Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация на основе штрих-кодов ДНК для анализа образцов FFPE из генетически перепрограммированной меланомы мышей

Этот протокол представляет собой пошаговое руководство по разработке мультиплексной иммунофлуоресцентной панели антител для визуализации тканей мышиной меланомы FFPE на основе штрих-кода. Мы также описываем конвейер анализа изображений с использованием инструментов с открытым исходным кодом для получения пространственной протеомики иммунного микроокружения опухоли мышиной меланомы.

Здесь представлен новый метод мультиплексной визуализации на основе штрих-кодов ДНК, основанный на Co-Detection-by-indEXing, который анализирует пространственную протеомику микроокружения тканей. Для успешной визуализации требуется репертуар хорошо спроектированных и должным образом проверенных панелей антител, но в настоящее время существует очень мало образцов с фиксированным формалином парафином (FFPE). FFPE имеет ряд преимуществ по сравнению со свежезамороженными образцами, таких как широкая доступность, простота в обращении и хранении, а также возможность изготовления тканевых микрочипов (TMA). В данной работе мы представляем протокол разработки панели антител для визуализации и анализа тканей FFPE из модели меланомы мыши, обработанной наночастицами, которые доставляют плазмидную ДНК, кодирующую иммунологические сигналы для перепрограммирования микроокружения опухоли. Мы также описываем конвейер анализа изображений с использованием вычислительных инструментов с открытым исходным кодом для аннотирования тканей, сегментации клеток, обработки данных протеомики, фенотипирования популяций клеток и количественной оценки пространственных метрик. Протокол предлагает приложения для проектирования панелей антител в мышиной FFPE и получения новых идей в области пространственной протеомики сложных тканевых микроокружений.

Меланома кожи является наиболее распространенным раком кожи, с различными показателями заболеваемости и смертности по всему миру в зависимости от времени постановки диагноза и оказания первичной медицинской помощи¹. За последнее десятилетие более глубокое биологическое понимание меланомы помогло ускорить разработку новых моделей рака для лечения^{солидных опухолей}. Недавнее развитие иммунотерапии привело к появлению революционной концепции лечения рака, основанной на активации эндогенной иммунной системы ^3,4.

Опухолевое микроокружение (ТМЭ) является очень сложным и состоит из различных иммунных клеток, ассоциированных с раком фибробластов, перицитов, эндотелиальных клеток и различных тканевых резидентных клеток⁵. В прошлом для изучения ТМЭ применялось несколько методов, таких как проточная цитометрия и секвенирование одиночных клеток, которые ставят под угрозу пространственный контекст, поскольку они необходимы для разрушения опухолевой ткани. Традиционная микроскопическая визуализация, такая как иммунофлуоресценция (ИФ) и иммуногистохимия (ИГХ), позволяет визуализировать белковые биомаркеры без разрушения тканей образца. Однако эти подходы ограничены двумя или тремя биомаркерами и не могут обеспечить полное понимание пространственных и структурных отношений в рамках сложной TME ⁶.

Для решения этой проблемы было разработано несколько методов мультиплексной визуализации для пространственной визуализации комплекса TME 7,8,9,10. Одной из них является CoDetection-by-inDEXing, переименованная в систему PhenoCycler, основанная на ДНК-олигонуклеотид-конъюгированных антителах¹¹. Система может обеспечить визуализацию отдельных клеток и анализ более 100 биомаркеров для образцов человека. Тем не менее, имеется очень мало инвентаризированных антител для визуализации и анализа образцов мышей, в частности, образцов с фиксированным формалином парафином (FFPE)¹². FFPE имеет ряд преимуществ по сравнению с консервацией свежезамороженных (FF), таких как простота обращения и хранения, хорошо сохраняющаяся морфология с течением времени и, что наиболее важно, возможность подготовки микрочипов тканей/опухолей (TMA), которые позволяют визуализировать несколько образцов на одном предметном стекле. Недавно мы спроектировали и разработали мышиную панель антител FFPE CODEX/PhenoCycler и успешно применили ее для визуализации и анализа пространственной протеомики генетически перепрограммированных образцов мышиной меланомы¹³.

Общая цель этого протокола — предоставить пошаговое руководство по проектированию панели антител FFPE у мышей и описать процесс конъюгации антитела со штрих-кодом, окрашивания тканей и визуализации. Кроме того, мы представляем подробный конвейер анализа изображений с использованием инструментов с открытым исходным кодом, таких как пакеты QuPath и R. Следуя этому протоколу, исследователи узнают, как разработать индивидуально конъюгированную панель антител, выполнить мультиплексную визуализацию с помощью устройства Phenocycler-Fusion и получить новое представление о пространственной протеомике меланомы TME. Кроме того, этот протокол может быть адаптирован для изучения различных иммунных микроокружений опухоли и сочетаться с существующими методами пространственной транскриптомики.

Все работы с животными выполнялись в соответствии с руководящими принципами, установленными Комитетом по уходу за животными и их использованию при Университете Джонса Хопкинса, с использованием утвержденных протокольных номеров MO18M388 и MO21M384.

1. Подбор антител

1. Разработайте панель антител на основе представляющей интерес ткани и обилия конкретного биомаркера. Выбирайте клоны антител на основе успешных предыдущих применений иммунофлуоресцентного (ИФ) и иммуногистохимического (ИГХ) окрашивания в литературе. Безопасные версии этих антител без носителей.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Очищенные антитела, не являющиеся носителями, важны для конъюгации штрих-кода. Избегайте любых консервантов на основе белка, таких как BSA, глютен, глицерин и т. д. Если антитела, не содержащие носителей, недоступны, запросите у поставщика индивидуальное антитело или используйте набор для удаления BSA, чтобы получить антитело без носителя. Азид натрия не препятствует конъюгации антител. Изотипы IgG рекомендуются по сравнению с изотипами IgM.
2. Верифицируйте эти выбранные клоны на представляющей интерес ткани с помощью обычной иммунофлюоресцентной (ПЧ) визуализации¹¹. Используйте двойную ПЧ-визуализацию для подтверждения специфичности определенных клонов (например, выполните двойную ПЧ-визуализацию с FOXP3 и CD4 для подтверждения окрашивания регуляторных Т-клеток).
   ПРИМЕЧАНИЕ: По возможности важно использовать для валидации IF ту же ткань, которая будет использоваться для окрашивания. Выберите подходящее решение для забора антигена. В этом протоколе мы использовали буфер AR9, предоставленный компанией Akoya Biosciences, для извлечения всех эпитопов тканей FFPE меланомы мыши. Другие решения для извлечения антигенов, такие как AR6 или Universal, могут быть использованы в зависимости от требований к эпитопам.

2. Конъюгация и подтверждение антител

1. Назначьте проверенные антитела штрих-кодам, которые имеют дополнительные репортеры, прикрепленные к флуорофорам ATTO550 (Cy3), AF647 (Cy5) или AF750 (Cy7). Малораспространенные антигены обычно производят более низкие сигналы; конъюгируют такие антитела с каналами с низкой аутофлуоресценцией, такими как AF647 (Cy5). Конъюгировать высокоэкспрессированные антигены к ATTO550 (Cy3) и AF750 (Cy7) благодаря возможности аутофлуоресценции.
   ПРИМЕЧАНИЕ: На этом важном этапе учитывается чувствительность канала и распространенность антигена. Использование канала AF488 для FFPE ткани не рекомендуется из-за его более высокой автофлуоресценции.
2. Для конъюгации антитела со штрих-кодом (4,5 ч) приобретите набор для конъюгации антител. Хранить все реагенты при температуре 4 °C, за исключением восстановительного раствора 1, который необходимо хранить при температуре -20 °C в виде небольших одноразовых флаконов.
   1. Измерьте концентрацию антител с помощью спектрофотометра.
   2. Начинайте конъюгацию антител путем нанесения 500 мкл раствора, блокирующего фильтр, на фильтрующую колонку MWCO с температурой 50 кДа для блокирования неспецифического связывания антител с фильтром. Вращайте при 12 000 x g в течение 2 минут при комнатной температуре (RT). Удалите лишнюю жидкость из колонки с помощью микропипетки объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Восстановительный раствор 1 представляет собой одноразовый флакон с раствором, которого достаточно для трех конъюгаций антител одновременно. Не используйте раствор повторно после размораживания; Выбросьте оставшийся реагент. Не используйте фильтр над фильтрующей колонной MWCO 50 кДа, так как это может привести к плохой очистке и конъюгации.
   3. Используйте эквивалентный объем 50 мкг раствора антитела и добавьте его в фильтр MWCO с массой 50 кДа. При необходимости отрегулируйте общий объем до 100 мкл с помощью PBS. Вращайте при 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C. В течение этого времени готовят восстановительную мастер-смесь с использованием 19,8 мкл восстановительного раствора 1 + 825 мкл восстановительного раствора 2 для трех конъюгаций антител.
   4. Отбросьте проточный слой и добавьте 260 μL восстановительной мастер-смеси в верхнюю часть каждого фильтрующего блока. Вихревой раствор поместить в фильтрующую установку в течение 2-3 секунд и инкубировать в течение 30 мин при RT.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Крайне важно не превышать 30 минут инкубации, чтобы избежать чрезмерного снижения антител, так как это повреждает их и может привести к неудачной конъюгации.
   5. После 30 минут инкубации снизьте температуру до 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C и выбросьте поток на дно. Добавьте 450 μL конъюгационного раствора в верхнюю часть колонки и вращайте при 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C. Во время центрифугирования приготовьте раствор штрих-кода CODEX. Действуйте быстро после извлечения штрих-кода от -20 °C, так как штрих-код начинает разрушаться.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Штрих-коды обычно поставляются в небольших стеклянных флаконах, содержащих лиофилизированные продукты (хлопья или порошок), хранящихся при температуре -20 °C. Эти флаконы можно использовать для конъюгации 50 мкг антител за один раз. Рекомендуется не конъюгировать более трех антител за один раз.
   6. Внимательно расположите лиофилизированный штрих-код на дне стеклянного флакона (он также может быть приклеен к стенкам). Постучите по стеклянному флакону на столе, чтобы твердые частицы опустились на дно. Локализация лиофилизированного продукта имеет важное значение при его растворении в 10 мкл воды молекулярного биологического качества, не содержащей нуклеаз. После добавления 10 μL воды, не содержащей нуклеаз, добавьте 210 μL конъюгационного раствора в каждый штрих-код. Растворите весь лиофилизированный материал и аккуратно перемешайте, пипетируя вверх и вниз. Откладывать.
   7. После завершения отжима на шаге 2.2.5 откажитесь от проточной части и добавьте соответствующий раствор штрих-кода из шага 2.2.6 в верхнюю часть каждого фильтрующего блока. Сохранить 1 мкг исходного неконъюгированного антитела; он будет запущен вместе с конъюгированным образцом антитела объемом 5 мкл во время валидации гель-электрофореза.
   8. Пометьте каждую пробирку соответствующим названием антитела и штрих-кодом. Закройте крышкой и перемешайте раствор путем вортекса в течение 2-3 с. Инкубируйте реакцию конъюгации антитело-штрих-код в течение 2 ч в ЛТ.
   9. После 2 ч инкубации удалить 5 мкл конъюгированного антитела и хранить в ПЦР-пробирке объемом 0,2 мл для подтверждения конъюгации с помощью гель-электрофореза.
   10. Уменьшите оставшийся конъюгированный раствор антитела при 12 000 x g в течение 8 мин при 4°C. Добавьте 450 μL очистного раствора в верхнюю часть колонны, вращайте при 12 000 x g в течение 8 минут при 4 °C и сбросьте поток. Повторите этот этап очистки 2 раза, каждый раз добавляя 450 мкл раствора для очистки и уменьшая его.
   11. После^3-го центрифугирования откажитесь от сквозного потока. Верхний фильтр будет содержать антитела, конъюгированные со штрих-кодом.
   12. Чтобы собрать конъюгированное антитело, пометьте новую внешнюю трубку, в которой находится фильтровальная колонка, соответствующим антителом и штрих-кодом. Перед центрифугированием снимите крышку с внешней пробирки. Добавьте 100 мкл раствора для хранения антител в каждый фильтрующий блок и поместите только что помеченную внешнюю пробирку вверх ногами на фильтрующую колонку.
   13. Переверните фильтрующую колонку, чтобы собрать конъюгированное антитело в наружную трубку, и вращайте при 3000 x g в течение 2 минут при RT. Для этого должно собраться около 120 мкл конъюгированного раствора антитела. Переложите в стерильную микроцентрифужную пробирку и храните при температуре 4 °C в течение 18-24 месяцев.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Во избежание высокого фонового окрашивания ядер после конъюгации рекомендуется не использовать эти антитела в течение как минимум 2 дней.
3. Выполните подтверждение конъюгации методом гель-электрофореза, как описано в уже опубликованном протоколе¹³.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот процесс только подтверждает успешность реакции химической конъюгации, используемой для конъюгации штрих-кодов с антителами. Это необязательно, так как валидация антител возможна только после успешного окрашивания и визуализации ткани.

3. Подготовка образцов Murine FFPE

1. Получение образцов тканей FFPE от самок мышей C57BL/6J, которым имплантировали опухоли боковой стороны B16F10. Лечите мышей внутриопухолевыми инъекциями наночастиц на основе поли(β-аминоэфира), содержащих 4-1BBL и плазмиды IL-12, а также внутрибрюшинной доставкой анти-PD1 через 9, 11, 16 и 18 дней после^{имплантации.} Принесите мышей в жертву на 20-й день и исправьте опухоли в 10% формалине, встроенном в парафин, а затем разрежьте их в центре онкологической тканевой службы Джона Хопкинса.
2. Внимательно изучите характеристики области визуализации, приведенные в руководстве пользователя, и установите образцы размером 5 мкм на предметное стекло внутри области визуализации. Мы смогли смонтировать четыре разных образца опухоли на одном предметном стекле.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно использовать рекомендованные слайды, доступные для визуализации, такие как Leica Apex Adhesive Slides или Fisherbrand Superfrost Plus Slides. Это поможет проточной ячейке прочно прилегать к предметному стеклу.

4. Окрашивание тканей методом FFPE и визуализация

1. Проверка и оптимизация концентрации антител и времени воздействия: Чтобы проверить успешность конъюгации антитела со штрих-кодом, окрашивайте интересующую ткань 6-9 конъюгированными антителами. Запустите устройство мультиплексной визуализации и запишите концентрацию каждого антитела и время воздействия. При необходимости отрегулируйте разведения и время воздействия, затем запустите 6-9 новых антител с ранее проверенными и обратите внимание на любые корректировки. Выполните следующие действия для окрашивания и визуализации.
2. Окрашивание тканей и визуализация
   1. За день до окрашивания запекайте салфетки FFPE в духовке при температуре 60 °C на ночь. На следующий день охладите предметные стекла в течение 10 минут в режиме RT, прежде чем начать этапы депарафинизации и регидратации тканей.
   2. Начать депарафинизацию тканей путем инкубации в растворе ксилола 2 раза по 5 мин каждый.
   3. Чтобы увлажнить ткань, пропустите ее через два круга 100% раствора этанола в течение 5 минут каждый. Далее проведите его через ряд спиртовых растворов от 90% до 70%, 50% и 30% на 5 мин каждый. Наконец, промойте салфетку дистиллированной водой дважды по 5 минут каждый.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Менее токсичные альтернативы ксилолу, такие как раствор Neoclear, могут быть использованы для депарафинизации. Проведите депарафинизацию и регидратацию под вытяжным шкафом.
   4. Разбавьте 10x буфер AR9 до 1x с помощью дистиллированной воды. Наполните банку Coplin 50 мл 1x AR9 буфера, убедившись, что предметные стекла полностью погружены в буфер для извлечения антигена.
   5. Наполните скороварку водой так, чтобы уровень был на полпути вверх по банке Coplin, затем инкубируйте под высоким давлением в течение 20 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Можно использовать специализированную скороварку или камеру для снятия маскировки для лучшего извлечения антигена, установив ее на 120 °C на 10 минут.
   6. После завершения этапа скороварки охладите горки в течение 45-60 минут. Промойте предметное стекло дистиллированной водой 2 раза по 2 минуты. Затем переложите предметное стекло в банку, содержащую 1x PBS.
   7. Чтобы свести к минимуму аутофлуоресценцию, выполните этап отбеливания ткани перед окрашиванием антителами. Свежеприготовленный отбеливающий раствор (25 мл 1x PBS + 0,8 мл 1М NaOH + 4,5 мл H₂O₂) с использованием рекомендованных реагентов и концентраций. Инкубируйте предметные стекла в пластиковом контейнере с отбеливающим раствором между двумя светодиодными лампами в течение 45 минут при комнатной температуре. Повторите со свежим отбеливающим раствором еще 45 минут.
   8. Начинайте готовить раствор коктейля антител на этом этапе отбеливания, особенно если в панели есть несколько антител с различными разведениями. Достаньте все четыре блокиратора (G, S, J и N) и положите их на лед, так как некоторым требуется время, чтобы оттаять при температуре -20 °C.
   9. После фотоотбеливания промойте салфетку 1x PBS, 2x по 2 мин каждая. Переместите салфетку в банки с буфером для гидратации и промойте 2 раза по 2 минуты каждая.
   10. Перенесите салфетки в буфер для окрашивания и дайте им сбалансироваться в течение 30 минут. Если препарат не был приготовлен на этапе отбеливания, приготовьте раствор коктейля антител в течение этого времени.
   11. Приготовьте 300 мкл раствора коктейля антител для окрашивания двух предметных стекол (обычно, при использовании гибридизационной пластиковой камеры, достаточно 100-120 мкл коктейля антител для окрашивания каждого предметного стекла).
   12. Окрасьте предметные стекла, нанеся раствор коктейля антител внутри камеры влажности на ночь при температуре 4 °C.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Все антитела здесь показывают положительный сигнал при окрашивании в течение ночи при температуре 4 °C. Тем не менее, время окрашивания и температура каждого антитела могут варьироваться и должны быть оптимизированы. Наиболее часто используемые условия окрашивания — 3 часа при RT или в течение ночи при 4 °C. При необходимости также можно сначала окрашивать несколько антител при различных температурах, а затем оставшиеся антитела в течение ночи при 4 °C. После этого промойте салфетку PBS, если требуется последовательное окрашивание.
   13. На следующий день проведите фиксацию после окрашивания. Снимите пластиковую камеру и храните собранный коктейль антител при температуре 4 °C. Промойте предметные стекла 2 раза в буфере для окрашивания по 2 минуты каждая. Затем переместите предметные стекла в 40 мл фиксирующего раствора после окрашивания (4 мл 16% параформальдегида + 36 мл буфера для хранения) и инкубируйте в течение 10 минут. Смойте PBS 3x по 2 минуты каждый.
   14. Переместите предметные стекла в ледяной метанол на 5 минут, затем промойте PBS 3 раза по 2 минуты каждое. Нанесите окончательный фиксирующий раствор (20 мкл одной пробирки + 1 мл PBS) на предметные стекла под камерой влажности. Обычно на предметное стекло достаточно 200 мкл фиксирующего раствора. Оставьте фиксатор на 20 минут на RT. Выполните три заключительных промывки в PBS по 2 минуты каждое.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Не снимайте фиксирующую трубку с температуры -20 °C заранее; Перед нанесением только разморозьте.
   15. При немедленной визуализации протрите предметное стекло вокруг ткани безворсовой салфеткой и примените проточную ячейку, надавливая на нее в течение 30 с с помощью оборудования для сборки проточных ячеек. Если визуализация выполняется позже, храните предметное стекло (без применения проточной ячейки) в буфере хранения при температуре 4 °C. Когда изображение будет готово, перенесите слайды из буфера хранения в PBS в течение 10 минут перед применением проточной ячейки.
3. Начните подготовку рабочего буфера 1x с добавкой на основе желаемых циклов в эксперименте. Приготовьте буферы с низким (1:4) и высоким содержанием ДМСО (9:1), смешав 1-компонентный ДМСО с 4-компонентным рабочим буфером и 9-компонентный ДМСО с 1-компонентным рабочим буфером, необходимым для желаемых циклов. Сэкономьте около 20 мл 1x буфера с добавкой для изготовления репортерной пластины. Чтобы рассчитать требуемый буфер 1x с аддитивными буферами и буферами ДМСО с высоким/низким уровнем ДМСО, обратитесь к менеджеру приборов.
4. Начните подготовку репортерной пластины. Во-первых, составьте репортер стокового решения, необходимого для общего количества циклов. Наклейте на микроцентрифужные пробирки черного или янтарного цвета объемом 1 мл с названиями циклов. Добавьте в соответствующую пробирку 250 μл исходного раствора репортера и по 5 μл каждого репортера. Затем перелейте раствор на черную 96-луночную пластину и запечатайте ее клеевой фольгой.
5. Запустите устройство, используйте диспетчер приборов для установки параметров и времени экспозиции (в соответствии с таблицей 1) и получите изображения. На рисунке 1 обобщены процессы до и после окрашивания.

5. Аннотирование тканей и сегментация клеток

1. Настройте проект и рабочее пространство.
   1. Установите последнюю версию программного обеспечения для цифрового анализа патологии (например, QuPath версии 0.5.1 или выше). Нажмите « Создать проект», чтобы выбрать папку назначения для пространства проекта.
   2. Нажмите « Добавить изображения» > «Выбрать файлы», затем перейдите к файлу QPTIFF (полученному с помощью мультиплексной иммунофлуоресцентной визуализации). Установите тип изображения на Флуоресцентный, сохраните все остальные настройки по умолчанию и нажмите Импорт.
   3. Если вы используете QuPath, дважды щелкните по новому изображению, чтобы открыть рабочую область. Периодически нажимайте кнопку Файл > Сохранить , чтобы отслеживать изменения, внесенные в проект. Переключайте видимость маркера и настройки просмотра с помощью значка «Яркость и контрастность » (значок в виде полумесяца) в центре панели инструментов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Щелкните правой кнопкой мыши изображение в списке изображений, чтобы переименовать его. Это будет важно в дальнейшем при визуализации классификаций фенотипов.
2. Аннотируйте полный срез ткани, внутриопухолевый компартмент и стромальный компартмент.
   1. С помощью инструмента «Кисть» и/или «Палочка» нарисуйте аннотацию вокруг всего участка ткани. Определите эту аннотацию как Full_Tissue. Исключите вышележащую кожу и/или любые участки, которые не следует анализировать. Чтобы создать отрицательную аннотацию и/или уменьшить границу аннотации, удерживайте клавишу Alt во время использования одного из инструментов аннотации.
   2. Продублируйте полную аннотацию ткани. Выберите Аннотацию на вкладке Аннотации, затем перейдите в раздел Объекты > Аннотации... > Дублируйте выбранные аннотации.
   3. Включите канал SOX10. На дублирующейся аннотации сожмите границу аннотации, чтобы захватить внутриопухолевое отделение, с помощью инструмента Alt + кисть/палочка. Определите эту аннотацию как опухоль (рисунок 2).
   4. Выбрав полную аннотацию ткани, перейдите в раздел Объекты > аннотации... > Разверните аннотации. Определите Радиус расширения как 1 мкм и нажмите Запустить.
   5. Переименуйте новую аннотацию в Full_Tissue_Expansion. Выберите аннотацию опухоли, щелкните правой кнопкой мыши и выберите «Вставить в иерархию».
   6. Повторно выберите аннотацию опухоли, перейдите в раздел Объекты > аннотации... > Сделайте обратное. Определите эту новую аннотацию как Stroma. Повторите для всех участков ткани.
3. Выполняйте сегментацию ячеек и экспортируйте результаты.
   1. Перейдите на вкладку Изображение , чтобы найти ширину и высоту изображения в пикселях (рисунок 3A).
   2. Загрузите расширение StarDist по ссылке https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases. Перетащите файл qupath-extension-stardist-[version].jar в окно QuPath, затем нажмите на значок шестеренки в правом верхнем углу окна QuPath. В разделе Расширения определите пользовательский каталог QuPath в качестве местоположения папки StarDist.
   3. Загрузите файлы скриптов StarDist groovy и файл модели StarDist с сайта https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (скрипты StarDist изначально были организованы компанией Akoya Biosciences).
   4. Для каждого участка ткани выберите аннотации «Опухоль » и «Строма» (используйте клавишу Ctrl для выбора нескольких аннотаций). На верхней панели настроек нажмите «Автоматизировать > редактор скриптов », чтобы открыть интерфейс скриптов. Откройте соответствующий скрипт сегментации ячеек StarDist (файл groovy), который соответствует размеру пикселя изображения. Когда появится запрос на выбор файла сегментации ячеек, откройте файл stardist_cell_seg_model.pb.
   5. После сегментации ячеек сохраните изображение. Перейдите в раздел Измерение > Экспорт измерений, затем выберите соответствующие изображения. Назначьте тип экспорта как Ячейки и Разделитель как .csv, затем выберите местоположение выходного файла . Нажмите « Заполнить» рядом со столбцами, чтобы включить интересующие их метрики. Важными столбцами для экспорта являются «Изображение», «Идентификатор объекта», «Родитель», «Центроид X», «Центроид Y» и «Площадь ядра».
      ПРИМЕЧАНИЕ: Идентификатор объекта используется на последующих этапах для повторного сопоставления классификаций с мультиплексным иммунофлуоресцентным изображением в программном обеспечении для цифрового анализа патологии. В столбце «Родитель» указывается имя аннотации, к которой принадлежит ячейка. Данные X и Y используются для пространственного анализа.
   6. Для каждого маркера происхождения, который будет использоваться в кластеризации/фенотипировании, выберите одно среднее значение для экспорта. Для ядерных маркеров (например, SOX10 и FOXP3) экспортируйте опцию Nucleus: Mean. Для цитоплазматических/мембранозных маркеров (например, CD45, CD3, CD4) экспортируйте опцию Цитоплазма: Среднее.

6. Предварительная обработка и нормализация данных по протеомике

1. Откройте экспортированный CSV-файл. Для каждого маркера, используемого в кластеризации/фенотипировании, усеките имя заголовка столбца, чтобы включить только маркер. Например, переименуйте SOX10: Nucleus: Mean в SOX10 и CD3: Cytoplasm: Mean в CD3.
2. Установите последнюю версию R и RStudio. Скачайте файл Marker Normalization.R с https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis и запустите скрипт. Во-первых, это включает в себя фильтрацию клеток по размеру ядер.
3. Затем для каждого маркера выполняется нормализация min-max таким образом, чтобы наименьшее значение MFI в диапазоне выражения было установлено равным 0, а значение MFI в 99,7-м процентиле было установлено равным 1. Все интенсивности выше^99,7-го процентиля обрезаются на уровне 1. После завершения сохраните новый CSV-файл, созданный с нормализованными данными.

7. Кластеризация и фенотипирование

1. Выберите алгоритм кластеризации ячеек в соответствии с профилями экспрессии маркеров. В https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis предоставляются скрипты R для кластеризации с использованием Seurat v4.4¹⁵ и FlowSOM v2.13.9 (инструмент кластеризации и визуализации)¹⁶.
2. Фенотип клеток в соответствии с профилями экспрессии маркеров ключевых маркеров линии. Представленный здесь протокол использовал 14 маркеров линии для кластеризации и фенотипирования: SOX10, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD11C, F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206, NK1.1 и CD31.
   1. Определите опухолевые клетки как SOX10^hi. Определите CD4 Т-клетки как CD45^mod-hi/ CD4^hi/CD8^low/FOXP3^low. Определите CD8 Т-клетки как CD45^mod-hi/ CD8^hi/CD4^low. Определите Tregs как CD45^mod-hi/CD4^hi/CD8^low/FOXP3^hi. Определите другие Т-клетки как CD45^mod-hi/CD3^hi/CD4^low/CD8^low.
   2. Определите макрофаги M1 как CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^hi/CD86^hi/CD163^low /CD206^low. Определите макрофаги M2 следующим образом: CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^hi/CD206^low, CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^low/CD206^hi, или CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^hi/CD206^hi. Определите другие макрофаги: CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/ CD163^low/CD206^low или CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^hi/CD163^hi/CD206^hi.
   3. Определите дендритные клетки как CD45^mod-hi/CD11c^hi/CD86^mod-hi. Определите NK-клетки как CD45^mod-hi/NK1.1^hi. Определите другие иммунные клетки как CD45^mod-hi , которые не удовлетворяют условиям, описанным выше. Определите эндотелиальные клетки как CD31^mod-hi. Удалите все остальные профили выражения.

8. Повторное присвоение классификаций фенотипов и проведение контроля качества

1. Загрузите скрипт Remapping Classifications.groovy с сайта https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (этот скрипт был адаптирован из поста на https://forum.image.sc/ от petebankhead).
2. Откройте фенотипированный файл CSV и убедитесь, что все метки на вкладке «Изображение» точно соответствуют имени файла изображения в программном обеспечении для цифрового анализа патологии, которое будет использоваться для повторного сопоставления. Чтобы быстро изменить большое количество меток в файле CSV, используйте функцию «Заменить все».
3. Если вы используете QuPath, запустите файл Groovy для повторного сопоставления классификаций, нажав кнопку "Автоматизировать > редакторе скриптов".
4. На вкладке Аннотации нажмите на Три точки рядом с кнопкой Автонастройка, затем нажмите Заполнить из существующих объектов > Все классы (включая подклассы) > Да.
5. Прокрутите список маркеров вниз, чтобы просмотреть различные классификации фенотипов и при необходимости настроить цветовую схему. Дважды щелкните мышью по любой ячейке, чтобы просмотреть ее фенотип (рядом с тегом Классификация) и кластер (рядом с тегом Имя). Проверьте репрезентативные поля зрения, чтобы определить точность присвоения фенотипов и при необходимости пересмотреть стратегию фенотипирования (рис. 3B).

9. Количественная оценка плотности и пространственный анализ

1. После завершения фенотипирования получите области аннотаций в программном обеспечении для цифрового анализа патологии на вкладке «Аннотации». Преобразуйте значения площади в мм², а затем разделите числа по областям аннотаций, чтобы вычислить плотности.
2. Загрузите скрипт SPIAT Spatial Analysis.R с https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis и запустите. Соберите данные о средних минимальных расстояниях (AMD), составах окрестностей и нормализованных оценках смешивания (NMS).
3. Генерируйте цифры в программном обеспечении для статистического анализа для представления результатов. При создании единой тепловой карты для средних минимальных расстояний условий лечения усредняйте результаты, полученные на разных срезах тканей.

В данной статье мы представляем протокол разработки панели антител для мышиной ткани FFPE, выполнения мультиплексной иммунофлуоресцентной визуализации и анализа изображений для количественной оценки протеомики и пространственных отношений. Валидированная панель содержит 27 антител, которые обеспечивают маркеры для визуализации клеток меланомы (SOX10), лейкоцитов (CD45), Т-клеток (CD3, CD4, CD8, FOXP3), В-клеток (CD20), макрофагов и подтипов (F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206), дендритных клеток (CD11c), NK-клеток (NK1.1) и эндотелиальных клеток (CD31). Полная панель также содержит маркеры других иммунных популяций (CD11b, CD38), пролиферативной активности (Ki67), функциональности Т-клеток (T-бет, эомезодермин, гранзим B), презентации антигена (LMP2, бета-2 микроглобулин, MHC II) и экспрессии контрольных точек (TIM3, LAG3, PD-L1)¹². Репрезентативное изображение гель-электрофореза подтверждает успешную конъюгацию штрих-кодов олигонуклеотидов ДНК с антителами, не содержащими носителей, как показано на рисунке 4. Этот шаг только подтверждает химическую реакцию, а подтверждение изображения может быть сделано только после проверки этих антител с помощью устройства мультиплексной визуализации на интересующей ткани. Смотрите следующую ссылку для просмотра проверенных изображений всех 27 маркеров на панели¹³. На рисунке 5 представлено изображение слияния ключевых маркеров линии, окрашивающих три участка ткани меланомы мышей, обработанных внутриопухолевыми инъекциями наночастиц 4-1BBL/IL-12 и системным анти-PD1. Эти участки были использованы для последующего анализа изображений в данном протоколе.

После аннотирования тканей, сегментации клеток и предварительной обработки данных протеомики мы представляем сравнение между двумя алгоритмами кластеризации, которые ранее применялись для транскриптомного и/или протеомного анализа одиночных клеток^17,18. Профили экспрессии для фенотипированных популяций представлены на рисунке 6 для обоих подходов. Мы показываем, что FlowSOM предлагает более широкий диапазон значений интенсивности (~0,7 против ~0,5) для выявления различий между аналогичными клеточными популяциями, такими как подтипы макрофагов. Сёра применил алгоритм Лувена во время кластеризации и сгенерировал 29 кластеров (дополнительный рисунок 1). Для сравнения, FlowSOM применил самоорганизующиеся карты и может генерировать 100 кластеров (дополнительный рисунок 2). Большее количество кластеров приводит к большему времени, необходимому для фенотипирования, но этот последний подход FlowSOM также предлагает больше нюансов при классификации схожих популяций клеток. Качественно мы видим, что FlowSOM смог классифицировать больше внутриопухолевых макрофагов как подтип M1 или M2 по сравнению с фенотипированием Seura в том же поле зрения (рис. 7). Тот же результат наблюдается при количественной оценке плотности макрофагов, при этом FlowSOM фиксирует более высокую плотность макрофагов M1 и M2 по сравнению с Seura (рис. 8A-B) и, следовательно, значительно меньшую плотность других/неклассифицированных макрофагов (p = 0,0028; Рисунок 8В). Тем не менее, два подхода к анализу также дали схожие результаты при описании других плотностей клеточной популяции, таких как CD4 Т-клетки, CD8 Т-клетки и эндотелиальные клетки (рисунок 8D-F).

Мы также представляем результаты нисходящего пространственного анализа после кластеризации и фенотипирования. На рисунке 9 показаны некоторые пространственные метрики, которые могут быть сгенерированы с помощью этого протокола. По отношению ко всем фенотипированным популяциям, М2-макрофаги и NK-клетки имели самые высокие показатели ВМД после обработки наночастицами 4-1BBL/IL-12 и анти-PD1 (рис. 9A). Аналогичным образом, НМС между внутриопухолевыми CD8 Т-клетками и М1-макрофагами была намного выше, чем между CD8 Т-клетками и М2-макрофагами (рис. 9B). Кроме того, макрофаги M2 составляли ~1% в окрестности 100 мкм, окружающей внутриопухолевые CD8 Т-клетки, в то время как макрофаги M1 составляли 9-13% этих окрестностей (рис. 9C). В совокупности эти результаты позволяют предположить, что схема лечения 4-1BBL/IL-12 поляризовала опухолеассоциированные макрофаги в сторону подтипа M1 и исключила макрофаги M2 из иммунного микроокружения опухоли.

Рисунок 1: Краткое описание рабочего процесса окрашивания тканей и визуализации FFPE. Мышиные ткани FFPE обрабатывали с использованием процедур предварительного окрашивания, которые начинались с запекания ткани в течение ночи, а затем начинались двухдневные процессы предварительного окрашивания (день 1) и последующего окрашивания (день 2). Наконец, репортерная пластина была подготовлена перед получением изображения с помощью устройства. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Скриншот аннотации тканей в программном обеспечении для цифровой патологии QuPath с открытым доступом. Была нарисована полная тканевая аннотация (зеленый цвет), дублирована и свернута вниз для определения внутриопухолевого компартмента в соответствии с распределением меланоцитов SOX10+ на границе опухоли (красный). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Сегментация клеток с использованием алгоритма StarDist в QuPath и процесс контроля качества для просмотра классификаций фенотипов. (A) Перейдите на вкладку Изображение, чтобы определить ширину и высоту пикселя мультиплексного иммунофлуоресцентного изображения. (B) После повторного присвоения классификаций дважды щелкните по любой ячейке (она будет выделена желтым цветом), чтобы увидеть ее кластерное назначение и фенотип. Включите и выключите маркеры панели, чтобы определить, является ли этот подход к классификации точным. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Репрезентативное изображение геля для подтверждения конъюгации антитела-ДНК штрих-кода. Электрофорез в белковом геле подтверждает конъюгацию антител с ДНК-олигонуклеотидными штрих-кодами, наблюдаемыми дополнительными полосами на сайте тяжелой цепи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Мультиплексная визуализация боковых опухолей B16F10 на основе штрих-кода ДНК, обработанных внутриопухолевыми инъекциями наночастиц 4-1BBL/IL-12 с системным анти-PD1. Маркеры на нашей панели не показаны: CD11b, CD20, CD38, TIM3, LAG3, T-бет, эомезодермин, гранзим B, Ki67, LMP2, бета-2 микроглобулин, MHC II, PD-L1. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Тепловые карты экспрессии протеомики фенотипированных клеточных популяций. (A) Подход Seura к кластеризации и фенотипированию генерирует несколько меньший диапазон значений экспрессии маркеров по сравнению с (B) кластеризацией и фенотипированием FlowSOM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Фенотипирование FlowSOM идентифицирует более широкий спектр различных подтипов макрофагов. На верхней панели показано фенотипирование макрофагов Seurat (слева) и FlowSOM (справа) для одного и того же поля зрения. На нижней панели представлены мультиплексные иммунофлуоресцентные изображения ключевых маркеров линии макрофагов в одном поле зрения. Все масштабные линейки имеют размер 20 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Сравнение внутриопухолевой плотности различных клеточных популяций после кластеризации/фенотипирования. Сравнение плотности показано для внутриопухолевых (A) M1 макрофагов, (B) M2 макрофагов, (C) других макрофагов, (D) CD4 Т-клеток, (E) CD8 Т-клеток и (F) эндотелиальных клеток. Погрешности являются стандартными погрешностями среднего значения (SEM), а значимость проверялась с помощью непарных t-критериев (**p ≤ 0,01). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: Профилирование внутриопухолевых пространственных метрик для трех фланговых опухолей, обработанных внутриопухолевыми инъекциями наночастиц 4-1BBL/IL-12 и системными анти-PD1. (A) Тепловая карта средних минимальных расстояний между внутриопухолевыми фенотипированными популяциями. Измерения указаны в мкм. (B) Нормализованные показатели смешивания между ключевыми внутриопухолевыми парами фенотипов. (C) Разбивка соседских композиций в радиусе 100 мкм вокруг внутриопухолевых популяций CD8 Т-клеток. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Настройки разведения антител и времени воздействия.

Дополнительный рисунок 1: Первоначальная тепловая карта экспрессии протеомики, созданная после кластеризации по методу Сёра. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Дополнительный рисунок 2: Первоначальная тепловая карта экспрессии протеомики, созданная после кластеризации FlowSOM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту цифру.

Успех визуализации зависит от хорошо спроектированной и проверенной панели антител. Мультиплексная иммунофлуоресцентная визуализация образцов FFPE сопряжена с трудностями из-за высокой автофлуоресценции и трудности извлечения эпитопов, замаскированных заделкой парафина. Однако, учитывая, что FFPE имеет ряд преимуществ по сравнению с образцами FF, важно разработать и проверить панели антител FFPE. Первым шагом является окончательная доработка клонов антител, которые демонстрируют положительные сигналы во время иммунофлюоресцентной (ИФ) визуализации; впоследствии важно тщательно сопрягать их со штрих-кодами ДНК. Конъюгация антител требует частичного восстановления антитела для создания SH-связей, которые используются во время реакции малеимидной группы со штрих-кодом. Не каждый клон антитела может выдержать этот этап, а некоторые реакции могут вызвать необратимое повреждение антитела, что приводит к неудачной визуализации, несмотря на успешную конъюгацию. По этой причине, несмотря на то, что некоторые антитела могут проявлять положительные сигналы во время обычной валидации ПЧ, для оценки конечного успеха конъюгации антител важно провести валидацию каждого антитела на фактической ткани, представляющей интерес, и зарегистрировать желаемое время экспозиции для этой ткани. В будущих приложениях этот метод может быть объединен с существующим пространственным транскриптомным анализом на последовательных слайдах/одном и том же слайде для получения дополнительных выводов. Одним из ограничений этого метода является то, что он требует тщательного отбора и валидации каждого антитела в панели на основе мишени и типа ткани.

Что касается анализа изображений, QuPath предлагает ценный инструмент с открытым доступом с высококачественной визуализацией маркеров протеомики, широкой функциональностью для экспорта измерений интенсивности и выполнения контроля качества для классификации фенотипов, а также хорошей гибкостью для пользовательских скриптов. Интерактивные форумы, такие как https://forum.image.sc/, являются дополнительным ресурсом для обсуждения того, как выполнять конкретные задачи анализа, и для обмена скриптами с другими пользователями. В этом протоколе мы сравниваем два подхода к кластеризации и фенотипированию с использованием Seurat и FlowSOM. Несмотря на то, что FlowSOM может быть предпочтительным из-за его способности получать более детальное представление о субпопуляциях иммунных клеток TME, время, необходимое для протеомного анализа, также должно быть принято во внимание. Создание 100 кластеров может быть ненужным, если пользователю нужно фенотипировать клетки только в одном или двух образцах ткани. В таких ситуациях Seura может предложить более быстрый и эффективный конвейер для анализа изображений. Напротив, анализ ТМА с более чем 40 или 50 тканевыми срезами с большей вероятностью приведет к получению большего количества клеточных кластеров в обоих подходах к анализу, и FlowSOM может быть предпочтительной методологией для создания более тонких классификаций фенотипов.

Кластеризация клеток/фенотипирование и все последующие этапы анализа изображений во многом зависят от сегментации клеток. В нашей текущей работе изучалась сегментация клеток в алгоритмах HALO (Indica Labs) и StarDist, и мы обнаружили, что оба подхода имеют тенденцию к сверхсегментации клеток на основе ядерных сигналов DAPI. Также доступно множество альтернативных алгоритмов сегментации, таких как Mesmer¹⁹ и InstanSeg²⁰. Это растущая область вычислительных исследований, которая требует дальнейшего изучения и оптимизации.

Компания J.C.S. выражает признательность за финансовую поддержку со стороны компании Emerson Collective LLC и Национальных институтов здравоохранения. J.J.G. также выражает признательность за финансирование со стороны Национальных институтов здравоохранения. J.C.S. сотрудничает с компанией Palleon Pharmaceuticals Inc., которая включает в себя финансирование грантов. S.Y.T. и J.J.G. имеют отношения с OncoSwitch Therapeutics, которые связаны с акциями. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. и K.M.L. имеют патент, находящийся на рассмотрении. Все остальные авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы быть восприняты как влияющие на исследование, представленное в этой статье.

Компания J.C.S. выражает признательность Фонду дерматологии и премии за развитие карьеры в области дерматопатологии за продвижение карьеры автора. Авторы благодарят Синь-Пей Ли из Лаборатории данных о раке Национального института рака за помощь в разработке методов вычислительного анализа. Это исследование получило финансирование от Коллектива Эмерсона и Национальных институтов здравоохранения (R37CA246699, P41EB028239 и R01CA228133). Кроме того, ядро Онкологической тканевой службы Джона Хопкинса (OTS) поддерживается Национальными институтами здравоохранения (P30CA006973).