Среди различных стратегий производства рекомбинантного белка в растениях, деконструкция растительного экспрессии VERS обеспечивает превосходную производительность, что приводит к высоким урожаям в течение относительно короткого периода времени. Репликация этой технологии для производства пероральной вакцины имеет большой потенциал, чтобы стать альтернативой обычным вакцинам в ближайшем будущем. Лиофилизированные красные листья свеклы, преходяще преобразованные, накапливают количество фото антигенов, пригодных для индукции пероральной толерантности при профилактике диабета типа 1.
Этот экспериментальный протокол может быть распространен на множество различных съедобных видов после в каждом конкретном случае оценки рекомбинантного накопления белка. Демонстрацией процедуры будут Эдоардо Бертини, Маттиа Сантони, Анна Куккурулло и Роберта Зампьери. Чтобы начать эту процедуру, вырастить красную свеклу и шпинат растений в камере роста, как указано в текстовом протоколе.
После прорастания семян оплодотворяют растения два раза в неделю раствором коммерчески доступных удобрений при концентрации одного грамма на литр. Для агроинфильтрации используйте пятинедельный шпинат и шестинедельные красные растения свеклы. После построения векторов экспрессии растений, привить три A.tumefaciens трансформантов в 50 миллилитров LB среды, содержащей рифампицин при концентрации 50 микрограмм на миллилитр и вектор конкретных антибиотиков, как указано в текстовом протоколе.
Расти, встряхивая ночью при 28 градусах по Цельсию. На следующий день гранулы бактериальных культур центрифугирования в 4500 раз G в течение 20 минут. Повторное потребление гранул в 100 миллилитров инфильтрационного буфера, содержащего 10 миллимолярный МЕС и 10 миллимолярный сульфат магния.
Инкубировать подвески при комнатной температуре в течение трех часов. Смешайте равный объем бактериальной суспензии, содержащей один из показанных здесь модулей, с пятью премьер-модулем и модулем integrase. Используя шприц без иглы, вывихни пять миллилитров суспензии смеси.
Прижимайте кончик шприца к нижней стороне листьев растения, при этом мягко прижимая его к другой стороне листа. Проникнуть первые три полностью расширенных листьев, начиная с вершины, для каждого растения. Этикетка агроинфильтрованных листьев с бумажной биркой на стебле листа.
Затем верните растения в камеру роста при стандартных условиях. В дни от 4 до 14 пост-инфекции, собирать агроинфильтрованные листья и заморозить их в жидком азоте. Храните эту растительную ткань при температуре минус 80 градусов по Цельсию.
Во-первых, отдельно вырастить три A.tumefaciens трансформаторов в 50 миллилитров LB среды, содержащей рифампицин в концентрации 50 микролитров на миллилитр, и соответствующие вектор-специфические антибиотики, встряхивая ночь при 28 градусов по Цельсию. На следующий день гранулы бактериальных культур центрифугирования в 4500 раз G в течение 20 минут. Переподход гранулы в 1 литр буфера инфильтрации в OD600 0,35, и инкубировать подвески при комнатной температуре в течение трех часов.
Затем добавьте 0,01% моющего средства к каждой подвеске. Смешайте равный объем бактериальной суспензии, содержащей один из показанных здесь модулей, с пятью главными модулями и модулем integrase. Вставьте одно шестинедельное красное растение свеклы в держатель.
Переверните держатель и поместите его поверх стакана, содержащего два литра инфильтрационной ванны, чтобы погрузить листья в инфильтрацию подвески. После этого перенесите инфильтрацию ванны с погруженным растением в инфильтральную камеру и закройте ее. Включите вакуумный насос и откройте вакуумный клапан на инфильтрационной камере.
После того, как давление в камере упало до 90 миллибар, поддерживать вакуум в течение трех минут. Затем отпустите вакуум на 45 секунд. Когда камера вернется к атмосферному давлению, откройте камеру и удалите проникшие растения из бактериальной ванны.
Верните растение в камеру роста. В день максимального выражения, урожай проникли листья и заморозить их в жидком азоте, как описано ранее. Во-первых, урожай вакуумной агроинфильтрации дельта 87 GAD65mut выражая красные листья свеклы на пике выражения, и заморозить их в жидком азоте.
Лиофилизировать замороженные листья при температуре минус 50 градусов по Цельсию и при температуре 0,04 миллибара в течение 72 часов. Затем храните их при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Когда готовы приступить, измельчить листья до мелкого порошка и хранить при комнатной температуре в герметичном контейнере с кремнеземом гель, чтобы исключить влагу.
Для моделирования пищеварения желудка, весят 100 миллиграммов мелко молотого заморозить сушеные листья красной свеклы, и повторно использовать его в шесть миллилитров PBS. Используйте шесть молярной соляной кислоты, чтобы настроить рН образца до двух. Добавьте четыре миллиграмма на миллилитр пепсина из свиной слизистой оболочки желудка и 10 миллимолярной соляной кислоты, чтобы получить окончательную концентрацию пепсина в один миллиграмм на миллилитр.
Встряхните образец при 37 градусах по Цельсию в течение 120 минут. Далее используйте гидроксид натрия, чтобы настроить рН образца до восьми и инактивировать пепсин. Перенесите 750 микролитров алицитов каждого образца в микроцентрифуговые трубки и центрифугировать алициты при 20 000 раз G и при четырех градусах Цельсия в течение 20 минут.
Соберите каждый супернатант отдельно и повторно посовекуйте каждую гранулу в один сверхнатантный объем буфера загрузки. Затем проанализируйте как супернатант, так и перерасход гранул с помощью западного анализа помарки. Для анализа целостности клеток, подготовить два образца 100 миллиграммов мелко молотых лиофилизированных листьев красной свеклы, и повторно использовать как в шести миллилитров PBS.
Используйте шесть молярной соляной кислоты, чтобы настроить рН одного образца до двух. Встряхните оба образца при 37 градусах по Цельсию в течение 120 минут. Затем aliquot 750 микролитров каждого образца для микроцентрифуг труб.
Центрифуга при 20 000 раз G и при 4 градусах Цельсия в течение 20 минут. Соберите каждый супернатант отдельно и повторно посовекуйте каждую гранулу в один сверхнатантный объем буфера загрузки. Затем проанализируйте как супернатант, так и перерасход гранул с помощью западного анализа помарки.
Во-первых, весят 100 миллиграммов мелко молотых лиофилизированных листьев красной свеклы и повторно помесят их в восемь миллилитров стерильных PBS. Вихрь на одну минуту. Плита один миллилитр каждого лиофилизированных листьев гомогената в одном из пяти подготовленных селективных СРЕДСТВ LB.
Инкубировать пластины при 28 градусах по Цельсию в течение трех дней. После этого подсчитайте колонии агробактерий, выращенные на каждой тарелке, и вычислите остаточный бактериальный заряд как количество единиц колонии, образующих единицы на миллилитр лиофилизированных листьев гомогената. В этой работе, устная вакцина разработана в съедобных тканей растений.
Красная свекла и шпинат растения вручную агроинфильтрированы с подвесками A.tumefaciens проведения EGFP рекомбинантных векторов выражения, и флуоресцентные экспрессии белка визуализируется западным анализом пятно и количественно под ультрафиолетовым светом. Красная система свеклы характеризуется более высоким выражением EGFP, достигая приблизительно 544 микрограммов на грамм веса свежего листа в течение девяти дней после заражения, в то время как шпинат достиг максимального уровня примерно 113,4 микрограмма на грамм веса свежего листа на 11 дней после заражения. Из-за этого красная свекла выбирается в качестве хоста выражения для всех последующих экспериментов.
Заводы после этого вакуум проинфильтрированы с подвеской A.tumefaciens. После извлечения TSP из листьев агроинфильтрации, образцы анализируются западным пятном, и рекомбинантный белок относительно количественно анализ денситометрии. Наконец, оцениваются параметры разработки потенциальной пероральной вакцины.
Как видно здесь, целевой белок считается стабильным после процесса лиофилизации. Пищеварение желудка моделируется путем добавления свиного желудочного фермента пепсина в лиофилизированный материал, либо к конечной концентрации одного миллиграмма на миллилитр, или отношение одного к 20, к TSP. Оба пищеварительных условия лечения приводят к деградации рекомбинантного белка.
Отсутствие конкретного сигнала в образцах гранул после переваривания пепсинов говорит о том, что после замораживания сушки растительные клетки потеряли свою целостность, что привело к деградации целевого белка. Процедура должна быть тщательно адаптирована к видам растений в отношении вакуумной инфильтрации и целевого рекомбинантного белка в отношении анализа курса времени. Процедура демонстрации может также использоваться для производства биофармацевтических препаратов, предназначенных для устных родов, таких как вакцина и антитела.
