.
Центрифуга при 370-времени-G в течение трех минут. Удалите супернатант и добавьте один миллилитр средств массовой информации базового роста, содержащий 0,1 миллиграмма на миллилитр гентамицина. Далее, с P1000, пипетка вверх и вниз примерно 50 раз, чтобы разбить органоиды.
Добавить четыре миллилитров больше средств массовой информации, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение одного часа, чтобы убить внеклеточных бактерий. Далее центрифуга органоидов в 370 раз-G в течение трех минут. Аспирировать супернатанта, оставляя как можно меньше.
Вымойте органоиды с DPBS один раз и центрифуга снова. Добавьте 500 микролитров буфера лиза, и пипетки вверх и вниз примерно в 50 раз, чтобы вручную разобщить кишечные органоиды человека. После инкубации при комнатной температуре в течение пяти минут, последовательно разбавить полученный раствор в десять раз в DPBS.
Pipette три 20-микрон капли аккуратные и разбавленные растворы на предварительно разогретых пластин LB агар. Наконец, инкубировать при 37 градусах по Цельсию на ночь и приступить к колонии подсчета. Кишечные органоиды человека были микро-впрыснуты с фенол красный бактериальный раствор.
Сохранение этого красного цвета органоидами предотвращает дублирование инъекций. Предварительное лечение кишечных органоидов человека, полученных из клеточной линии COF-2 с рекомбинантным человеческим IL-22, ограничивает вторжение S.typhimurium SL1344 в кишечные эпителиальные клетки. Зараженные органоиды были обработаны для иммуно-окрашивания, или передачи электронной микроскопии, для того, чтобы облегчить визуализацию принимающих бактериальных взаимодействий IEC.
РНК может быть извлечена из инъекционных органоидов, чтобы посмотреть на транскриптомную реакцию на инфекцию. Флуоресценция и электронная микроскопия также могут быть использованы для более детального наблюдения за взаимодействиями патогенов-хозяина. Самое главное помнить, чтобы убедиться, что у вас было достаточно практики на микро-инжектор, чтобы иметь возможность завершить инъекции быстро и эффективно для последовательных результатов.
Микро-инъекционные буровые наконечники имеют тонкую, острую точку, и следует позаботиться о них при загрузке и выгрузки их из микро-инжектора. Этот метод позволяет изучать эпителиальные клеточные патогенные взаимодействия в ранее недостижимых деталях. Эта модель инфекции будет особенно использоваться для тех, кто изучает специфические для человека патогены.
