Стандартный способ получить стволовую клетку из зубной пульпы является плохо эффективным, и это зависит от нескольких переменных. Наш протокол позволил добиться успешной изоляции стволовых клеток от обработанных зубов в 90% случаев. Получение большого количества клеток в течение нескольких недель является основным преимуществом.
Это позволяет нам использовать клетку в регенеративной медицине и создать биобанк, предоставляющий другим ученым этот полезный инструмент. Процедуру вскрытия зуба будет выполнять доктор Константино Сантакрос. Впоследствии протокол будет показан Стефано Martellucci, аспирант из моей лаборатории, который является первым автором статьи.
Для начала извлекайте третий моляр у пациента, быстро промойте его PBS, положите в 15-миллилитровую пробирку со средой и перенесите в лабораторию менее чем за два часа. Под биоопасным капюшоном используйте резак, чтобы открыть зуб коронным режут проходом, параллельным и касательным, через крышу целлюлозной камеры. С помощью небольшого экскаватора аккуратно удалите мякоть и поместите ее в пробирку.
Затем, мыть с PBS три раза, и центрифуга на 2500 раз г при комнатной температуре в течение 10 минут. После центрифугации удалите супернатант. Переусейте гранулы в растворе Хэнка и перенесите образец в чашку Петри.
Удалите раствор Хэнка центрифугой при температуре 2500 г при комнатной температуре в течение 10 минут. Затем, с одноразовым скальпелем, разделить мякоть примерно на один миллиметр ломтиками, и добавить один миллилитр коллагеназы типа IV. Затем центрифуга образца в 2500 раз г при комнатной температуре в течение 10 минут.
Удалите супернатант и повторно посовелите гранулы в среде. Культура его в колбе T25 специфически для стволовых клеток при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа. В инкубационный период меняются среды культуры каждые три дня.
Как только адепт клетки достигают слияния, добавить один миллилитр трипсина-ЭДТА раствор для клеток, чтобы отделить их, и инкубировать клетки при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут. Затем добавьте четыре миллилитров среды культуры в соотношении один к пяти, чтобы остановить действие трипсина, и центрифуга клеточной подвески в 259 раз g в течение шести минут. Удалите супернатант.
Затем поместите клетки в колбу T25 для распространения. Затем отсоедините клетки одним миллилитром трипсина-ЭДТА при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут. Центрифуга клеточной суспензии при 259 раз г в течение шести минут.
Удалите супернатант и приступайте к тестированию клеток на цитофториметрический анализ. Для выполнения переходного шага замалчивания прионового белка, сначала культура человеческих стоматологических стволовых клеток целлюлозы в шести-хорошо пластин с двумя миллилитров среды культуры в течение 24 часов. Затем добавьте 400 микролитров небольшой интерфуляторов РНК PrP среды к каждому образцу, и инкубировать их при 37 градусах по Цельсию в течение шести часов.
Не отбрасывая siRNA PrP среды, добавить 1,6 миллилитров среды культуры в соотношении один к пяти, и оставить клетки на 37 градусов по Цельсию в течение 72 часов. После инкубации период, удалить супернатант, и мыть клетки с двумя миллилитров PBS три раза при комнатной температуре. Затем добавьте два миллилитров среды нейронной культуры и держите клетки в течение семи-14 дней в инкубаторе при 37 градусах Цельсия.
После инкубационного периода, мыть клетки с двумя миллилитров PBS три раза при комнатной температуре, и приступить к анализу западной помарки для проверки на антигены поверхности нейронов. Для выполнения процесса индукции нейронов, культура 2 миллиона человеческих стоматологических стволовых клеток целлюлозы в шести-хорошо пластин, до 28 дней от разделения пульпы. Каждые три дня выбрасывайте супернатант.
Вымойте три раза с двумя миллилитров PBS при комнатной температуре, и заменить два миллилитров нейронной культуры среды. Через 7-14 дней отсоедините клетки одним миллилитром трипсина-ЭДТА при 37 градусах Цельсия в течение трех минут. Затем добавьте четыре миллилитров среды культуры в соотношении один к пяти, чтобы остановить действие трипсина.
Чтобы охарактеризовать стволовые клетки пульпы человека по цитометрии потока, культура 2 миллиона на миллилитр клеток в шести-хорошо пластин с двумя миллилитров среды культуры. На 28 дней после стоматологического разделения целлюлозы или после дополнительных 14 дней с нейронной культуры среды, добавить один миллилитр трипсина-ЭДТА при 37 градусов по Цельсию в течение трех минут, чтобы отделить клетки. Затем добавьте четыре миллилитров среды культуры в соотношении один к пяти, чтобы остановить действие трипсина, и центрифугат при 259 раз g при комнатной температуре в течение шести минут.
Исправить необработанные или обработанные клетки с 300 микролитров 4%paraformaldehyde в PBS при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут. Далее, центрифуга, отбросить супернатант, и permeabilize клеток с 1%non-ionic сурфактант в PBS при комнатной температуре в течение еще 10 минут. Затем, центрифуга снова, отказаться от супернатанта, и выполнить блокирование с 5%обезжиренного сухого молока в одном миллилитров PBS при комнатной температуре в течение одного часа.
Вымойте три раза с одним миллилитром PBS, и инкубировать клетки с анти-CD105, анти-CD44, анти-STRO-1, анти-CD90, анти-CD73, анти-бета-три-тубулин, анти-NFH, и анти-GAP43 моноклональных антител при комнатной температуре в течение одного часа. Далее, центрифуга клетки снова три раза подряд с одним миллилитров PBS с шестиминутными интервалами, а затем инкубировать с анти-мышь PE или анти-кролик CY5 моноклональных антител при комнатной температуре в течение одного дополнительного часа. Используйте вторичные антитела для gating иммунно-положительных клеток, и проанализировать все образцы с потоком цитометра.
Культура 2 миллиона клеток на миллилитр стволовых клеток зубной пульпы человека в шести-хорошо пластин с двумя миллилитров культуры среды. На 21 и 28 дней после стоматологического разделения целлюлозы или после дополнительных семи до 14 дней со средой нейрональной культуры, добавить один миллилитр трипсина-ЭДТА при 37 градусах по Цельсию в течение трех минут, чтобы отделить клетки. Затем центрифуга, отбросить супернатант, а затем исправить образцы с 4%paraformaldehyde в PBS при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Далее, центрифуга, отбросить супернатант, а затем проницать с 1%non-ionic сурфактант в PBS при комнатной температуре в течение 10 минут. Удалить супернатант, и пятно клеток с кроликом анти-PrP моноклональных антител при комнатной температуре в течение одного часа. Наконец, центрифуга, отказаться от супернатанта, а затем инкубировать с анти-кролик CY5 моноклональных антител при комнатной температуре в течение дополнительного часа.
Проанализируйте все образцы с помощью цитометра потока. После разделения пульпы на периферии были расширены кластеры стволовых клеток зубной пульпы человека. Сравнение роста этих клеток до и после нейронной дифференциации, вызванной EGF/bFGF, показало значительные изменения в клеточной морфологии и нароитах.
Необработанные стволовые клетки зубной пульпы человека выражали многопотентные мезенхимальные стромальные специфические поверхностные антигены, такие как CD44, CD90, CD105, CD73 и STRO-1. После соответствующих стимулов индукции нейронов, эти клетки выразили конкретные нейронные маркеры, такие как бета-три тубулина, NFH, и GAP43. Необработанные или обработанные клетки не выражали гематопоэтических маркеров, таких как CD14 и CD19.
После 28 дней, прионный белок был преждевременно выражен в стволовых клетках зубной пульпы человека по сравнению с соответствующим отрицательным контролем, и его экспрессия была увеличена после процесса дифференциации нейронов, индуцированного EGF/bFGF. Западный анализ помарки показал что глушить протеин prion sRNA перед стимулами EGF/bFGF смог повлиять на процесс дифференциации нейронов людских зубовчатых стволовых клеток пульпы путем предотвращать выражение нейрональных маркеров бета-три-тубулин и NHF. Самое главное – это выбор фермента для отделять клетки от пульпы.
В самом деле, если фермент слишком агрессивным, клетки могут быть повреждены и их рост и дифференциация способность может быть скомпрометирована. Стволовые клетки зубной пульпы являются отличной экспериментальной моделью, которая может быть использована в исследованиях in vivo и in vitro в области регенеративной медицины. Так как PrP играет ключевую роль в процессе дифференциации нейронов стволовых клеток зубной пульпы, этот маркер может быть отличным кандидатом в качестве эффективной мишени при нейродегенеративных заболеваниях.
Наиболее важным аспектом консультирования является состояние здоровья пациентов, например, отсутствие инфекционных заболеваний.
