Благодаря своей высокой эффективности, этот метод может способствовать дальнейшему развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, или IPSCs в качестве инструмента для изучения заболеваний человека и разработки новых методов лечения стволовыми клетками. Основным преимуществом этого протокола является способность генерировать высококачественную интеграцию свободных IPSCs из первичных фибробластов человека, включая трудно перепрограммировать, связанные с болезнью, в возрасте, и старческие фибробласты. Успех этого метода зависит от оптимальной эффективности РНК-трансфекции фибробластов.
И корректировка рН буфера трансфекции является ключевой процедурой для достижения этой цели. Для начала подготовьте буфер трансфекции с помощью 500 миллилитров и 100 миллилитров комнатной температуры предварительно разогретых бутылок свежей пониженной среды сыворотки. Измерьте базовый рН среды в бутылке 500 миллилитров, вставив стеклянный электрод счетчика рН в буфер, и подождите до одной минуты, прежде чем читать рН.
Чтобы настроить рН, добавьте три-четыре миллилитров одного гидроксида молярного натрия в бутылку 500 миллилитров. Закройте бутылку и хорошо перемешайте. Прождя пять минут, откройте бутылку и вставьте электрод рН метра в буфер.
Подождите, пока показания на рН метр стабилизируется. Продолжайте добавлять небольшие объемы одного гидроксида молярного натрия до тех пор, пока рН не достигнет 8,15 до 8,17, убедившись, что калибровать рН метр несколько раз в ходе процесса. Используйте вакуумную систему фильтрации 0,22 микрометра для фильтрации стерилизации буфера трансфекции.
Aliquot стерилизованный буфер в пять миллилитров труб с минимальным воздушным пространством. Убедитесь, что фибробласты, которые будут перепрограммированы находятся на 40%-60% слияния. Перенесите четыре миллилитров DPBS в 15 миллилитровую коническую трубку и добавьте 100 микролитров рекомбинантного человеческого ламинина 521.
Тщательно смешайте, трубя вверх и вниз. Добавьте один миллилитр на скважину разбавленного рекомбинантного человеческого ламинина 521 в три колодца из шести колодцев. Инкубировать эту пластину с покрытием при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.
Во время этой инкубации, теплые шесть миллилитров фибробластовой среды расширения и четыре миллилитров покрытия среднего до 37 градусов по Цельсию. Дополнить покрытие среды с базовым FGF при конечной концентрации 100 нанограмм на миллилитр и B18R при окончательной концентрации 200 нанограмм на миллилитр. Тщательно аспирировать оттраченную среду из фибробластов, которые находятся на 40%-60% слияния.
Промыть клетки пятью миллилитров DPBS. Добавьте три миллилитров трипсина EDTA и аккуратно раскачивайте пластину, чтобы покрыть клетки трипсином EDTA. Аспирировать избыток жидкости, оставляя около 500 микролитров трипсина, и инкубировать фибробласты в течение трех минут при 37 градусов по Цельсию.
После удаления пластины из инкубатора, твердо, но осторожно нажмите сторону пластины, чтобы выбить клетки. Просмотрите клетки под микроскопом, чтобы проверить, были ли они отделены. Добавьте пять миллилитров среды расширения фибробластов к отдельным клеткам, чтобы нейтрализовать трипсин EDTA.
Соберите клетки в 15 миллилитровой конической трубки и хорошо перемешайте их. Подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра, затем пипетки 12 000 клеток в четыре миллилитров предварительно подготовленного предварительно разогретого покрытия среды. После удаления покрытой пластины из инкубатора, аспирировать разбавленный ламинин 521 из скважин, убедившись, что поверхность скважин не высохнет.
Аккуратно resuspend клетки, которые находятся в покрытие среды и добавить один миллилитр клеточной подвески в каждом покрытием хорошо. Поместите потроханые клетки в трех газа ткани культуры инкубатор с низким содержанием кислорода или кислорода установлен на 5%, а затем осторожно, но тщательно разогнать клетки, чередуясь между вверх вниз, то левое правое движение, и повторить движения еще два раза, убедившись, что не закружить пластину. Инкубировать клетки на ночь.
Между тем, добавить четыре миллилитров перепрограммирования среды до 15 миллилитров конической трубки, и поместите его в низкий O два инкубатора с ослабленной крышкой для равновесия на ночь. По крайней мере за час до трансфекции удалите равноуливную среду перепрограммирования из низкого инкубатора O 2. Добавьте bFGF к окончательной концентрации 100 нанограмм на миллилитр, и B18R к окончательной концентрации 200 нанограмм на миллилитр, и хорошо перемешать.
Работая по одному хорошо за один раз, используйте один миллилитр пипетки для удаления оттраченной среды. И заменить его на один миллилитр перепрограммирования среды, дополненной bFGF и B18R. Перемести тарелку с клетками обратно в инкубатор с низким содержанием кислорода.
Чтобы начать фибробластовую трансфекцию, сначала эквилибруйте алицит буфера трансфекции примерно на один час при комнатной температуре. Удалите один 33 микролитер aliquot модифицированных MRNA и 14 микролитер aliquot МИРНА имитирует от отрицательных 80 градусов по Цельсию, и тепло их до комнатной температуры в течение примерно трех-пяти минут до оттаивания. Спин их вниз кратко в микрофуге.
Разогреть реагент трансфекции до комнатной температуры в течение примерно трех-пяти минут. Переверните трубку два-три раза, чтобы смешать реагент и спина его вниз кратко в микрофуге. Перенесите 279 микролитров буфера трансфекции комнатной температуры в бесплатную микроцентрифуговую трубку РНК и добавьте 31 микролитер трансфектного реагента.
Тщательно смешайте с помощью труб и инкубировать при комнатной температуре в течение одной минуты. Добавьте 132 микролитров буфера трансфекции комнатной температуры в 33 микролитера алицита модифицированной MRNA и аккуратно пипетку для смешивания. Добавьте 102,6 микролитров буфера трансфекции комнатной температуры к 14 микролитровому алициту MIRNA и аккуратно пипетке для смешивания.
Для подготовки трансфекции смесь модифицированных MRNA, добавить 165 микролитров 310 микролитров трансфекции буфера, трансфекции реагента смесь 165 микролитров буфера трансфекции, модифицированные смеси MRNA. Пипетт смешивать. Для подготовки трансфекции смесь MIRNA имитирует, добавить 116,6 микролитров 310 микролитера трансфекции буфера, трансфекции реагент смесь 116,6 микролитера трансфекции буфера, MIRNA имитировать смесь.
Хорошо перемешать и инкубировать в течение 15 минут при комнатной температуре, чтобы позволить буфер трансфекции в комплекс с модифицированными MRNAAs и MIRNA имитирует. Удалите пластину с клетками из инкубатора с низким содержанием кислорода. Падение мудрым через каждый колодец, добавить 100 микролитров на колодец трансфекции смесь, содержащая сложные, модифицированные MRNAs.
Аккуратно, но тщательно агитировать пластины с вверх вниз, а затем левое правое движение, чтобы разогнать трансфекции комплексов. Добавить 66,7 микролитров на колодец трансфекции смесь, содержащая сложные MIRNA имитирует падение мудрым через каждую хорошо. Аккуратно, но тщательно агитировать пластины с вверх вниз, а затем левое правое движение, чтобы разогнать трансфекции комплексов.
Поместите пластину с трансфицированными клетками в трех газ-инкубатор с низким содержанием кислорода. Разогнать трансфекции комплексов, мягко, но тщательно агитирует пластины с вверх вниз, а затем влево вправо движения. Инкубировать трансфицированные клетки в инкубаторе в течение 16 до 20 часов, прежде чем изменить средний на следующий день.
Добавить четыре миллилитров перепрограммирования среды до 15 миллилитров конической трубки, и поместите его в низком O два инкубатора с ослабленной крышкой для равновесия на ночь. На следующее утро замените трансфекцию, содержащую медиум, на свежую предварительно уравновешенную среду, дополненную bFGF и B18R, и продолжайте режим трансфекции, описанный в протоколе. После успешного покрытия в колодец из шести хорошо формате блюдо для перепрограммирования, фибробласты появились очень редки.
Через 24 часа после первой успешной трансфекции фибробласты потеряли свою форму шпинделя и приняли более округлую морфологию. На протяжении первых трех трансфекций плотность клеток постепенно и последовательно увеличивалась с явным всплеском пролиферации, происходящим между днями семь и восемь. К 10-й день клетки оказались в значительной степени стеченными.
Первые колонии IPSC появились уже в 11-й день. С 15 по 17 дней колонии IPSC стали большими и очевидными и четко отличными от окружающих и полностью перепрограммированных фибробластов. Иммуностинтирование маркера плюрипотентности TRA-1-60 подтвердило высокую эффективность перепрограммирования.
Плотность неоптимального покрытия является наиболее распространенной причиной снижения эффективности перепрограммирования в этом протоколе. Если плотность покрытия была слишком низкой, появились большие ацеллюлярные патчи барона и не образуются колонии IPSC. После разбавления прохождения перепрограммированных клеток, IPSCs вырос как одиночные колонии и были легко отличить от фибробластов.
Они были слабо упакованы и отдельные клетки имели относительно большую цитоплазмическую область. В течение четырех-семи дней IPSCs размножались и образовы были характерной плотно упакованной колонией с определенными краями. Индивидуальные клетки внутри колонии показали большую ядерную фракцию с выдающимися нуклеолами.
После перепрограммирования фибробластов пациента, в результате IPSCs могут быть дифференцированы в различные соматические клетки для того, чтобы прояснить болезни, вызывающие механизмы или разработать новые регенеративные терапии на основе клеток.
