В настоящее время масс-спектрометрия играет важную роль в структурной биологии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о важных биологических макромолекулах в их родном государстве, особенно белков и белковых комплексов. Родная масс-спектрометрия широко применима к различным биомолекулярным агрегатам, включая мультипротеиновые и нуклеиновые кислотные системы.
Основным преимуществом этой техники является то, что она быстрая и очень чувствительная. Он может быть использован для допроса неоднородных образцов белка, что позволяет анализировать несколько белков в олигомерном состоянии одновременно. Демонстрация процедуры будет Энди Лау, аспирант в моей группе.
Чтобы начать эту процедуру, подготовьте в доме капилляры для наноэлектропрактики, как указано в текстовом протоколе. Подготовьте образец без лиганда в качестве элементов управления для каждого запуска в качестве буферного обмена каждого в ацетат аммония. Далее выберите режимы чувствительности, положительного приобретения ионов и мобильности TOF.
Следующий поворот на ловушку, API и IMS газов. Для разделения чата используйте показанные здесь отправные точки азота и аргона и настраивайте по мере необходимости. Установите соответствующий диапазон приобретения m/z.
Для неизвестного белка первоначальные шаги оптимизации должны использовать широкий диапазон. Вставьте капилляр с золотым покрытием в капиллярный держатель. Затем загрузите от двух до трех микролитров белкового комплексного раствора, представляющих интерес для капилляров.
Аккуратно затяните капилляр и поместите его на стадии источника электроспрей. Сдвиньте этап в положение, чтобы начать получение данных. Нанесите низкое давление газа нано-потока до тех пор, пока капля не образуется на кончике капилляра.
Перемещение капилляров по отношению к конусу и контролировать ионный ток для достижения стабильного ионового тока. Нанесите капиллярное напряжение в диапазоне от 0,9 до 1,6 киловольт. Затем установите конус выборки, смещение источника, температуру источника и поток конусного газа, как указано в текстовом протоколе.
Для получения хорошо разрешенного массового спектра и максимальной передачи ионов, отрегулируйте параметры MS и отслеживайте полученное изменение спектра. Установите энергию столкновения ловушки до начальной отправной точки между 10 и 50 вольт. Если смещения напряжения недостаточны, отрегулируйте энергии столкновения ловушки.
Установите ловушку через его напряжение до начальной отправной точки между 20 и 45 вольт. Улучшение запустения за счет оптимизации этого напряжения. После этого оптимизируйте скорость волны и высоту волны, как указано в тексте, чтобы достичь наилучшего разделения подвижности.
Для исследований с участием HerA и NurA используйте скорость волны 40 метров в секунду и высоту волны от 550 до 650 вольт. Для анализа связывания ДНК смешайте белок и ДНК в соотношении моляров, что позволяет сформировать комплекс ДНК белка. Добавьте все большее количество любого из следующих, 5'O-3-тио-трифосфата, соли тетратия или ADP.
С помощью соответствующего программного обеспечения измеряют массы генерируемых видов и идентифицируют связывание лигандов, таких как связывание АТФ и ADP и олигомерные состояния. Затем используйте ионные интенсивности, наблюдаемые в необработанных спектрах ESI MS, для количественной оценки соответствующего относительного изобилия видов. После оптимизации условий прибора для стабильной передачи, уменьшить коллизионной энергии и отбора проб конуса как можно ниже, сохраняя при этом хорошее качество спектра.
Используйте ранее установленную оптимизированную скорость волны и высоту волны для приобретения IM MS. Измерьте время дрейфа ионов на трех различных скоростях волн, сохраняя при этом одинаковую высоту волны. Для определения белка ион CCS измерения четырех калибрантов белка, два с массой выше белка в стадии исследования и два с массой ниже, используя те же условия приборов. Во-первых, подготовить образцы белка и буфер обмена их в ацетат аммония, как указано в текстовом протоколе.
Добавить растворитель в 10%increments до достижения желаемого количества. Инкубировать на льду в течение одного часа. После этого приобрети спектр IM-MS для каждого образца.
Используя программное обеспечение SUMMIT, назначайте белковые подкомплексы и генерируйте сети белкового взаимодействия. Кроме того, вручную создать список теоретических масс для ожидаемых видов. Чтобы начать исследование стабильности белковой комплексности, заведать данные IM-MS при одновременном увеличении напряжения ускорения ловушки с 10 вольт до 200 вольт, которые будут постепенно разворачиваться в белковой и газовой фазе.
Анализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения и генерируйте двумерные разворачивающиеся участки, укладыв нормализованные распределения CCS при каждом ускоряющемся напряжении для каждого состояния заряда. Родные результаты MS показывают олигомерное состояние, состав и топологию комплекса HerA и NurA. Поскольку нековалентные взаимодействия сохраняются в газовой фазе, родной MS экспериментов по титроваю АТФ гамма-S и ADP используется для определения парного нуклеотида, связывающего в HerA и NurA.
Массовые спектры олигомерных состояний HerA показывают, что увеличение концентрации гамма-S АТФ увеличивает относительную интенсивность гексамерической HerA. Экспериментальные значения CCS для белков и их комплексов затем выводятся из экспериментов IM-MS. Эти значения, как видно, имеют хорошее согласие с теоретическими измерениями рентгеновской кристаллографии, которая подтверждает использование значений CCS для построения моделей сборки белка с низким разрешением.
Анализ CIU и KEcom показывает, что ДНК, связанная с HerA-NurA, более стабильна, чем комплекс, свободный от ДНК. Анализ CIU MS и соответствующие состояния связывания АТФ показывают, что четыре гамма-состояния АТФ S снижают сложную стабильность в газовой фазе. Тем не менее, шесть АТФ гамма-связанных состояние, в котором все сайты заняты, считается наиболее стабильным.
Точные измерения молекулярной массы нетронутого комплекса дают ценную информацию о биомолекулярной характеристике. Мы можем получить информацию о сложных сборочных путях, олигомеризации белка и связывании лигандов. Объединение всей этой информации позволяет создавать детальные модели функциональных биологических сборок.
