בין האסטרטגיות השונות לייצור חלבון רקומביננטי בצמחים, ביטוי VERS על בסיס צמחי מפורק מספק ביצועים מעולים, מה שמוביל לתשואות גבוהות על פני מסגרת זמן קצרה יחסית. שכפול של טכנולוגיה זו לייצור חיסון אוראלי טומן בחובו פוטנציאל גדול להפוך לחלופה לחיסונים קונבנציונליים בעתיד הקרוב. עלי סלק אדומים Lyophilized טרנספורמציה ארעית צובר כמות של אנטיגנים צילום מתאים אינדוקציה סובלנות אוראלית במניעת סוכרת מסוג אחד.
פרוטוקול ניסיוני זה יכול להיות מורחב למינים אכילים רבים ושונים לאחר הערכה מקרה לגופו של הצטברות חלבון רקומביננטי. הדגמת ההליך תהיה אדוארדו ברתיני, מתיה סנטוני, אנה קוקורולו ורוברטה זמפיירי. כדי להתחיל בהליך זה, לגדל סלק אדום וצמחי תרד בתא צמיחה כמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לאחר נביטת זרעים, להפרות את הצמחים פעמיים בשבוע עם פתרון של דשן זמין מסחרית בריכוז של גרם אחד לליטר. למילוי אגרו-סינון, יש להשתמש בתרד בן חמישה שבועות ובצמחי סלק אדומים בני שישה שבועות. לאחר בניית וקטורים ביטוי הצמח, לחסן את שלושת טרנספורמנטים A.tumefaciens ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל ריפאמפיץ בריכוז של 50 מיקרוגרם למיליליטר ואנטיביוטיקה ספציפית וקטור כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
לגדול על ידי רועד לילה ב 28 מעלות צלזיוס. למחרת, גלולה תרבות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4500 פעמים G במשך 20 דקות. תן שימוש חוזר את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ חדירה המכיל 10 MES מילימולרית ו 10 מגנזיום גופרתי מילימולארי.
דגירה המתלים בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות. מערבבים נפח שווה של מתלה חיידקי המכיל את אחד המודולים המוצגים כאן, עם חמשת המודולים הראשיים ומודול האיטגרייס. באמצעות מזרק ללא מחט, להוציא חמישה מיליליטר של תערובת ההשעיה.
לחץ על קצה המזרק על החלק התחתון של עלה הצמח תוך הפעלת בעדינות נגד לחץ בצד השני של העלה. הסתננו לשלושת העלים המורחבים לחלוטין, החל מהעלים, עבור כל צמח. סמן את העלים המותנים עם תג הנייר על גזע העלה.
ואז להחזיר את הצמחים לתא הצמיחה בתנאים סטנדרטיים. בימים 4 עד 14 לאחר ההדבקה, לאסוף את העלים agroinfiltrated ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי. אחסן את רקמת הצמח במינוס 80 מעלות צלזיוס.
ראשית, לגדל בנפרד את שלושת טרנספורמנטים A.tumefaciens ב 50 מיליליטר של מדיום LB המכיל ריפאמפיצין בריכוז של 50 microliters למיליליטר, ואנטיביוטיקה ספציפית וקטור מתאים על ידי רועד לילה ב 28 מעלות צלזיוס. למחרת, גלולה תרבות חיידקים על ידי צנטריפוגה ב 4500 פעמים G במשך 20 דקות. תן את גלולה ב 1 ליטר של חיץ חדירה ל OD600 של 0.35, ולהדגיר את המתלים בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות.
לאחר מכן הוסף 0.01% של חומר הניקוי לכל השעיה. מערבבים נפח שווה של מתלה חיידקי המכיל את אחד המודולים המוצגים כאן עם חמשת המודולים הראשיים ומודול האיטגרייס. הכנס צמח סלק אדום אחד בן שישה שבועות למחזיק.
להפוך את המחזיק ולהמקם אותו על גבי מקור המכיל שני ליטרים של אמבטיית הסתננות כדי להטביע את העלים בהשעיית החדירה. לאחר מכן, להעביר את אמבטיית ההסתננות עם הצמח שקוע לתא החדירה ולסגור אותו. הפעל את משאבת ואקום ולפתוח את שסתום צריכת ואקום על תא החדירה.
ברגע שהלחץ בתא ירד ל-90 מ"מ, שמרו על הוואקום למשך שלוש דקות. ואז לשחרר את הוואקום במשך 45 שניות. כאשר התא חזר ללחץ אטמוספרי, פתח את התא והסר את הצמח שחדר מהאמבטיה החיידקית.
להחזיר את הצמח לתא הצמיחה. ביום הביטוי המקסימלי, לקצור את העלים הסתננו להקפיא אותם בחנקן נוזלי כפי שתואר קודם לכן. ראשית, לקצור את הדלתא agroinfiltrated ואקום 87 GAD65mut מבטא עלים סלק אדום בשיא הביטוי, ולהקפיא אותם בחנקן נוזלי.
ליופיליזציה של העלים הקפואים במינוס 50 מעלות צלזיוס וב-0.04 מיליבאר למשך 72 שעות. ואז לאחסן אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס. כאשר מוכנים להמשיך, טוחנים את העלים לאבקה דקה ומאחסנים בטמפרטורת החדר במיכל אטום עם ג'ל סיליקה כדי לא לכלול את הלחות.
לסימולציית עיכול הקיבה, שקלו 100 מיליגרם של עלי הסלק האדומים המיובשים בהקפאה עדינים, ותדלקו אותו מחדש בשישה מיליליטר של PBS. השתמש שש חומצה הידרוכלורית molar כדי להתאים את ה-pH מדגם לשניים. הוסף ארבעה מיליגרם למיליליטר פפסין מרירית קיבה חזירית, וחומצה הידרוכלורית 10 מילימולרית, כדי לקבל ריכוז פפסין סופי של מיליגרם אחד למיליליטר.
לנער את המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. לאחר מכן, השתמש נתרן הידרוקסיד כדי להתאים את ה- pH מדגם לשמונה ולהשבית את הפפסין. מעבירים 750 מיליליטר של כל דגימה לצינורות מיקרוצנטריפוגה, ומעבירים את האליקוטים ב-20,000 פעמים G וב-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
לאסוף כל על-טבעי בנפרד, ולתלות מחדש כל גלולה בנפח אחד על-טבעי של מאגר טעינה. ואז לנתח הן את supernatant ואת גלולה resuspended על ידי ניתוח כתם מערבי. לניתוח שלמות התא, הכינו שתי דגימות של 100 מיליגרם של עלי הסלק האדומים המיובשים בהקפאה, והתינו מחדש בשישה מיליליטר של PBS.
השתמש שישה חומצה הידרוכלורית molar כדי להתאים את ה- pH של מדגם אחד לשניים. לנער את שתי הדגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 120 דקות. ואז aliquot 750 microliters של כל מדגם לצינורות מיקרוצנטריפוגה.
צנטריפוגה ב 20, 000 פעמים G וב 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. לאסוף כל על-טבעי בנפרד, ולתלות מחדש כל גלולה בנפח אחד על-טבעי של מאגר טעינה. ואז לנתח הן את supernatant ואת גלולה resuspended על ידי ניתוח כתם מערבי.
ראשית, לשקול 100 מיליגרם של עלי סלק אדומים מיובשים בהקפאה דק, ו resuspend אותו בשמונה מיליליטר של PBS סטרילי. וורטקס לדקה אחת. צלחת מיליליטר אחד של כל הומוגניט עלה מיובש בהקפאה באחת מחמשת המדיה LB סלקטיבי מוכן.
דגירה הצלחות ב 28 מעלות צלזיוס במשך שלושה ימים. לאחר מכן, לספור את מושבות האגרובקטריום גדל על כל צלחת, ולחשב את המטען החיידקי שיורית כמספר המושבה להרכיב יחידות למיליליטר של הומוגונט עלה מיובש בהקפאה. בעבודה זו, חיסון אוראלי מפותח ברקמת צמח אכיל.
צמחי סלק ותרד אדומים הם agroinfiltrated באופן ידני עם השעיות של A.tumefaciens נושאת וקטורים ביטוי רקומביננטי EGFP, ואת ביטוי חלבון פלואורסצנטי הוא דמיינו על ידי ניתוח כתם מערבי וכמת תחת אור UV. מערכת הסלק האדומה מאופיינת בביטוי EGFP גבוה יותר, המגיע לכ-544 מיקרוגרם לגרם משקל עלים טריים בתשעה ימים לאחר ההדבקה, בעוד התרד הגיע לרמה מקסימלית של כ-113.4 מיקרוגרם לגרם משקל עלים טריים ב-11 ימים לאחר ההדבקה. מסיבה זו, הסלק האדום נבחר כמארח הביטויים עבור כל הניסויים הבאים.
לאחר מכן, צמחים חודרים לוואקום עם השעיה של איי-טופקינס. לאחר מיצוי TSP של עלי agroinfiltration, הדגימות מנותחות על ידי כתם מערבי, ואת החלבון רקומביננטי הוא לכמת יחסית על ידי ניתוח צפיפות. לבסוף, הפרמטרים לפיתוח חיסון אוראלי פוטנציאלי מוערכים.
כפי שניתן לראות כאן, חלבון היעד נראה יציב לאחר תהליך lyophilization. עיכול קיבה מדומה על ידי הוספת פפסין אנזים קיבה חזירי לחומר מיובש בהקפאה, או לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר, או יחס של 1 עד 20, ל- TSP. שני תנאי הטיפול במערכת העיכול גורמים להשפלה של החלבון הרקומביננטי.
היעדר אות ספציפי בדגימות גלולה לאחר עיכול פפסין עולה כי לאחר ייבוש הקפאה, תאי הצמח איבדו את שלמותם, וזה הוביל השפלה חלבון היעד. ההליך צריך להיות מותאם בקפידה למינים הצמחים ביחס לחדירת ואקום ולחלבון רקומביננטי היעד ביחס לניתוח קורס זמן. הליך ההדגמה עשוי לשמש גם לייצור ביופארמה המיועדת ללידה דרך הפה, כמו חיסון ונוגדנים.
