Em comparação com a fração PSD, pode ser possível identificar a proteína sináptica agindo na sinapse imatura em torno da fração dendrítica rica em filopodia. Usamos neurônio vivo para induzir a formação de tampas fagocíticas. A principal vantagem dessa técnica é que a proteína ativa na gênese artificial poderia ser identificada a partir da fração rica em filopodia dendrítica.
Para começar, prepare o 200x Vitamin Mix dissolvendo 100 mg de Vitamina B5, 100 mg de Cloreto de Colina, 100 mg de Ácido Fólico, 180 mg de I-inositol, 100 mg de Vitamina B3, 100 mg de cloridrato de vitamina B6, e 100 mg de cloridrato de tiamina em 500 ml de água ultrapura usando um agitador magnético. Misture cuidadosamente a alíquota em tubos de 50 ml e armazene-a a 20 graus Celsius. Para preparar a solução riboflavina, dissolva 100 mg de riboflavina em 500 mg de água ultrapura usando um agitador magnético.
Misture cuidadosamente a alíquota em tubos de 50 ml e armazene a 20 graus Celsius. Para preparar um diclorito de cálcio molar dissolva 7,35 gramas de dihidrato de cloreto de cálcio em 50 ml de água ultrauso usando um agitador magnético. Para o mínimo essencial preparação média dissolver 400 mg de cloreto de potássio 6, 800 mg de cloreto de sodum, 2.200 mg de bicarbonato de sódio, 158 mg de dihidrato monobásico de fosfato de sódio, 7.000 mg de D-glicose, e 200 mg de heptahydrate de sulfato de magnésio, e 950 ml de água ultrapura, usando um agitador magnético.
Em seguida, use uma pipeta de 1 ml com uma agitação constante em um agitador magnético para adicionar 1,8 ml de 1 dicloreto de cálcio molar ao MEM de forma gota a gota. Em seguida, adicione ácido clorídrico para ajustar o pH do MEM ao pH 7.25. Em seguida, adicione 5 ml de mistura de vitaminas de 200x e 200 microliters de solução de riboflavina ao MEM.
Ajuste o volume do volume da solução para 1000 ml com água ultrapura. Filtre a solução usando um sistema de filtro de 0,22 míccro e armazene-a a 4 graus Celsius. Para preparar 10x solução de estoque DNase-1 dissolva 100 mg de Dnase-1 em 12,5 ml de HBSS.
Filtre através de um filtro de 0,22 mícrons, aliquot em tubos de 1,5 ml e armazene os tubos a 20 graus Celsius. Para a preparação da solução de estoque Ara-C dissolver 25 mg de Ara-C em 8,93 ml de água ultrapura. Filtre através de um filtro de 0,22 míccro, alíquota em tubos de 1,5ml e armazene a 20 graus Celsius.
Para preparar o Meio de Revestimento, misture 1 ml de SOLUÇÃO DE Aminoácido MEM, 750 microliters de 1 HEPES molar, 1 ml de B27, 125 microliters de 200 milimilous de glutamina, 250 microliters de penicilina-estreptomicina, 2,5 ml de Soro Bovino Fetal e 44,375 ml de MEM em um tubo de 50 ml. Para preparar o meio de parada, misture 1 ml de solução de aminoácido MEM, 750 microliters de 1 molar HEPES, 5 ml de FBS e 43,25 ml de MEM em um tubo de 50 ml. Para preparar o HBSS, suplementado com HEPES de 15 mililitros, misture 49,25 ml de HBSS e 750 microlitres de 1 molar HEPES.
Para a preparação de pratos revestidos de poli-l-lysina, cubra pratos de cultura de células plásticas de 35 mm com 0,2 mg por ml de hidrobromida poli-l-lysina por um dia a 25 graus Celsius. Em seguida, lave os pratos com 2 ml de água ultrauso três vezes e incuba-os com 1,5 ml de Stop Medium a 25 graus Celsius até usar. Incubar o hipocampi dissecado em uma mistura contendo 500 microliters cada um de 2,5% de trippsina e 10X Dnase-1 no HBSS suplementado com HEPES de 15 milimolares, pH 7.2, a 37 graus Celsius por 15 minutos com agitação a cada 3 minutos.
Em seguida, transfira o hipocampi para 10 ml do Stop Medium e incubar a 4 graus Celsius por 5 minutos para inativar a trippsina. Em seguida, incubar o hipocampi dissecado em 10 ml de meio de parada fresco a 4 graus Celsius por 5 minutos. Mova o hipocampi para 10 ml de stop médio fresco e incubar a 4 graus Celsius por mais 5 minutos.
Em seguida, mova o hipocampi para 900 microliters do meio stop e 100 microliters de 10X Dnase-1 em um tubo de 15 ml. Use uma pipeta de 1 ml para dissociar o hipocampi em neurônios isolados por pipetar 20 vezes. Adicione 9 ml de meio de revestimento e filtre através de um coador de células de 70 mn, em um tubo de 50 ml.
Conte o número de células usando um hemócito e ajuste para 3,5 vezes 10 para a quarta célula por mililitro em meio de revestimento. Em seguida, aspire o meio de parada dos pratos revestidos de poli-l-lisina. Placa 2 ml por prato das células nos pratos revestidos e incubar sob 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius por 60-64 horas.
Após a incubação, adicione 2 microliters de solução de estoque Ara-C aos neurônios e agite o prato lentamente. Mantenha os pratos da cultura em uma caixa umidificada sem alterar o meio cultural abaixo de 5% de dióxido de carbono a 37 graus Celsius. Purifique a fração rica de filopodia dendrítica após 13 dias in vitro adicionando primeiro três milhões de microesferas de poliestireno magnético por prato a 20 pratos contendo os neurônios cultivados.
Depois de um dia, lave os neurônios em 1 ml de PBS com agiação três vezes para remover as microesferas médias e desvinculados. Depois de remover a PBS, lise os neurônios com 500 microliters por prato do tampão de lise. Em seguida, colete o lysate com um raspador de células e transfira o lysate em 10 microtubos de ligação de proteínas baixas.
Coloque os tubos em um separador de ímãs e espere por um minuto. Colete o supernante e use-o como a fração desvinculada para coloração de prata e análise de manchas ocidentais. Em seguida, transfira as contas para um novo microtubo de ligação de baixa proteína e coloque em um separador magnético por um minuto.
Remova completamente o supernascer e adicione 500 microliters do tampão de lise. Lave as contas usando um misturador de vórtice por 15 segundos. Repita a lavagem das contas 10 vezes e remova o sobrenatante.
Proteínas elutos até as contas pela adição de 50 microliters de 1X SDS tampão de amostra e ferver o tubo a 98 graus Celsius por 5 minutos. Centrifugar o tubo a 860xG 3000 RPM por 10 segundos e definir o tubo em um separador magnético por um minuto. Colete o supernante e use-o como fração vinculada.
Medir concentrações das frações proteicas ilimitadas e vinculadas pelo ensaio proteico BCA. Visualize soluções de protien com azul bromofenil e ajuste a concentração para 5 nanogramas por microliter para página SDS. Separe as frações vinculadas e ilimitadas pela página SDS usando um gel de gradiente de 5-20%.
Mancha de prata o gel. Finalmente, a mancha ocidental usando anticorpos primários e secundários apropriados de acordo com o manuscrito. Em neurônios hipocampais cultivados, o TLCN foi abundantemente localizado para a filopodia dendrítica, eixo e soma e co-localizado com F-actin.
As contas codificadas eram principalmente ligadas aos dendritos e induzir a formação de copos fagocíticos por acúmulo de TLCN e F-actin em dendritos neuronais. Imagens thorecenses mostraram que a formação de copos fagocíticos dependia crucialmente da presença de TLCN em dendritos. Os copos fagocíticos só eram formados em neurônios hipocampais do tipo selvagem, mas não em neurônios hipocampais defucientes TLCN.
Os resultados das páginas da SDS mostraram que os padrões de banda de proteína eram quase os mesmos para as frações ilimitadas e vinculadas, mas as intensidades a 50 e 70 kilodalton, na fração vinculada eram menores do que as da fração não vinculada. No entanto, a intensidade da banda não era obviamente diferente entre as frações desvinculadas e ligadas preparadas a partir de neurônios hipocampais de cultura defucientes TLCN. A análise das manchas ocidentais das frações desvinculadas e vinculadas mostrou que tlcn e VN foram detectados principalmente na fração vinculada.
Actin, Ezrin, G alfa q, PLC beta 1, MAP-2 e Spectrin, foram detectados tanto nas frações vinculadas quanto não ligadas. Moesin, PSD-95, alfa-Actinin e alfa-Tubulin foram detectados na fração desvinculada. Se a proteína de revestimento das microesferas mudar, este procedimento pode ser aplicado para identificar a interação do ensaio.
Essa técnica poderia identificar a proteína que trabalha em substâncias artificiais. Então acreditamos que o mecanismo da gênese artificial pode ser quantificado. Acreditamos que novas proteínas associadas ao transtorno mental podem ser identificadas a partir da fração rica em filopodia dendrítica.
E pode ser estendido à terapia.
