يوضح هذا البروتوكول فائدة الجهاز العضوي المعوي المشتق من الخلايا الجذعية لنمذجة الغزو الظهاري بواسطة مسببات الأمراض المعوية ، وتعديل هذه العملية باستخدام السيتوكينات. الحقن الدقيق يسمح لمسبب المرض من الفائدة التي يمكن تسليمها مباشرة في تجويف تجويف تجويف الجهاز ، وتكرار عملية أكثر قربا من العدوى في الجسم الحي. ويمكن تطبيق هذه الطريقة على دراسة مسببات الأمراض المعوية المختلفة أو السيتوكينات البديلة ذات الأهمية.
أود أن أقترح استكمال تشغيل تجريبية من الإجراء مع الأحمر الفينول فقط من أجل السيطرة على تقنية الحقن المجهري قبل استخدام مسببات الأمراض. في اليوم الثاني، تبدأ التمايز عن طريق تغيير وسائل الإعلام إلى 10 ملليلتر من الخلايا الجذعية المتوسطة ثقافة، تكملها عوامل النمو. في اليوم السادس، تغيير وسائل الإعلام إلى 10 ملليلتر من وسائل الإعلام RPMI-B27، تستكمل مع ستة micromolar CHIR99021، بالإضافة إلى ثلاثة حمض الريتينويك ميكرومولر للبدء في نقش endoderm الخلفي إلى hindgut.
في يوم التمايز 10، تضمين hindgut في مصفوفة غشاء الطابق السفلي. أولا، إزالة وسائل الإعلام من لوحة hindgut، وغسل لوحة مع الكالسيوم المغنيسيوم خالية من DPPS مرة واحدة. إضافة خمسة ملليلتر من محلول الكولاجيناز إلى لوحة واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
المقبل، تعطيل collagenase بإضافة خمسة ملليلتر من وسائل الإعلام نمو قاعدة الجهاز إلى لوحة. يجب أن تكون الخلايا الخلفية عائمة عند هذه النقطة. جمع تعليق hindgut في أنبوب مخروطي 15 ملليلتر.
ثم جهاز الطرد المركزي في 240 مرات-G لمدة دقيقة واحدة. بعد الطرد المركزي، الماصات قبالة السوبر، إضافة 10 ملليلتر من وسائل الإعلام نمو قاعدة الجهاز، وكسر hindgut إلى قطع أصغر عن طريق الأنابيب بلطف، والطرد المركزي مرة أخرى في 95 مرات-G لمدة دقيقة واحدة. غسل الخلايا في وسائل الإعلام نمو قاعدة الجهاز مرتين.
إعادة تعليق الخلايا في 300 إلى 500 ميكرولترات من متوسطة النمو الأساسية، وإضافة ما يقرب من 100 ميكرولترات من هذا الحل إلى 1.5 ملليلتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي. إعداد لوحة 24-جيدا على سخان لوحة في 37 درجة مئوية. و بقعة من أصل 60 ميكرولترات من خليط مصفوفة الخلية hindgut في بئر واحد من لوحة 24-جيدا.
السماح لها لتعيين لفترة وجيزة والتحقق من كثافة تحت المجهر. بعد اكتشاف بقية المصفوفة في لوحة 24 جيدا، احتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. ثم إضافة 800 ميكرولتررس من وسائل الإعلام نمو قاعدة تحتوي على عوامل النمو إلى كل بئر من لوحة 24-جيدا.
لتمرير organoids، أولا إزالة وسائل الإعلام منها، واستبدالها مع 500 ميكرولترات لكل بئر من حل رفع الخلية. احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 40 إلى 50 دقيقة، وعند هذه النقطة يجب أن تكون تطفو organoids في الحل. بلطف الماصات organoids وخلايا رفع الحل في أنابيب مخروطية 15 ملليلتر، في محاولة لعدم تفريق organoids.
بعد السماح للعضية لتسوية لمدة ثلاث إلى خمس دقائق ، وإزالة supernatant والخلايا المفردة. resuspend organoids في خمسة ملليلتر من متوسطة النمو الأساسية ، والماصات لهم بلطف لغسل. جهاز طرد مركزي في 95-مرات-G لمدة دقيقتين.
المقبل، إعداد لوحة 24-جيدا على سخان لوحة في 37 درجة مئوية داخل غطاء محرك السيارة، وإزالة سوبرنات من بيليه organoid. ثم، باستخدام ماصة P1000، resuspend organoids في 300 إلى 500 ميكرولترات من وسائل الإعلام نمو قاعدة لتفريق organoids إلى قطع أصغر. ضع ما يقرب من 100 ميكرولترات من الأعضاء في 1.5 ملليلتر من مصفوفة غشاء الطابق السفلي والماصات لفترة وجيزة لخلط.
بقعة من أصل 60 ميكرولترات من مصفوفة غشاء الطابق السفلي في بئر واحد من لوحة 24-جيدا. بعد تركه لتوطد لمدة 30 ثانية، والتحقق من كثافة تحت المجهر. بعد اكتشاف بقية المصفوفة في لوحة 24 بئرًا ، ضع اللوحة في حاضنة عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق ، ثم تراكبها بـ 800 ميكرولترات من وسيط النمو الأساسي مع عوامل النمو وفقًا للمخطوطة.
بالنسبة لمقايس الحقن الدقيق مع التحفيز المسبق للإنسان المؤتلف IL-22 ، أضف IL-22 الإنسان المؤتلف إلى وسائل الإعلام الثقافية إلى تركيز نهائي قدره 100 نانوغرام لكل ملليلتر قبل 18 ساعة من الحقن. تحميل طبق الحقن الدقيق التي تحتوي على organoids على مرحلة المجهر، وإزالة الغطاء، وجلب organoids في التركيز، وعلى استعداد لبدء الحقن. بدوره حاقن ومحطات السيطرة على الذراع على.
تأكد من تعيين حاقن لضغط 600 كيلوباسكال ووقت حقن 0.5 ثانية. إذا لم يكن بالفعل تراجع بعيدا عن مرحلة المجهر، تدوير ذراع الحقن للتأكد من ذلك، وإزالة رأس قبضة لها. تحميل طرف الحفر مع 10 ميكرولترات من inoculum، تجتاح تلميح الحفر بلطف في نهايتها حادة.
ضع طرف الحفر في رأس القبضة ثم أعد توصيله بذراع الحقن الدقيق. نقل الذراع بلطف في وضع حيث تقع الإبرة واحد إلى اثنين من السنتيمتر فوق طبق الحقن الدقيق. استخدام السيطرة على الذراع لوضع طرف إبرة في وسط الطبق، وخفضه حتى يكون فقط على سطح وسائل الإعلام.
برمج محطة التحكم في الذراع لإعادة الإبرة إلى هذه النقطة بعد كل الحقن. ركز المجهر على الأعضاء وحدد الهدف الذي يتم حقنه. ضع الإبرة فوق حق الجهاز في أن يتم حقنها ، وتحريك الإبرة لأسفل وبشكل لاحق في تجويف الجهاز.
اضغط على زر الحقن على الحقن الدقيق للسماح لخليط البكتيريا الملطخة بالفينول بالخروج من الإبرة. وحقن كل عضور ثلاث مرات. عندما يتم حقن جميع الأعضاء المطلوبة، وإزالة لوحة الحقن الدقيق من المرحلة، واستبدال الغطاء، واحتضان لوحة في 37 درجة مئوية لمدة 90 دقيقة.
بعد الحضانة، الاستنشاق وسائل الإعلام النمو واستبداله بثلاثة ملليلترات من محلول رفع الخلايا. ثم، احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 45 دقيقة. بعد ذلك، قم بتحريك الجهازيات بلطف وحل رفع الخلايا إلى أنبوب مخروطي 15 ملليلتر يحتوي على خمسة ملليلترات من DPBS.
جهاز طرد مركزي في 370-مرات-G لمدة ثلاث دقائق. إزالة عظمى، وإضافة ملليلتر واحد من وسائل الإعلام نمو قاعدة تحتوي على 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر gentamicin. بعد ذلك ، مع P1000 ، ماصة صعودا وهبوطا ما يقرب من 50 مرة لتفريق organoids.
إضافة أربعة ملليلتر المزيد من وسائل الإعلام، واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة لقتل البكتيريا خارج الخلية. بعد ذلك، الطرد المركزي الأجهزة في 370 مرات-G لمدة ثلاث دقائق. استلهموا المُنطّع، تاركين أقلّ قدر مُمكن.
اغسل الأعضاء بـ DPBS مرة واحدة والطرد المركزي مرة أخرى. إضافة 500 ميكرولتردات من العازلة تحلل، والماصة صعودا وهبوطا ما يقرب من 50 مرة لتفكك يدويا organoids الأمعاء البشرية. بعد احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق، تخفف بشكل متسلسل الحل الناتج عشرة أضعاف في DPBS.
الماصات ثلاثة قطرات 20 ميكرون من الحلول أنيق ومخففة على لوحات أجار LB الدفء قبل. وأخيرا، احتضان في 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها والمضي قدما في حساب مستعمرة. تم حقن الأعضاء المعوية البشرية الصغيرة مع محلول البكتيريا الحمراء الفينول.
الاحتفاظ بهذا اللون الأحمر من قبل organoids يمنع الحقن مكررة. المعالجة المسبقة للعضيات المعوية البشرية المستمدة من خط الخلية COF-2 مع الإنسان المؤتلف IL-22 يقيد غزو S.typhimurium SL1344 في الخلايا الظهارية المعوية. تمت معالجة العضية المصابة لتلطيخ المناعة، أو المجهر الإلكتروني للإرسال، من أجل تسهيل تصور التفاعلات البكتيرية للإيك IEC المضيفة.
يمكن استخراج الحمض النووي الريبي من العضية المحقونة للنظر في الاستجابة المستنسخة للعدوى. يمكن أيضًا استخدام المنظار الفلوري والمجهر الإلكتروني لمراقبة التفاعلات المُضيفة للأمراض بمزيد من التفصيل. أهم شيء أن نتذكر هو التأكد من أن كنت قد ممارسة كافية على الحقن الدقيقة لتكون قادرة على استكمال الحقن الخاص بك بسرعة وكفاءة لنتائج متسقة.
دقيقة حقن نصائح الحفر لها غرامة, نقطة حادة, وينبغي توخي الحذر عند تحميل وتفريغ لهم من حاقن الصغرى. هذه التقنية تسمح لتفاعلات مسببات الأمراض الخلايا الظهارية التي يمكن دراستها في التفاصيل التي لم يسبق الحصول عليها. هذا النموذج العدوى سوف تكون ذات فائدة خاصة لأولئك الذين يدرسون مسببات الأمراض البشرية الخاصة.
