По сравнению с PSD фракции, можно определить синаптический белок, действующий на незрелые синапс вокруг дендритных филоподия богатых фракции. Мы использовали живой нейрон, чтобы вызвать образование фагоцитовой крышки. Основным преимуществом этой техники является то, что активный белок в искусственном генезисе может быть идентифицирован из дендритной филоподии богатой фракции.
Для начала приготовьте 200x витаминную смесь путем растворения 100 мг витамина B5, 100 мг холина хлорида, 100 мг фолиевой кислоты, 180 мг I-инозитол, 100 мг витамина В3, 100 мг соляного хлорида витамина В6 и 100 мг гидрохлорида тиамина в 500 мл ультрапурной воды с помощью магнитного мешалки. Тщательно перемешайте aliquot в 50 мл трубок и хранить его при 20 градусах по Цельсию. Чтобы подготовить раствор рибофлавина, растворите 100 мг рибофлавина в 500 мг ультрачистой воды с помощью магнитного мешалки.
Аккуратно перемешайте алицит в 50 мл трубок и храните при 20 градусах по Цельсию. Для приготовления одного молярного дихлорида кальция растворяют 7,35 грамма дигидрата хлорида кальция в 50 мл ультрапурной воды с помощью магнитного мешалки. Для минимального необходимого среднего препарата растворяют 400 мг хлорида калия 6, 800 мг хлорида содума, 2 200 мг бикарбоната натрия, 158 мг фосфатного дигидрата натрия, 7000 мг D-глюкозы и 200 мг гептагидрата сульфата магния и 950 мл ультрапурной воды с использованием магнитного мешалки.
Далее используйте 1 мл пипетки с постоянным возбуждением на магнитном мешалки, чтобы добавить 1,8 мл 1 дихлорида молярного кальция в MEM в капле образом. Затем добавьте соляную кислоту, чтобы настроить рН MEM до рН 7,25. Затем добавьте в MEM 5 мл витаминной смеси 200x и 200 микролитров раствора рибофлавина.
Отрегулируйте объем раствора до 1000 мл с помощью ультрачистой воды. Фильтровать раствор с помощью системы фильтрации 0,22 микрона и хранить его при 4 градусах цельсия. Для приготовления 10x DNase-1 растворение бульона растворяет 100 мг Dnase-1 в 12,5 мл HBSS.
Фильтр через фильтр 0,22 микрона, aliquot в 1,5 мл труб, и хранить трубки при 20 градусов по Цельсию. Для препарата бульона Ara-C растворяют 25 мг Ара-С в 8,93 мл ультрапурной воды. Фильтр через фильтр 0,22 микрона, aliquot в 1,5 мл труб, и хранить при 20 градусов по Цельсию.
Чтобы подготовить Plating Medium, смешать 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 микролитров 1 молярного HEPES, 1 мл B27, 125 микролитров 200 миллимолярный глутамин, 250 микролитров пенициллина-стрептомицина, 2,5 мл сыворотки плода крупного рогатого скота и 44,375 мл MEM в 50 мл трубки. Для приготовления стоп-среды смешайте 1 мл аминокислотного раствора MEM, 750 микролитров 1 моляра HEPES, 5 мл FBS и 43,25 мл MEM в 50 мл трубки. Для приготовления HBSS, дополненный 15 миллимолярной HEPES, смешайте 49,25 мл HBSS и 750 микролитров 1 молар hePES.
Для приготовления блюд с покрытием поли-л-лизина в течение одного дня при 25 градусах Цельсия высасыв 35 мм пластиковых клеток культуры блюд по 0,2 мг на мл гидробромида поли-л-лизина. Затем промойте посуду 2 мл ультрачистой воды три раза и инкубировать их 1,5 мл Stop Medium при 25 градусах по Цельсию до использования. Инкубировать расчлененный гиппокамп в смеси, содержащей 500 микролитров каждый из 2,5%трипсина и 10X Dnase-1 в HBSS дополняется 15 миллимолейных HEPES, рН 7,2, при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут с возбуждением каждые 3 минуты.
Затем перенесите гиппокамп на 10 мл стоп-медиума и инкубировать при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут, чтобы инактивировать трипсин. Затем инкубировать расчлененный гиппокамп в 10 мл свежей остановки среды при 4 градусах по Цельсию в течение 5 минут. Перемести гиппокампи в 10 мл свежей стоп-среды и инкубировать при 4 градусах по Цельсию еще 5 минут.
Затем перемести гиппокамп в 900 микролитров стоп-среды и 100 микролитров 10X Dnase-1 в 15 мл трубки. Используйте 1 мл пипетки, чтобы разобщить гиппокампа в изолированные нейроны путем пипетки 20 раз. Добавьте 9 мл покрытия среды и процедите через 70 микрон-клеточный ситечко в трубку 50 мл.
Подсчитайте количество клеток, использующих гемоцитометр, и отрегулируйте до 3,5 раз от 10 до четвертой клетки на миллилитр в среде покрытия. Далее, аспирировать стоп-среды из поли-л-лизин покрытием блюд. Плита 2 мл на тарелку клеток на покрытые посудой и инкубировать под 5%carbon диоксида при 37 градусах по Цельсию в течение 60-64 часов.
После инкубации добавьте 2 микролитера раствора бульона Ara-C в нейроны и встряхните блюдо медленно. Храните блюда культуры в увлажненной коробке без изменения среды культуры под 5%carbon dioxide при 37 градусах по Цельсию. Очистить дендритной филоподии богатой фракции после 13 дней в пробирке, сначала добавив три миллиона магнитных микробусов полистирола на блюдо до 20 блюд, содержащих культурные нейроны.
После одного дня, мыть нейроны в 1 мл PBS с агиацией три раза, чтобы удалить средние и несвегие микробусы. После удаления PBS, подлизать нейроны с 500 микролитров на блюдо из буфера лиза. Затем соберите лизат с помощью клеточного скребка и перенесите лизат в 10 микротрубок с низким содержанием белка.
Установите трубки на магнитный разделитель и подождите одну минуту. Соберите супернатант и использовать его в качестве несъегодной фракции для окрашивания серебра и западного анализа помарки. Затем перенесите шарики на новую микротрубку с низким содержанием белка и установите на магнитный отделитель на одну минуту.
Полностью удалите супернатант и добавьте 500 микролитров буфера лиза. Вымойте бисер с помощью смесителя Vortex в течение 15 секунд. Повторите мытье бисера 10 раз и удалите супернатант.
Elute белки вплоть до бисера путем добавления 50 микролитров 1X SDS образца буфера и варить трубку при 98 градусов по Цельсию в течение 5 минут. Центрифуга трубки при 860xG 3000 об/мин в течение 10 секунд и установить трубку на магнитный отделитель в течение одной минуты. Соберите супернатант и используйте его в качестве связанной фракции.
Измерьте концентрации неслых и связанных белковых фракций с помощью анализа белка BCA. Визуализуйте протиен решения с бромофенил-синим цветом и отрегулируйте концентрацию до 5 нанограмм на микролитер для страницы SDS. Разделите связанные и неограниченные фракции на странице SDS с помощью геля 5-20%градиента.
Серебряное пятно геля. Наконец, западная помарка использует соответствующие первичные и вторичные антитела согласно рукописи. В культурных гиппокампа нейронов, TLCN был обильно локализован в дендритных филоподии, вал, и сома и совместно локализованы с F-актина.
Закодированные бусы были в основном связаны с дендритами и индуцировать образование фагоцитических чашек путем накопления TLCN и F-актина на нейрональных дендритов. Thorecense изображения показали, что фагоцитическое образование чашки в решающей степени зависит от присутствия TLCN в дендритов. Фагоцитные чашки были сформированы только на диких нейронов гиппокампа типа, но не на TLCN defficient гиппокампа нейронов.
Результаты страницы SDS показали, что шаблоны белковой полосы были почти одинаковыми для неограниченных и связанных фракций, но интенсивности на уровне 50 и 70 килодальтон, в связанной фракции были ниже, чем в несыряемой фракции. Тем не менее, интенсивность полосы, очевидно, не отличается между неограниченными и связанными фракциями, подготовленными из гиппокампа TLCN defficient культуры нейронов. Западный анализ помарки несыхваченных и связанных фракций показал, что TLCN и VN были в основном обнаружены в связанной фракции.
Actin, Ezrin, G alpha q, PLC beta 1, MAP-2 и Spectrin были обнаружены как в связанных, так и в неограниченных фракциях. Моэзин, PSD-95, альфа-актинин и альфа-тубулин были обнаружены в нессорной фракции. Если белок покрытия микробусов меняется, эта процедура может быть применена для определения взаимодействия анализа.
Этот метод может определить белок, работающий на искусственных веществах. Таким образом, мы считаем, что механизм искусственного генезиса может быть количественно. Мы считаем, что новый белок, связанный с психическим расстройством, может быть идентифицирован из дендритной фильтродии богатой фракции.
И может быть распространена на терапию.
