Debido a su alta eficiencia, este método puede avanzar aún más las células madre pluripotentes inducidas, o IPSC como una herramienta para estudiar enfermedades humanas y desarrollar nuevas terapias con células madre. La principal ventaja de este protocolo es la capacidad de generar IPSC libres de integración de alta calidad a partir de fibroblastos humanos primarios, incluidos fibroblastos humanos difíciles de reprogramar, asociados a enfermedades, envejecidos y senescentes. El éxito de este método depende de la eficiencia óptima de la transfección de ARN de los fibroblastos.
Y ajustar el pH de un búfer de transfección es un procedimiento clave para lograrlo. Para empezar, prepare el tampón de transfección utilizando 500 mililitros y 100 mililitros de botellas precalientes a temperatura ambiente de medio sérico fresco reducido. Mida el pH base del medio en una botella de 500 mililitros insertando el electrodo de vidrio del medidor de pH en el tampón y espere hasta un minuto antes de leer el pH.
Para ajustar el pH, agregue de tres a cuatro mililitros de un hidróxido de sodio molar en una botella de 500 mililitros. Cierre bien la botella y mezcle bien. Después de esperar cinco minutos, abra la botella e inserte el electrodo del medidor de pH en el tampón.
Espere hasta que la lectura del medidor de pH se estabilice. Continúe agregando pequeños volúmenes de un hidróxido de sodio molar hasta que el pH alcance 8.15 a 8.17, asegurándose de calibrar el medidor de pH varias veces durante el proceso. Utilice un sistema de filtración por vacío de 0,22 micrómetros para filtrar la esterilización del búfer de transfección.
Aliquot el tampón esterilizado en tubos de cinco mililitros con un espacio de aire mínimo. Verifique que los fibroblastos a reprogramar estén al 40% a 60% de confluencia. Transfiera cuatro mililitros de DPBS a un tubo cónico de 15 mililitros y añada 100 microlitros de laminin humana recombinante 521.
Mezcle bien en pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Añadir un mililitro por pozo de laminin humana recombinante diluido 521 en tres pozos de una placa de seis pozos. Incubar esta placa recubierta a 37 grados centígrados durante dos horas.
Durante esta incubación, calienta seis mililitros de medio de expansión de fibroblastos y cuatro mililitros de chapado de medio a 37 grados centígrados. Complementar el medio de chapado con FGF básico a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro y B18R a una concentración final de 200 nanogramos por mililitro. Aspirar cuidadosamente el medio gastado de fibroblastos que están en 40%a 60% de confluencia.
Enjuague las células con cinco mililitros de DPBS. Agregue tres mililitros de trippsina EDTA y sacude suavemente la placa para cubrir las células con trippsina EDTA. Aspirar el exceso de líquido, dejando aproximadamente 500 microlitros de tripina, e incubar los fibroblastos durante tres minutos a 37 grados centígrados.
Después de retirar la placa de la incubadora, toque firmemente pero cuidadosamente el lado de la placa para desalojar las células. Vea las células bajo el microscopio para comprobar si se han desprendido. Añadir cinco mililitros de medio de expansión de fibroblastos a las células separadas para neutralizar la trippsina EDTA.
Recoger las células en un tubo cónico de 15 mililitros y mezclarlas bien. Cuente las células utilizando un hemocicómetro, luego pipetee 12.000 células en cuatro mililitros de medio de chapado precalentado previamente preparado previamente. Después de retirar la placa recubierta de la incubadora, aspirar laminina diluida 521 de los pozos, asegurándose de que la superficie de los pozos no se seque.
Resuspender suavemente las células que están en el medio de chapado y añadir un mililitro de suspensión celular en cada pozo recubierto. Coloque las células chapadas en una incubadora de cultivo de tejido tri-gas con bajo oxígeno o oxígeno establecido en 5%Y luego disperse suavemente pero a fondo las células alternando entre un movimiento hacia abajo, luego hacia la izquierda a la derecha, y repita los movimientos dos veces más, asegurándose de no girar la placa. Incubar las células durante la noche.
Mientras tanto, agregue cuatro mililitros de medio de reprogramación a un tubo cónico de 15 mililitros, y colóquelo en la incubadora baja O dos con una tapa aflojada para equilibrar durante la noche. Al menos una hora antes de la transfección, retire el medio de reprogramación equilibrado de una incubadora de O dos baja. Añadir bFGF a una concentración final de 100 nanogramos por mililitro, y B18R a una concentración final de 200 nanogramos por mililitro, y mezclar bien.
Trabajando uno bien a la vez, utilice una pipeta de un mililitro para eliminar el medio gastado. Y reemplazarlo con un mililitro de medio de reprogramación, complementado con bFGF y B18R. Mueva la placa con células de nuevo a la incubadora de oxígeno bajo.
Para iniciar la transfección de fibroblastos, primero equilibre una alícuota del tampón de transfección durante aproximadamente una hora a temperatura ambiente. Retire una sola alícuota de 33 microlitros de LOS MRNA modificados y 14 microlitros alícuotas de MIRNA de 80 grados centígrados negativos, y calientela a temperatura ambiente durante aproximadamente tres a cinco minutos hasta que se descongele. Gire brevemente hacia abajo en un microfugo.
Caliente el reactivo de transfección a temperatura ambiente durante aproximadamente tres a cinco minutos. Invierta el tubo de dos a tres veces para mezclar el reactivo y girarlo brevemente en un microfuge. Transfiera 279 microlitros del tampón de transfección a temperatura ambiente a un tubo de microcentrífuga libre de ARN, y agregue 31 microlitros del reactivo de transfección.
Mezclar bien en pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante un minuto. Agregue 132 microlitros del tampón de transfección a temperatura ambiente a la alícuota de 33 microlitros de MRNA modificada, y pipetee suavemente para mezclar. Agregue 102,6 microlitros del tampón de transfección a temperatura ambiente a la alícuota de 14 microlitros de imitaciones MIRNA y pipetee suavemente para mezclar.
Para preparar la mezcla de transfección de MRNA modificada, añada 165 microlitros del tampón de transfección de 310 microlitros, mezcla de reactivos de transfección a 165 microlitros del tampón de transfección, mezcla MRNA modificada. Pipeta para mezclar. Para preparar la mezcla de transfección de imitaciones MIRNA, agregue 116,6 microlitros del tampón de transfección de 310 microlitros, mezcla de reactivos de transfección al tampón de transfección de 116,6 microlitros, mezcla de milfiga MIRNA.
Mezclar bien e incubar durante 15 minutos a temperatura ambiente para permitir que el tampón de transfección se complexe con los MRNA modificados y las imitaciones MIRNA. Retire la placa con células de la incubadora de bajo oxígeno. Suelte sabiamente cada pozo, agregue 100 microlitros por pozo de la mezcla de transfección que contiene los MRNAs complejos y modificados.
Agitar suavemente pero a fondo la placa con un movimiento hacia arriba hacia abajo, luego el movimiento izquierdo a la derecha para dispersar los complejos de transfección. Añadir 66,7 microlitros por pozo de la mezcla de transfección que contiene las imitaciones MIRNA complejas caen sabiamente en cada pocero. Agitar suavemente pero a fondo la placa con un movimiento hacia arriba hacia abajo, luego el movimiento izquierdo a la derecha para dispersar los complejos de transfección.
Coloque la placa con las células transfectantes en la incubadora de tres gases con poco oxígeno. Disperse los complejos de transfección agitando suavemente pero a fondo la placa con un movimiento hacia arriba hacia abajo y luego hacia la izquierda a la derecha. Incubar las células trans infectadas en la incubadora durante 16 a 20 horas antes de cambiar de medio al día siguiente.
Añadir cuatro mililitros de medio de reprogramación a un tubo cónico de 15 mililitros, y colóquelo en la incubadora baja O dos con una tapa aflojada para equilibrar durante la noche. A la mañana siguiente, sustituya el medio de transfección que contiene por el medio preequilibrio fresco complementado con bFGF y B18R y continúe con el régimen de transfección descrito en el protocolo. Después de un éxito en un pozo de un plato de seis formatos de pozo para la reprogramación, los fibroblastos parecían muy escasos.
24 horas después de la primera transfección exitosa, los fibroblastos perdieron la forma de su husillo y adoptaron una morfología más redondeada. A lo largo de las tres primeras transfeccións, la densidad celular aumentó gradualmente y consistentemente con una aparente ráfaga de proliferación que ocurre entre los días siete y ocho. Para el día 10, las células aparecieron en gran medida confluentes.
Las primeras colonias del IPSC aparecieron ya en el día 11. En los días 15 a 17, las colonias de IPSC se volvieron grandes y obvias y claramente distintas de los fibroblastos circundantes y completamente reprogramados. La inmunostaining para el marcador de pluripotencia TRA-1-60 confirmó una alta eficiencia de reprogramación.
La densidad de revestimiento subóptima es la razón más común para reducir la eficiencia de la reprogramación en este protocolo. Si la densidad del chapado era demasiado baja, aparecieron grandes parches de barones acelulares y las colonias ipSC no se formaron. Tras el paso de dilución de las células reprogramadas, los IPSC crecieron como colonias individuales y fueron fácilmente distinguibles de los fibroblastos.
Estaban libremente embaladas y las células individuales tenían un área citoplasmático relativamente grande. En el transcurso de cuatro a siete días, las IPSC proliferaron y formaron una colonia característica apretadamente llena con bordes definidos. Las células individuales dentro de la colonia mostraron una gran fracción nuclear con nucleoli prominente.
Después de reprogramar los fibroblastos de los pacientes, los IPSC resultantes se pueden diferenciar en una variedad de células somáticas con el fin de dilucidar los mecanismos causantes de la enfermedad o desarrollar nuevas terapias regenerativas basadas en células.
