歯髄から幹細胞を得るための標準的な方法は効率が悪く、これはいくつかの可変に依存する。我々のプロトコルは、症例の90%で治療された歯から幹細胞の正常な分離を得ることを可能にした。数週間で多数の細胞を得ることが主な利点です。
これにより、細胞を再生医療に使用し、他の科学者にこの有用なツールを提供するバイオバンクを作成することができます。歯を開くための手順は、コンスタンティノサンタクローチェ博士によって行われます。その後、このプロトコルは、記事の最初の著者である私の研究室の博士課程の学生、ステファノ・マルテルッチによって示されます。
まず、患者から3番目の大臼歯を抽出し、PBSで素早くリンスし、培地と一緒に15ミリリットルの試験管に入れ、2時間以内に実験室に移します。バイオハザードフードの下で、カッターを使用して、パルプチャンバーの屋根を通って平行で接線のコロナ切断パスで歯を開きます。小さな掘削機で、パルプを静かに取り外し、試験管に入れてください。
次いで、PBSを3回洗浄し、遠心分離機を室温で2、500倍に10分間洗浄した。遠心分離後、上清を取り除く。ハンクの溶液中のペレットを再び懸濁し、ペトリ皿にサンプルを移します。
ハンクの溶液を室温で2、500倍のgで10分間遠心分離して取り除きます。その後、使い捨てのメスで、パルプを約1ミリメートルのスライスに分け、IV型コラゲターゼを1ミリリットル加えます。次に、試料を室温で2、500倍gで10分間遠心する。
上清を取り除き、培地中のペレットを再懸濁する。T25フラスコで、5%の二酸化炭素で摂氏37度の幹細胞に特異的な培養を行います。インキュベーション期間中、3日毎に培地を交換する。
接着細胞が合流したら、トリプシン-EDTA溶液を1ミリリットル加えて細胞を取り外し、37°Cで3分間培養します。次に、トリプシン作用を停止するために1対5の比率で培養培地を4ミリリットル加え、細胞懸濁液を259回gで6分間遠心する。上清を取り除く。
次に、細胞をT25フラスコに入れて伝播します。その後、トリプシン-EDTAを1ミリリットルのトリプシン-EDTAで37°Cで3分間取り外します。細胞懸濁液を259回gで6分間遠心分離する。
上清を取り除き、細胞の試験に進みます。一過性プリオンタンパク質サイレンシング工程を行うために、まずヒト歯髄幹細胞を2ミリリットルの培養培地を用いた6ウェルプレートで24時間培養する。次に、各サンプルに400マイクロリットルの小さな干渉RNA PrP培地を加え、摂氏37度で6時間インキュベートします。
siRNA PrP培地を廃棄せずに、1対5の比率で1.6ミリリットルの培養培地を添加し、細胞を摂氏37度で72時間放置する。インキュベーション期間の後、上清を取り除き、室温で2ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄する。次に、2ミリリットルの神経培養培地を加え、細胞を37°Cのインキュベーターに7〜14日間保持する。
インキュベーション期間の後、室温で2ミリリットルのPBSで細胞を3回洗浄し、ウェスタンブロット分析に進み、神経表面抗原を検査します。神経伝達過程を行うために、6ウェルプレートで200万個のヒト歯髄幹細胞を培養し、パルプ分離から最大28日を行う。3日ごとに上清を捨てる。
室温でPBSを2ミリリットルで3回洗浄し、2ミリリットルの神経培養培地を交換する。7~14日後、トリプシン-EDTAを1ミリリットルのトリプシン-EDTAで37°Cで3分間取り外します。次いで、トリプシン作用を停止させるために1対5の比率で培養培地の4ミリリットルを加える。
フローサイトメトリーによりヒト歯髄幹細胞を特徴付けるために、培養液を2ミリリットルの培養液で6ウェルプレートに2ミリリットル培養する。歯髄分離後28日または神経細胞培養培地でさらに14日後に、トリプシン-EDTAの1ミリリットルを摂氏37度で3分間加えて細胞を剥離する。次に、トリプシン作用を停止するために1対5の比率で培養培地を4ミリリットル加え、室温で259倍gの遠心分離物を6分間加える。
PBSで4%パラホルムアルデヒドの300マイクロリットルで未処理または処理された細胞を摂氏4度で10分間固定します。次に、遠心分離機を、上清を捨て、PBSで1%非イオン性界面活性剤を1%で透過させ、さらに10分間室温で培養した。次いで、再度遠心分離機を、上清を捨て、室温で1ミリリットルのPBSで5%ノンファットドライミルクでブロッキングを1時間行う。
PBSを1ミリリットルで3回洗浄し、抗CD105、抗CD44、抗STRO-1、抗CD90、抗CD73、抗ベータ3チューブリン、抗NFH、抗GAP43モノクローナル抗体を室温で1時間インキュベートします。次に、6分間間隔でPBSを1ミリリットルで細胞を3回連続して遠心分離し、次に抗マウスPEまたは抗ウサギCY5モノクローナル抗体を室温で1時間追加でインキュベートする。免疫陽性細胞を測定するための二次抗体を使用し、フローサイトメーターですべてのサンプルを分析します。
培養培地2ミリリットルの6ウェルプレートにヒト歯髄幹細胞の1ミリリットル当たり200万個の細胞を培養する。歯髄分離後21日および28日、または神経細胞培地でさらに7〜14日後に、トリプシン-EDTAの1ミリリットルを摂氏37度で3分間加えて細胞を剥離する。次いで、遠心分離機を、上清を捨て、その後、PBSで4%パラホルムアルデヒドを10分間摂氏4度で固定します。
次に、遠心分離機を、上清を捨て、次いでPBSで1%非イオン性界面活性剤を室温で10分間透過させた。上清を取り除き、ウサギの抗PrPモノクローナル抗体を室温で1時間染色します。最後に、遠心分離機を、上清を捨て、次に抗ウサギCY5モノクローナル抗体を室温で1時間インキュベートする。
フローサイトメーターですべてのサンプルを分析します。パルプ分離後、ヒト歯髄幹細胞のクラスターが周辺に拡大した。EGF/bFGFによって誘導されるニューロン分化前後のこれらの細胞の増殖の比較は、細胞形態および神経突起の成長に有意な変化を示した。
未治療ヒト歯髄幹細胞は、CD44、CD90、CD105、CD73、STRO-1などの多能性間葉間質比表面抗原を発現した。適切な神経誘導刺激の後、これらの細胞はβ-3-チューブリン、NFH、GAP43などの特定のニューロンマーカーを発現した。未処理または処理細胞は、CD14およびCD19のような造血マーカーを発現しなかった。
28日後、プリオンタンパク質は、対応する陰性対照と比較してヒト歯髄幹細胞で初期発現し、EGF/bFGFによって誘導された神経細胞分化プロセスの後にその発現を増加した。ウェスタンブロット分析は、EGF/bFGF刺激の前にsRNAによってプリオンタンパク質をサイレンシングすることは、ニューロンマーカーβ-3チューブリンおよびNHFの発現を防ぐことによってヒト歯髄幹細胞の神経分化プロセスに影響を及ぼす可能性があることを示した。最も重要なことは、パルプから細胞を分離する酵素の選択です。
実際、酵素があまりにも積極的な場合、細胞が損傷し、その成長と分化能力が損なわれる可能性があります。歯髄幹細胞は、再生医療分野で生体内およびインビトロ研究で採用できる優れた実験モデルです。PrPは歯髄幹細胞の神経分化過程において重要な役割を果たすため、このマーカーは神経変性疾患における有効な標的として優れた候補となる可能性がある。
最も重要な点は、感染症の存在など、患者の健康状態です。
