Imagem de imunofluorescência multiplex baseada em código de barras de DNA para analisar amostras FFPE de melanoma murino geneticamente reprogramado

Este protocolo fornece um guia passo a passo para projetar um painel de anticorpos de imunofluorescência multiplex para imagens baseadas em código de barras de DNA de tecidos murinos de melanoma FFPE. Também descrevemos um pipeline de análise de imagem usando ferramentas de código aberto para gerar insights proteômicos espaciais sobre o microambiente imunológico do tumor de melanoma murino.

Apresentamos aqui uma técnica emergente de imagem multiplex baseada em código de barras de DNA baseada em Co-Detection-by-indEXing que analisa a proteômica espacial de microambientes teciduais. A imagem bem-sucedida requer um repertório de painéis de anticorpos bem projetados e devidamente validados, mas existem muito poucos atualmente para amostras embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE). O FFPE oferece várias vantagens sobre amostras recém-congeladas, como ampla disponibilidade, facilidade de manuseio e armazenamento e a capacidade de fazer microarrays de tecido (TMAs). Aqui, apresentamos um protocolo para desenvolver um painel de anticorpos para visualização e análise de tecidos FFPE de um modelo de melanoma murino tratado com nanopartículas, que fornecem DNA plasmidial que codifica sinais imunológicos para reprogramação do microambiente tumoral. Também descrevemos um pipeline de análise de imagens usando ferramentas computacionais de código aberto para anotar tecidos, segmentar células, processar dados proteômicos, fenotipar populações de células e quantificar métricas espaciais. O protocolo oferece aplicações para projetar painéis de anticorpos em FFPE murino e gerar novos insights sobre a proteômica espacial de microambientes complexos de tecidos.

O melanoma cutâneo é o câncer de pele mais comum, com taxas variadas de doença e mortalidade em todo o mundo, dependendo do momento do diagnóstico e dos cuidados primários¹. Na última década, uma maior compreensão biológica do melanoma ajudou a impulsionar o desenvolvimento de novos modelos de câncer para tratar tumores sólidos². O recente aumento da imunoterapia levou a um conceito revolucionário de tratamento do câncer baseado na ativação do sistema imunológico endógeno ^3,4.

O microambiente tumoral (TME) é altamente complexo, consistindo de diversas células imunes, fibroblastos associados ao câncer, pericitos, células endoteliais e várias células residentes no tecido⁵. Várias técnicas foram aplicadas no passado para estudar o TME, como citometria de fluxo e sequenciamento de célula única, que comprometem o contexto espacial, pois são necessárias para destruir o tecido tumoral. A imagem microscópica tradicional, como imunofluorescência (IF) e imuno-histoquímica (IHC), permite a visualização de biomarcadores de proteínas sem destruir os tecidos da amostra. No entanto, essas abordagens são limitadas a dois ou três biomarcadores e são incapazes de fornecer uma compreensão completa das relações espaciais e estruturais dentro do complexo TME ⁶.

Para resolver esse problema, várias técnicas de imagem multiplex foram desenvolvidas para visualizar espacialmente o complexo TME 7,8,9,10. Um deles é o CoDetection-by-inDEXing, renomeado como sistema PhenoCycler, baseado em anticorpos conjugados com oligonucleotídeos de DNA¹¹. O sistema pode fornecer imagens e análises de células únicas de mais de 100 biomarcadores para amostras humanas. No entanto, muito poucos anticorpos inventariados estão disponíveis para visualizar e analisar amostras murinas, particularmente amostras de embebidas em parafina fixadas em formalina (FFPE)¹². O FFPE oferece várias vantagens sobre a preservação de Fresh Frozen (FF), como facilidade de manuseio e armazenamento, morfologia bem preservada ao longo do tempo e, o mais importante, a capacidade de preparar microarrays de tecido/tumor (TMA) que permitem a visualização de vários espécimes em uma única lâmina. Recentemente, projetamos e desenvolvemos um painel de anticorpos FFPE CODEX / PhenoCycler murino e o aplicamos com sucesso para visualizar e analisar a proteômica espacial de espécimes de melanoma murino geneticamente reprogramados¹³.

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um guia passo a passo para projetar um painel de anticorpos FFPE murino e descrever o processo de conjugação anticorpo-código de barras, coloração de tecido e imagem. Além disso, apresentamos um pipeline de análise de imagem detalhado utilizando ferramentas de código aberto, como os pacotes QuPath e R. Depois de seguir este protocolo, os pesquisadores aprenderão como projetar um painel de anticorpos conjugado personalizado, realizar imagens multiplex usando um dispositivo Phenocycler-Fusion e obter novos insights sobre a proteômica espacial do TME do melanoma. Além disso, este protocolo pode ser adaptado para estudar vários microambientes imunes a tumores e combinado com técnicas de transcriptômica espacial existentes.

Todo o trabalho com animais foi realizado de acordo com as diretrizes estabelecidas pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Johns Hopkins, usando os números de protocolo aprovados MO18M388 e MO21M384.

1. Seleção de anticorpos

1. Projete um painel de anticorpos com base no tecido de interesse e na abundância do biomarcador específico. Escolha clones de anticorpos com base em aplicações anteriores bem-sucedidas de coloração por imunofluorescência (IF) e imuno-histoquímica (IHQ) na literatura. Versões seguras e sem portadores desses anticorpos.
   NOTA: Um anticorpo purificado livre de portador é importante para a conjugação do código de barras. Evite conservantes à base de proteínas, como BSA, glúten, glicerol, etc. Se o anticorpo sem transportador não estiver disponível, solicite um anticorpo personalizado do fornecedor ou use um kit de remoção de BSA para fazer o anticorpo sem transportador. A azida sódica não interfere na conjugação de anticorpos. Os isotipos de IgG são recomendados em vez dos isotipos de IgM.
2. Verifique esses clones selecionados no tecido de interesse usando imagens convencionais de imunofluorescência (IF)¹¹. Use imagens de IF duplo para confirmar a especificidade de certos clones (por exemplo, realize imagens de IF duplo com FOXP3 e CD4 para confirmar a coloração de células T reguladoras).
   NOTA: Sempre que possível, é importante usar o mesmo tecido para validação de FI que será usado para coloração. Selecione a solução de recuperação de antígeno apropriada. Neste protocolo, usamos um tampão AR9 fornecido pela Akoya Biosciences para recuperar todos os epítopos de tecido FFPE de melanoma murino. Outras soluções de recuperação de antígeno, como AR6 ou Universal, podem ser usadas com base nos requisitos de epítopos.

2. Conjugação e confirmação de anticorpos

1. Atribua anticorpos verificados a códigos de barras que tenham repórteres complementares anexados a fluoróforos ATTO550 (Cy3), AF647 (Cy5) ou AF750 (Cy7). Antígenos pouco abundantes geralmente produzem sinais mais baixos; conjugar esses anticorpos com canais de baixa autofluorescência, como AF647 (Cy5). Conjugar antígenos altamente expressos para ATTO550 (Cy3) e AF750 (Cy7) devido à possibilidade de autofluorescência.
   NOTA: Esta etapa crítica considera a sensibilidade do canal e a abundância de antígenos. O uso do canal AF488 para tecido FFPE não é recomendado devido à sua maior autofluorescência.
2. Para conjugação anticorpo-código de barras (4,5 h), obtenha o kit de conjugação de anticorpos. Conservar todos os reagentes a 4 °C, exceto a solução de redução 1, que deve ser conservada a -20 °C como pequenos frascos para injetáveis de utilização única.
   1. Meça a concentração de anticorpos usando um espectrofotômetro.
   2. Inicie a conjugação de anticorpos aplicando 500 μL da solução de bloqueio do filtro a uma coluna de filtro MWCO de 50 kDa para bloquear a ligação não específica de anticorpos ao filtro. Gire para baixo a 12.000 x g por 2 min em temperatura ambiente (RT). Remova o líquido extra da coluna usando uma micropipeta de 200 μL.
      NOTA: A solução de redução 1 é um frasco de solução de uso único, suficiente para três conjugações de anticorpos por vez. Não reutilize a solução após o descongelamento; Descarte qualquer reagente restante. Não use um filtro sobre a coluna de filtro MWCO de 50 kDa, pois isso pode resultar em purificação e conjugação deficientes.
   3. Utilizar um volume equivalente de 50 μg da solução de anticorpos e adicioná-lo a um filtro MWCO de 50 kDa. Ajuste o volume total para 100 μL usando PBS, se necessário. Gire para baixo a 12.000 x g por 8 min a 4 °C. Durante este tempo, preparar a mistura principal de redução utilizando 19,8 μl de solução de redução 1 + 825 μl de solução de redução 2 para três conjugações de anticorpos.
   4. Descarte o fluxo e adicione 260 μL de mistura mestre de redução ao topo de cada unidade de filtro. Solução de vórtice na unidade de filtro por 2-3 segundos e incubar por 30 min em RT.
      NOTA: É fundamental não exceder 30 minutos de incubação para evitar a redução excessiva de anticorpos, pois isso os danifica e pode resultar em falha na conjugação.
   5. Após 30 min de incubação, gire para baixo a 12.000 x g por 8 min a 4 °C e descarte o fluxo pela parte inferior. Adicione 450 μL de solução de conjugação ao topo da coluna e gire para baixo a 12.000 x g por 8 min a 4 ° C. Durante a centrifugação, prepare a solução de código de barras CODEX. Mova-se rapidamente após recuperar o código de barras de -20 °C, pois o código de barras começa a se degradar.
      NOTA: Os códigos de barras são geralmente fornecidos em pequenos frascos de vidro contendo produtos liofilizados (flocos ou pó) armazenados a -20 °C. Esses frascos podem ser usados para conjugar 50 μg de anticorpo de uma só vez. Recomenda-se não conjugar mais de três anticorpos por vez.
   6. Localize cuidadosamente o código de barras liofilizado na parte inferior do frasco de vidro (ele também pode estar preso às paredes). Bata o frasco de vidro em uma mesa para trazer os sólidos para o fundo. A localização do produto liofilizado é essencial ao dissolvê-lo em 10 μL de água livre de nuclease para biologia molecular. Depois de adicionar 10 μL de água livre de nuclease, adicione 210 μL de solução de conjugação a cada código de barras. Dissolva todo o material liofilizado e misture delicadamente pipetando para cima e para baixo. Reservar.
   7. Depois de completar a centrifugação na etapa 2.2.5, descarte o fluxo e adicione a respectiva solução de código de barras da etapa 2.2.6 na parte superior de cada unidade de filtro. Salvar 1 μg do anticorpo não conjugado inicial; isso será executado junto com a amostra de anticorpo conjugado de 5 μL durante a validação da eletroforese em gel.
   8. Rotule cada tubo com o respectivo anticorpo e nome do código de barras. Feche a tampa e misture a solução por vórtice por 2-3 s. Incubar a reação de conjugação anticorpo-código de barras por 2 h em RT.
   9. Após 2 h de incubação, remova 5 μL de anticorpo conjugado e armazene em um tubo de PCR de 0,2 mL para confirmar a conjugação por eletroforese em gel.
   10. Gire a solução de anticorpo conjugado restante a 12.000 x g por 8 min a 4 ° C. Adicione 450 μL de solução de purificação ao topo da coluna, gire a 12.000 x g por 8 min a 4 ° C e descarte o fluxo. Repita esta etapa de purificação 2x, adicionando 450 μL de solução de purificação de cada vez e girando-a para baixo.
   11. Após a^3ª centrifugação, descarte o fluxo. O filtro superior conterá os anticorpos conjugados com código de barras.
   12. Para coletar o anticorpo conjugado, rotule o novo tubo externo que contém a coluna do filtro com o anticorpo e o código de barras correspondentes. Corte a tampa do tubo externo antes da centrifugação. Adicione 100 μL de solução de armazenamento de anticorpos a cada unidade de filtro e coloque o tubo externo recém-rotulado de cabeça para baixo no topo da coluna do filtro.
   13. Inverta a coluna do filtro para coletar o anticorpo conjugado no tubo externo e gire para baixo a 3.000 x g por 2 min em RT. Isso deve coletar cerca de 120 μL de solução de anticorpos conjugados. Transferir para um tubo de microcentrífuga estéril e conservar a 4 °C durante 18-24 meses.
       NOTA: Para evitar alta coloração nuclear de fundo após a conjugação, recomenda-se que esses anticorpos não sejam usados por pelo menos 2 dias.
3. Realize a confirmação da conjugação por eletroforese em gel, conforme descrito no protocolo¹³ já publicado.
   NOTA: Este processo apenas confirma o sucesso da reação de conjugação química usada para conjugar os códigos de barras com anticorpos. É opcional, pois a validação de anticorpos só é possível após a coloração e a imagem bem-sucedidas do tecido.

3. Preparação de amostras FFPE murinas

1. Obtenha amostras de tecido FFPE de camundongos fêmeas C57BL/6J implantados com tumores de flanco B16F10. Trate camundongos com injeções intratumorais de nanopartículas à base de poli (β-amino éster) contendo plasmídeos 4-1BBL e IL-12, juntamente com a administração intraperitoneal de anti-PD1 em 9, 11, 16 e 18 dias após a implantação¹⁴. Sacrifique camundongos no dia 20 e fixe os tumores em formalina a 10%, embebido em parafina, e depois corte no núcleo de Serviços de Tecidos de Oncologia da Johns Hopkins.
2. Considere cuidadosamente as especificações da área de imagem fornecidas no manual do usuário e monte amostras de 5 μm em uma lâmina dentro da área de imagem. Conseguimos montar quatro amostras tumorais diferentes em uma única lâmina.
   NOTA: É essencial usar os slides recomendados disponíveis para imagens, como Leica Apex Adhesive Slides ou Fisherbrand Superfrost Plus Slides. Isso ajudará a célula de fluxo a aderir firmemente ao slide.

4. Coloração e imagem latente do tecido de FFPE

1. Verificação e otimização da concentração de anticorpos e tempos de exposição: Para verificar o sucesso da conjugação anticorpo-código de barras, core o tecido de interesse com 6-9 anticorpos conjugados. Execute o dispositivo de imagem multiplex e observe cada concentração de anticorpos e tempo de exposição. Ajuste as diluições e os tempos de exposição conforme necessário, execute 6-9 novos anticorpos com os verificados anteriormente e observe quaisquer ajustes. Siga as etapas abaixo para coloração e imagem.
2. Coloração e imagem de tecidos
   1. No dia anterior à coloração, coza as lâminas de tecido FFPE num forno a 60 °C durante a noite. No dia seguinte, resfrie as lâminas por 10 min em RT antes de iniciar as etapas de desparafinização e reidratação tecidual.
   2. Inicie a desparafinização do tecido incubando em uma solução de xileno 2x por 5 min cada.
   3. Para reidratar o tecido, mova-o por duas rodadas de solução de etanol 100% por 5 min cada. Em seguida, mova-o através de uma série de soluções de álcool de 90% a 70%, 50% e 30% por 5 minutos cada. Por fim, lave o lenço com água destilada duas vezes por 5 min cada.
      NOTA: Alternativas menos tóxicas ao xileno, como uma solução Neoclear, podem ser usadas para etapas de desparafinização. Realize a desparafinização e a reidratação sob uma hotte.
   4. Dilua 10x tampão AR9 para 1x usando água destilada. Encha um frasco de Coplin com 50 mL de 1x tampão AR9, certificando-se de que as lâminas estejam totalmente imersas no tampão de recuperação de antígeno.
   5. Encha uma panela de pressão com água para que o nível fique na metade do frasco Coplin e, em seguida, incube sob alta pressão por 20 min.
      NOTA: É possível usar uma panela de pressão especializada ou uma câmara de desativação para melhor recuperação de antígenos, ajustando-a a 120 ° C por 10 min.
   6. Depois de concluir a etapa da panela de pressão, resfrie as lâminas por 45-60 min. Enxágue a lâmina com água destilada 2x por 2 min cada. Em seguida, transfira a lâmina para o frasco contendo 1x PBS.
   7. Para minimizar a autofluorescência, execute uma etapa de clareamento no tecido antes de corar com anticorpos. Prepare uma solução clareadora na hora (25 mL de 1x PBS + 0,8 mL de NaOH 1M + 4,5 mL de H₂O₂) usando os reagentes e concentrações recomendados. Incube as lâminas em um recipiente plástico contendo a solução de branqueamento entre duas lâmpadas LED por 45 min em temperatura ambiente. Repita com solução de branqueamento fresca por mais 45 min.
   8. Comece a preparar a solução de coquetel de anticorpos durante esta etapa de branqueamento, especialmente se houver vários anticorpos no painel com várias diluições. Recupere todos os quatro bloqueadores (G, S, J e N) e coloque-os no gelo, pois alguns demoram para descongelar a partir de -20 °C.
   9. Após o fotobranqueamento, lave o tecido com 1x PBS, 2x por 2 min cada. Mova o lenço para potes contendo tampão de hidratação e lave 2x por 2 min cada.
   10. Transfira as lâminas de tecido para o tampão de coloração e deixe-as equilibrar por 30 min. Se não estiver preparado durante a etapa de branqueamento, prepare a solução de coquetel de anticorpos durante esse período.
   11. Prepare 300 μL de solução de coquetel de anticorpos para corar duas lâminas (geralmente, se estiver usando uma câmara de plástico de hibridização, 100-120 μL de coquetel de anticorpos são suficientes para corar cada lâmina).
   12. Manchar as lâminas aplicando uma solução de coquetel de anticorpos dentro da câmara de umidade durante a noite a 4 °C.
       NOTA: Todos os anticorpos aqui mostram um sinal positivo quando corados durante a noite a 4 °C. No entanto, o tempo e a temperatura de coloração de cada anticorpo podem variar e devem ser otimizados. As condições de coloração mais comumente usadas são 3 h em RT ou durante a noite a 4 °C. Se necessário, também é possível corar alguns anticorpos inicialmente a diferentes temperaturas e depois os restantes anticorpos durante a noite a 4 °C. Lave o tecido depois com PBS se for necessária coloração sequencial.
   13. No dia seguinte, faça a fixação pós-coloração. Remover a câmara de plástico e conservar o cocktail de anticorpos recolhido a 4 °C. Lave as lâminas 2x no tampão de coloração por 2 min cada. Em seguida, mova as lâminas para uma solução fixadora pós-coloração de 40 mL (4 mL de paraformaldeído a 16% + 36 mL de tampão de armazenamento) e incube por 10 min. Enxágüe com PBS 3x por 2 min cada.
   14. Mova as lâminas para o metanol gelado por 5 min e depois enxágue com PBS 3x por 2 min cada. Aplique uma solução fixadora final (20 μL de um tubo + 1 mL de PBS) nas lâminas sob uma câmara de umidade. Normalmente, 200 μL da solução fixadora são suficientes por lâmina. Deixe o fixador descansar por 20 min em RT. Execute três lavagens finais em PBS por 2 min cada.
       NOTA: Não remova o tubo fixador de -20 °C previamente; apenas descongele antes de aplicar.
   15. Se a imagem for imediata, limpe a lâmina ao redor do tecido usando um tecido sem fiapos e aplique a célula de fluxo pressionando-a por 30 s usando o equipamento de montagem da célula de fluxo. Se a imagem for posterior, armazene a lâmina (sem aplicar a célula de fluxo) no tampão de armazenamento a 4 °C. Quando estiver pronto para criar imagens, transfira as lâminas do buffer de armazenamento para o PBS por 10 minutos antes de aplicar a célula de fluxo.
3. Comece a preparar o buffer de execução 1x com aditivo com base nos ciclos desejados no experimento. Prepare buffers DMSO baixos (1:4) e altos (9:1) misturando como DMSO de 1 parte com buffer de execução de 4 partes e DMSO de 9 partes com buffer de execução de 1 parte necessário para os ciclos desejados. Economize cerca de 20 mL de 1x tampão com aditivo para fazer uma placa repórter. Para calcular o buffer 1x necessário com buffers aditivos e DMSO alto/baixo, consulte o gerenciador de instrumentos.
4. Comece a preparar a placa do repórter. Primeiro, torne a solução de estoque do repórter necessária para o número total de ciclos. Rotule os tubos de microcentrífuga de 1 mL de cor preta ou âmbar com os nomes dos ciclos. Adicione 250 μL de solução estoque repórter e 5 μL de cada repórter ao tubo correspondente. Em seguida, transfira a solução para uma placa preta de 96 poços e sele-a com papel alumínio.
5. Inicie o dispositivo, use o gerenciador de instrumentos para definir os parâmetros e tempos de exposição (conforme a Tabela 1) e adquira as imagens. A Figura 1 resume os processos pré e pós-coloração.

5. Anotação de tecido e segmentação celular

1. Configure um projeto e um espaço de trabalho.
   1. Instale a versão mais recente do software de análise de patologia digital (por exemplo, QuPath versão 0.5.1 ou superior). Clique em Criar projeto para escolher uma pasta de destino para o espaço do projeto.
   2. Clique em Adicionar imagens > Escolher arquivos e navegue até o arquivo QPTIFF (produzido a partir de imagens de imunofluorescência multiplex). Defina o tipo de imagem como Fluorescência, mantenha todas as outras configurações padrão e clique em Importar.
   3. Se estiver usando o QuPath, clique duas vezes na nova imagem para abrir um espaço de trabalho. Clique em Arquivo > Salvar periodicamente para acompanhar as alterações feitas no projeto. Alterne a visibilidade do marcador e as configurações de visualização usando o Brilho e contraste (ícone de meia-lua) próximo ao meio da barra de ferramentas.
      NOTA: Clique com o botão direito do mouse em uma imagem na lista de imagens para renomeá-la. Isso será importante mais tarde, ao visualizar as classificações de fenótipo.
2. Anote a seção completa do tecido, o compartimento intratumoral e o compartimento estromal.
   1. Use a ferramenta pincel e/ou varinha para desenhar uma anotação ao redor de toda a seção de tecido. Defina essa anotação como Full_Tissue. Exclua a pele sobrejacente e/ou quaisquer regiões que não devam ser analisadas. Para criar uma anotação negativa e/ou reduzir o limite da anotação, mantenha pressionada a tecla Alt enquanto usa uma das ferramentas de anotação.
   2. Duplique a anotação completa do tecido. Selecione a Anotação na guia Anotações e vá para Objetos > Anotações... > Duplicar as anotações selecionadas.
   3. Ligue o canal SOX10. Na anotação duplicada, reduza o limite da anotação para capturar o compartimento intratumoral usando a ferramenta Alt + pincel/varinha. Defina essa anotação como um Tumor (Figura 2).
   4. Selecionando a anotação de tecido completo, vá para Objetos > Anotações... > Expanda as anotações. Defina o raio de expansão como 1 μm e clique em Executar.
   5. Renomeie a nova anotação como Full_Tissue_Expansion. Selecione a Anotação do tumor, clique com o botão direito do mouse e selecione Inserir na hierarquia.
   6. Selecione novamente a Anotação do Tumor, vá para Objetos > Anotações... > Faça o inverso. Defina essa nova anotação como Stroma. Repita para todas as seções de tecido.
3. Execute a segmentação de células e exporte os resultados.
   1. Vá para a guia Imagem para encontrar a largura e a altura do pixel da imagem (Figura 3A).
   2. Baixe a extensão StarDist em https://github.com/qupath/qupath-extension-stardist/releases. Arraste o ficheiro qupath-extension-stardist-[version].jar para a janela do QuPath e, em seguida, clique no ícone de roda dentada no canto superior direito da janela do QuPath. Em Extensões, defina o diretório de usuários do QuPath como o local da pasta StarDist.
   3. Faça o download dos arquivos de script groovy do StarDist e do arquivo de modelo do StarDist do https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (os scripts do StarDist foram originalmente organizados a partir da Akoya Biosciences).
   4. Para cada seção de tecido, selecione as anotações Tumor e Estroma (use Ctrl para selecionar várias anotações). Na barra de configurações superior, clique em Automatizar > editor de scripts para abrir a interface de scripts. Abra o script de segmentação de célula StarDist apropriado (arquivo groovy) que corresponde ao tamanho do pixel da imagem. Quando solicitado a selecionar o arquivo de segmentação de célula, abra o arquivo stardist_cell_seg_model.pb.
   5. Após a segmentação da célula, salve a imagem. Vá para Medir > Exportar medições e selecione a (s) imagem(ns) correspondente(s). Atribua o tipo de exportação como Células e Separador como .csv e escolha o local do arquivo de saída . Clique em Preencher ao lado de Colunas para incluir métricas de interesse. As colunas importantes a serem exportadas são Imagem, ID do objeto, Pai, Centroide X, Centroide Y e Área do núcleo.
      NOTA: O ID do objeto é usado nas etapas subsequentes para remapear as classificações de volta para a imagem de imunofluorescência multiplex no software de análise de patologia digital. A coluna Pai indica o nome da anotação à qual a célula pertence. Os dados X e Y são usados para análise espacial.
   6. Para cada marcador de linhagem a ser usado no agrupamento/fenotipagem, selecione um valor médio para exportar. Para marcadores nucleares (por exemplo, SOX10 e FOXP3), exporte a opção Núcleo: Média. Para marcadores citoplasmáticos/membranosos (por exemplo, CD45, CD3, CD4), exporte a opção Citoplasma: Média.

6. Pré-processamento e normalização de dados proteômicos

1. Abra o arquivo CSV exportado. Para cada marcador a ser usado em agrupamento/fenotipagem, trunque o nome do cabeçalho da coluna para incluir apenas o marcador. Por exemplo, renomeie SOX10: Núcleo: Média para SOX10 e CD3: Citoplasma: Média para CD3.
2. Instale a versão mais recente do R e do RStudio. Baixe o arquivo Marker Normalization.R do https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis e execute o script. Isso primeiro envolve filtrar as células pelo tamanho nuclear.
3. Para cada marcador, uma normalização mín-máx é executada para que o valor MFI mais baixo no intervalo de expressão seja definido como 0 e o valor MFI no percentil 99,7 seja definido como 1. Todas as intensidades acima^{do percentil} 99,7 são cortadas em 1. Depois de concluído, salve o novo arquivo CSV gerado com os dados normalizados.

7. Agrupamento e fenotipagem

1. Escolha um algoritmo para agrupar células de acordo com os perfis de expressão do marcador. No https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis, os scripts R são fornecidos para clustering usando Seurat v4.4¹⁵ e FlowSOM v2.13.9 (ferramenta de clustering e visualização)¹⁶.
2. Células fenotípicas de acordo com os perfis de expressão de marcadores de linhagem-chave. O protocolo aqui apresentado utilizou 14 marcadores de linhagem para agrupamento e fenotipagem: SOX10, CD45, CD3, CD4, CD8, FOXP3, CD11C, F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206, NK1.1 e CD31.
   1. Defina células tumorais como SOX10^hi. Defina as células T CD4 como CD45^mod-hi / CD4^hi / CD8^low / FOXP3^low. Defina as células T CD8 como CD45^mod-hi / CD8^hi / CD4^low. Defina Tregs como CD45^mod-hi/CD4^hi/CD8^low/FOXP3^hi. Defina outras células T como CD45^mod-hi / CD3^hi / CD4^low / CD8^low.
   2. Defina os macrófagos M1 como CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^hi/CD86^hi/CD163^low /CD206^low. Defina macrófagos M2 como CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^hi/CD206^low, CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^low/CD206^hi, ou CD45^mod-hi/F4/80^hi/CD68^mod-hi/CD86^low/CD163^hi/CD206^hi. Defina outros macrófagos como CD45^mod-hi / F4 / 80^hi / CD68^mod-hi / CD86^low / CD163^low / CD206^low ou CD45^mod-hi / F4 / 80^hi / CD68^mod-hi / CD86^hi / CD163^hi / CD206^hi.
   3. Defina as células dendríticas como CD45^mod-hi / CD11c^hi / CD86^mod-hi. Defina as células NK como CD45^mod-hi/NK1.1^hi. Defina outras células imunes como CD45^mod-hi que não satisfizeram as condições detalhadas acima. Defina as células endoteliais como CD31^mod-hi. Remova todos os outros perfis de expressão.

8. Remapeamento de classificações de fenótipos e realização de controle de qualidade

1. Baixe o script Remapping Classifications.groovy do https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis (este script foi adaptado de uma postagem no https://forum.image.sc/ por petebankhead).
2. Abra o arquivo CSV fenotipado e certifique-se de que todos os rótulos na guia Imagem correspondam exatamente ao nome do arquivo de imagem no software de análise de patologia digital que será usado para remapeamento. Para alterar grandes quantidades de rótulos rapidamente no arquivo CSV, use a função Substituir tudo.
3. Se estiver usando o QuPath, execute o arquivo groovy de remapeamento de classificações clicando em Automatizar > editor de scripts.
4. Na guia Anotações, clique em Três pontos ao lado do botão Definir automaticamente e, em seguida, clique em Preencher a partir de objetos existentes > Todas as classes (incluindo subclasses) > Sim.
5. Role para baixo na lista de marcadores para visualizar as diferentes classificações de fenótipo e ajuste o esquema de cores conforme necessário. Clique duas vezes em qualquer célula para visualizar seu fenótipo (ao lado da tag Classificação) e cluster (ao lado da tag Name). Verifique os campos de visão representativos para determinar a precisão das atribuições de fenótipo e revise a estratégia de fenotipagem conforme necessário (Figura 3B).

9. Quantificação de densidade e análise espacial

1. Assim que a fenotipagem for finalizada, obtenha as áreas de anotação no software de análise de patologia digital na guia Anotações. Converta os valores da área para mm² e, em seguida, divida as contagens por áreas de anotação para calcular as densidades.
2. Baixe o script SPIAT Spatial Analysis.R do https://github.com/xzhou125/JOVE_QuPath_Spatial_Analysis e execute. Colete dados sobre distâncias mínimas médias (AMD), composições de vizinhança e pontuações de mistura normalizadas (NMS).
3. Gere números em software de análise estatística para apresentar descobertas. Ao gerar um único mapa de calor para distâncias mínimas médias das condições de tratamento, calcule a média dos resultados obtidos de diferentes seções de tecido.

Aqui, apresentamos um protocolo para projetar um painel de anticorpos para tecido FFPE murino, realizar imagens de imunofluorescência multiplex e analisar imagens para quantificação proteômica e relações espaciais. O painel validado contém 27 anticorpos que fornecem marcadores para visualizar células de melanoma (SOX10), leucócitos (CD45), células T (CD3, CD4, CD8, FOXP3), células B (CD20), macrófagos e subtipos (F4/80, CD68, CD86, CD163, CD206), células dendríticas (CD11c), células NK (NK1.1) e células endoteliais (CD31). O painel completo também contém marcadores para outras populações imunes (CD11b, CD38), atividade de proliferação (Ki67), funcionalidade de células T (T-bet, Eomesodermina, granzima B), apresentação de antígenos (LMP2, microglobulina beta-2, MHC II) e expressão de checkpoint (TIM3, LAG3, PD-L1)¹². Uma imagem representativa de eletroforese em gel confirma a conjugação bem-sucedida de códigos de barras de oligonucleotídeos de DNA com os anticorpos livres de carreador, conforme mostrado na Figura 4. Esta etapa apenas confirma a reação química, e a confirmação da imagem só pode ser feita após a verificação desses anticorpos com o dispositivo de imagem multiplex no tecido de interesse. Consulte a referência a seguir para visualizar imagens validadas de todos os 27 marcadores no painel¹³. Uma imagem de fusão dos principais marcadores de linhagem que colorem três seções de tecido de melanoma murino tratadas com injeções intratumorais de nanopartículas 4-1BBL/IL-12 e anti-PD1 sistêmico é apresentada na Figura 5. Essas seções foram usadas para análise de imagem subsequente neste protocolo.

Após anotação de tecido, segmentação celular e pré-processamento de dados proteômicos, apresentamos uma comparação entre dois algoritmos de agrupamento que foram aplicados anteriormente para análise transcriptômica e/ou proteômica de célula única^17,18. Os perfis de expressão para populações fenotipadas são apresentados na Figura 6 para ambas as abordagens. Mostramos que o FlowSOM oferece uma gama mais ampla de valores de intensidade (~ 0,7 vs ~ 0,5) para discernir diferenças entre populações de células semelhantes, como subtipos de macrófagos. Seurat aplicou o algoritmo de Louvain durante o agrupamento e gerou 29 clusters (Figura Suplementar 1). Em comparação, o FlowSOM aplicou mapas auto-organizados e pode gerar 100 clusters (Figura Suplementar 2). Um número maior de clusters se traduz em mais tempo necessário para a fenotipagem, mas esta última abordagem FlowSOM também oferece mais nuances ao classificar populações de células semelhantes. Qualitativamente, vemos que o FlowSOM foi capaz de classificar mais macrófagos intratumorais como um subtipo M1 ou M2 quando comparado à fenotipagem de Seurat no mesmo campo de visão (Figura 7). O mesmo resultado é visto quando quantificamos as densidades de macrófagos, com o FlowSOM capturando uma densidade mais alta de macrófagos M1 e M2 em comparação com o Seurat (Figura 8A-B) e, subsequentemente, uma densidade significativamente menor de macrófagos outros/não classificados (p = 0,0028; Figura 8C). No entanto, as duas abordagens de análise também geraram resultados semelhantes ao descrever outras densidades populacionais de células, como células T CD4, células T CD8 e células endoteliais (Figura 8D-F).

Também apresentamos os resultados da análise espacial a jusante após agrupamento e fenotipagem. A Figura 9 demonstra algumas das métricas espaciais que podem ser geradas usando esse protocolo. Em relação a todas as populações fenotipadas, os macrófagos M2 e as células NK tiveram as DMRI mais altas após o tratamento com nanopartículas 4-1BBL / IL-12 e anti-PD1 (Figura 9A). Da mesma forma, a SNM entre células T CD8 intratumorais e macrófagos M1 foi muito maior do que entre células T CD8 e macrófagos M2 (Figura 9B). Além disso, os macrófagos M2 contribuíram com ~ 1% na vizinhança de 100 μm ao redor das células T CD8 intratumorais, enquanto os macrófagos M1 constituíram 9% -13% dessas vizinhanças (Figura 9C). Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que o regime de tratamento 4-1BBL/IL-12 polarizou os macrófagos associados ao tumor em direção a um subtipo M1 e excluiu os macrófagos M2 do microambiente imune do tumor.

Figura 1: Resumo do fluxo de trabalho de coloração e imagem de tecido FFPE. Os tecidos murinos FFPE foram processados usando procedimentos de pré-coloração que começaram com o cozimento do tecido durante a noite antes de iniciar os processos de pré-coloração (dia 1) e pós-coloração (dia 2) de dois dias. Por fim, a placa repórter foi preparada antes da imagem com o aparelho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Captura de tela da anotação de tecido no software de patologia digital de acesso aberto QuPath. A anotação tecidual completa foi desenhada (verde), duplicada e minimizada para definir o compartimento intratumoral de acordo com a distribuição de melanócitos SOX10+ no limite do tumor (vermelho). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: Segmentação celular usando o algoritmo StarDist no QuPath e processo de controle de qualidade para revisar classificações de fenótipo. (A) Navegue até a guia Imagem para determinar a largura e a altura do pixel da imagem de imunofluorescência multiplex. (B) Depois de remapear as classificações, clique duas vezes em qualquer célula (fica destacada em amarelo) para ver sua atribuição de cluster e fenótipo. Ative/desative os marcadores do painel para determinar se essa abordagem de classificação é precisa. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: Imagem de gel representativa da confirmação da conjugação do código de barras anticorpo-DNA. A eletroforese em gel de proteína confirma a conjugação de anticorpos com códigos de barras de oligonucleotídeos de DNA, observados por bandas adicionais no local da cadeia pesada. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: Imagem multiplex baseada em código de barras de DNA de tumores de flanco B16F10 tratados com injeções intratumorais de nanopartículas 4-1BBL/IL-12 com anti-PD1 sistêmico. Marcadores em nosso painel não mostrados: CD11b, CD20, CD38, TIM3, LAG3, T-bet, Eomesodermina, granzima B, Ki67, LMP2, beta-2 microglobulina, MHC II, PD-L1. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 6: Mapas de calor de expressão proteômica de populações de células fenotipadas. (A) A abordagem de agrupamento e fenotipagem de Seurat gera uma faixa ligeiramente menor de valores de expressão de marcadores em comparação com (B) Agrupamento e fenotipagem de FlowSOM. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 7: A fenotipagem FlowSOM identifica uma gama maior de diferentes subtipos de macrófagos. O painel superior mostra a fenotipagem de macrófagos Seurat (esquerda) e FlowSOM (direita) para o mesmo campo de visão. O painel inferior mostra imagens de imunofluorescência multiplex dos principais marcadores de linhagem de macrófagos no mesmo campo de visão. Todas as barras de escala são de 20 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 8: Comparando densidades intratumorais de diferentes populações de células após agrupamento/fenotipagem. Comparações de densidade são mostradas para macrófagos intratumorais (A) M1, (B) macrófagos M2, (C) outros macrófagos, (D) células T CD4, (E) células T CD8 e (F) células endoteliais. As barras de erro são erros padrão da média (EPM) e a significância foi testada usando testes t não pareados (**p ≤ 0,01). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 9: Traçando o perfil das métricas espaciais intratumorais para três tumores de flanco tratados com injeções de nanopartículas intratumorais 4-1BBL/IL-12 e anti-PD1 sistêmico. (A) Mapa de calor das distâncias mínimas médias entre populações fenotipadas intratumorais. As medições estão em μm. (B) Escores de mistura normalizados entre os principais pares de fenótipos intratumorais. (C) Quebra das composições de vizinhança em um raio de 100 μm em torno de populações de células T CD8 intratumorais. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Diluição de anticorpos e configurações de tempo de exposição.

Figura suplementar 1: Mapa de calor de expressão proteômica inicial gerado após o agrupamento Seurat. Clique aqui para baixar esta figura.

Figura suplementar 2: Mapa de calor de expressão proteômica inicial gerado após o agrupamento FlowSOM. Clique aqui para baixar esta figura.

O sucesso da imagem depende de um painel de anticorpos bem projetado e validado. A imagem de imunofluorescência multiplex de amostras FFPE apresenta desafios devido à alta autofluorescência e à dificuldade de recuperação de epítopos mascarados por inclusão em parafina. No entanto, dado que o FFPE oferece várias vantagens em comparação com as amostras FF, é essencial projetar e validar os painéis de anticorpos FFPE. Finalizar os clones de anticorpos que mostram sinais positivos durante a imagem de imunofluorescência (IF) é o primeiro passo; posteriormente, é importante conjugá-los cuidadosamente com códigos de barras de DNA. A conjugação de anticorpos requer redução parcial do anticorpo para criar ligações SH, que são utilizadas durante a reação do grupo maleimida com um código de barras. Nem todo clone de anticorpo pode suportar essa etapa, e algumas reações podem causar danos irreversíveis ao anticorpo, resultando em falha de imagem apesar da conjugação bem-sucedida. Por esse motivo, embora alguns anticorpos possam apresentar sinais positivos durante a validação convencional do FI, para avaliar o sucesso final da conjugação do anticorpo, é importante validar cada anticorpo no tecido real de interesse e registrar os tempos de exposição desejados para esse tecido. Em aplicações futuras, essa técnica pode ser combinada com a análise transcriptômica espacial existente em lâminas consecutivas/na mesma lâmina para gerar insights adicionais. Uma das limitações desse método é que ele requer uma seleção e validação cuidadosas de cada anticorpo no painel com base no alvo e no tipo de tecido.

No que diz respeito à análise de imagens, o QuPath oferece uma valiosa ferramenta de acesso aberto com visualização de alta qualidade de marcadores proteómicos, ampla funcionalidade para exportar medições de intensidade e realizar controlo de qualidade para classificações de fenótipos e boa flexibilidade para scripts gerados pelo utilizador. Fóruns on-line, como o https://forum.image.sc/, são um recurso adicional para discutir como realizar tarefas de análise específicas e para compartilhar scripts com outros usuários. Neste protocolo, comparamos duas abordagens de agrupamento e fenotipagem usando Seurat e FlowSOM. Embora o FlowSOM possa ser preferido por sua capacidade de gerar insights mais granulares sobre as subpopulações de células imunes do TME, o tempo necessário para a análise proteômica também deve ser levado em consideração. A geração de 100 clusters pode ser desnecessária se um usuário precisar apenas fenotipar células em uma ou duas amostras de tecido. Nessas situações, a Seurat pode oferecer um pipeline mais rápido e eficiente para análise de imagens. Em contraste, a análise de um TMA com mais de 40 ou 50 seções de tecido tem maior probabilidade de produzir um número maior de aglomerados de células em ambas as abordagens de análise, e o FlowSOM pode ser a metodologia preferida para gerar classificações de fenótipos mais sutis.

O agrupamento/fenotipagem de células e todas as etapas subsequentes de análise de imagem dependem em grande parte da segmentação celular. Nosso trabalho atual explorou a segmentação celular nos algoritmos HALO (Indica Labs) e StarDist, e descobrimos que ambas as abordagens tendem a segmentar células com base em sinais DAPI nucleares. Muitos algoritmos de segmentação alternativos também estão disponíveis, como Mesmer¹⁹ e InstanSeg²⁰. Este é um campo crescente de pesquisa computacional que requer mais exploração e otimização.

JCS reconhece o apoio financeiro da Emerson Collective LLC e dos Institutos Nacionais de Saúde. J.J.G. também reconhece o financiamento dos Institutos Nacionais de Saúde. A J.C.S. tem um relacionamento com a Palleon Pharmaceuticals Inc., que envolve doações de financiamento. A S.Y.T. e a J.J.G. têm um relacionamento com a OncoSwitch Therapeutics que envolve ações ou ações. S.Y.T., J.J.G., J.C.S. e K.M.L. têm uma patente pendente. Todos os outros autores afirmam que não têm interesses financeiros concorrentes conhecidos ou relacionamentos pessoais que possam ser percebidos como influenciando a pesquisa apresentada neste artigo.

J.C.S. reconhece a Fundação de Dermatologia e o Prêmio de Desenvolvimento de Carreira em Dermatopatologia pelo avanço da carreira do autor. Os autores agradecem a Hsin-Pei Lee, do Laboratório de Ciência de Dados do Câncer do Instituto Nacional do Câncer, pela assistência com as técnicas de análise computacional. Esta pesquisa recebeu financiamento do Emerson Collective e dos Institutos Nacionais de Saúde (R37CA246699, P41EB028239 e R01CA228133). Além disso, o núcleo Johns Hopkins Oncology Tissue Services (OTS) é apoiado pelo National Institutes of Health (P30CA006973).