Доклиническая модель пренатального воздействия дельта-9-тетрагидроканнабинола для оценки его влияния на исходы развития нервной системы

Поскольку законодательные ограничения меняются, что приводит к повышению доступности каннабиноидных продуктов, критически важно разработать модели для изучения влияния этих воздействий, особенно во время беременности. Была разработана доклиническая модель умеренного пренатального воздействия каннабиноидов при добровольном приеме внутрь, что позволяет проводить более глубокие исследования.

Пренатальное воздействие каннабиноидов (PCE) становится все более частым, поскольку все больше штатов по всей территории Соединенных Штатов легализуют рекреационную марихуану (каннабиноиды). Потребление каннабиноидных продуктов во время беременности было связано с различными аномальными исходами, хотя исторические исследования проводились в то время, когда эффективность этих продуктов была примерно на 300% ниже, чем у современных продуктов. Учитывая растущее использование каннабиноидов, важно понимать потенциальное влияние ПКЭ на развитие нервной системы плода и последующее развитие младенцев и детей. Предыдущие исследования показали, что ОФП негативно влияет на обучение и память, поведенческие навыки, сон и внимание у потомства. Целью данного исследования является повторение ОФП путем добровольного приема дельта-9-тетрагидроканнабинола (ТГК), психоактивного компонента каннабиноидных продуктов, во время беременности в доклинической модели. В этой статье описана процедура достижения умеренного ОФП на протяжении всей беременности. В этой модели контрольная группа потребляет обычное мини-печенье с шоколадом и арахисовым маслом, в то время как группа PCE потребляет ТГК, смешанный с арахисовым маслом в сочетании с мини-шоколадным печеньем. Такой подход позволяет глубже изучить влияние ОФП на результаты развития.

Поскольку показатели употребления пренатальных каннабиноидных^{продуктов увеличиваются}, вероятно, под влиянием растущей легализации каннабиноидных продуктов в Соединенных Штатах, необходимы исследования, чтобы лучше понять их влияние на развитие плода. Дельта-9-тетрагидроканнабинол (ТГК), психоактивный компонент каннабиноидных продуктов, легко проникает через плаценту и взаимодействует с эндогенной эндоканнабиноидной системой ^2,3. Эндогенная эндоканнабиноидная система играет решающую роль в развитии нервной системы и может быть путем, по которому происходят изменения в развитии. Употребление каннабиноидов во время беременности связано со снижением веса при рождении⁴ и повышенным риском преждевременных родов ^5,6. Также сообщалось о дополнительных аномалиях развития, таких как дефицит социального поведения и исполнительных функций на протяжении всей жизни ^7,8,9.

Со временем изменения в потенции каннабиноидов и характере их использования среди населения в целом высветили необходимость детальных исследований потенциального влияния пренатального воздействия на развитие плода. Использование каннабиноидных продуктов во время беременности растет, поскольку эти продукты часто воспринимаются как облегчающие такие симптомы, как депрессия, стресс, боль, нарушения сна и тошнота^. Dickson et ^al.12 провели исследование, изучающее рекомендации 400 диспансеров каннабиса относительно употребления каннабиса в первом триместре в Колорадо, и обнаружили, что примерно половина диспансеров (50,5%) рекомендовали пищевые продукты беременным женщинам. Часто считается, что пищевые продукты избегают вреда и рисков для здоровья, связанных с курением^13,14, что приводит к тому, что многие беременные женщины употребляют пищевые продукты.

Пищевые продукты доставляют каннабиноиды через желудочно-кишечную систему, где ТГК всасывается в кровоток и транспортируется через воротную вену в печень для первого прохождения метаболизма. В печени ферменты гидроксилат ТГК производят 11-гидрокситетрагидроканнабинол (11-ОН-ТГК), высокомощный психоактивный метаболит, который легко проникает через гематоэнцефалический барьер¹⁵. Несмотря на то, что для первоначального психоактивного эффекта съедобных продуктов требуется больше времени (30-90 минут), полученный «кайф» длится дольше, достигая пика через 2-4 часа после приема^16,17 минут. Фармакокинетический период полувыведения ТГК составляет 1,3-7,3 ч у крыс^18,19.

Учитывая растущее использование ТГК во время беременности и нехватку данных о его влиянии на нервное развитие плода, была разработана доклиническая модель добровольного приема ТГК во время беременности, более тесно согласующаяся с зарегистрированным типичным использованием человеком (пероральное употребление для облегчения тошноты) для дальнейшего описания влияния на исходы развития нервной системы.

Все описанные здесь процедуры были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию (IACUC) Центра медицинских наук Университета Нью-Мексико (UNM HSC). Все эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями ARRIVE. Крысы Лонг-Эванса (Blue Spruce, HsdBlu: LE) были получены из коммерческого источника. В качестве самцов использовались взрослые племенные крысы, возраст которых составлял 12 недель на момент прибытия и 15-16 недель в начале протокола разведения. Самки весили 125-150 г и на момент прибытия им было примерно 6-7 недель. На момент размножения самкам было примерно 9-10 недель. Очень важно убедиться, что все будущие матери не имеют предшествующей истории беременности. Выделите не менее одной недели на адаптацию к учреждению и новым условиям проживания. Первая часть этого протокола посвящена употреблению каннабиноидов до беременности, а вторая часть посвящена воздействию каннабиноидов во время беременности. Подробная информация об используемых животных, реагентах и оборудовании представлена в Таблице материалов. План эксперимента представлен на рисунке 1.

1. Воздействие каннабиноидов до беременности

1. Жилье и обслуживание
   1. Содержать животных индивидуально в стандартных крысиных статических микроизоляторах с подстилкой при температуре 22 °C по обратному 12-часовому графику свет/темнота (свет включен с 21:00 до 09:00 ежедневно).
   2. Обеспечьте доступ к облученным пищам (см. Таблицу материалов) и водопроводной воде в неограниченном количестве на протяжении всего исследования.
2. Материал и химическая подготовка
   1. Получите все необходимые материалы и химикаты (как указано в Таблице материалов).
   2. Храните ТГК исследовательского качества во флаконах, содержащих 10 мг/мл или 20 мг/мл ТГК, растворенного в этаноле.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ), так как ТГК является раздражителем кожи и опасностью аспирации. Храните ТГК в стальном шкафу, так как Министерство здравоохранения и социальных служб США и Управление по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США классифицируют его как контролируемое вещество из Списка I.
3. Базовые измерения
   1. Получите исходную массу тела для каждой самки крысы.
   2. При необходимости приостановите эксперимент на 1-2 недели.
4. Приготовление печенья с добавлением ТГК
   1. Готовьте печенье за 30 минут до введения в 14:00 ежедневно, чтобы поддерживать постоянное время кормления.
   2. Отделите мини-шоколадное печенье и добавьте в крем примерно половину чайной ложки арахисового масла.
   3. Смешайте необходимую дозу ТГК (1,5 мг/кг в течение первых 2 дней, затем 3 мг/кг в течение 7 дней) с арахисовым маслом перед сборкой печенья.
5. Оценка потребления
   1. Приготовьте обычное печенье с арахисовым маслом / мини-шоколадом на 2-4 дня до достижения стабильного потребления. Уберите воду из клетки и давайте угощение каждой крысе с помощью щипцов ежедневно в 14:00.
   2. Наблюдайте до тех пор, пока лакомство не будет полностью употреблено. При необходимости удалите остатки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вводите ТГК в дозе 1,5 мг/кг в течение 2 дней, затем 3 мг/кг в течение 7 дней. Оставьте лакомства в клетке на срок до 2 часов для крыс, которые не употребляют сразу.
   3. Продолжайте работу только с крысами, которые постоянно потребляют лакомство. Исключите из эксперимента те, у которых прием внутрь был непостоянным.
   4. Оцените потребление до беременности в течение 2 недель.
6. Групповое распределение после ОФП
   1. Назначьте крыс с постоянным приемом пищи случайным образом в группу простых (контрольных) или содержащих ТГК (PCE) печенье.
   2. Дайте минимум 4 дня без файлов cookie перед разведением, чтобы обеспечить выведение ТГК из их систем.

2. Воздействие каннабиноидов во время беременности (пренатальное)

1. Размножение и подтверждение беременности
   1. Взвесьте самок, чтобы получить стартовый вес, прежде чем помещать их в клетку с проверенным заводчиком-самцом (самец наивно настроен в отношении ТГК).
   2. Следите за тем, чтобы самки крыс не ели печенье в течение этого времени.
   3. Подтвердите беременность по наличию вагинальной пробки, что обычно происходит через 24 часа после спаривания.
   4. Взвесьте самку крысы и верните ее в домашнюю клетку. Это определяется как гестационный день (ГД) 1.
2. Инфузия ТГК во время беременности
   1. Принимайте обычное печенье или печенье с добавлением ТГК (3 мг/кг) в 14:00 ежедневно, начиная с 1 GD в течение всей беременности.
   2. Продолжайте этот режим до тех пор, пока не будет замечено, что плотица гнездится для доставки, после чего воздействие ТГК прекращается.
3. Контроль прибавки в весе матери
   1. Взвешивайте крысиных матерей два раза в неделю, чтобы оценить прибавку в весе матери.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Новые веса также используются для расчета количества ТГК, которое должно быть включено в печенье, корректируя дозу по мере необходимости в зависимости от веса матери.
4. Прекращение контакта с ТГК и документация о рождении
   1. Прекратите процедуры воздействия ТГК, когда плотина гнездится примерно в ожидаемое время доставки.
   2. Как только потомство появится на свет, запишите количество живых щенков.
   3. Обозначьте день рождения как послеродовой день (P) 0.
5. Отъем и содержание потомства
   1. Отлучение потомства от груди на 23-й день после родов (Р).
   2. Групповое размещение отлученного от груди потомства с однопометниками по признаку пола.
6. Эвтаназия плотин
   1. После того, как помет будет отлучен от груди, усыпьте самок в соответствии с утвержденными в учреждении протоколами.

3. Постпроцедурные шаги

1. Содержание и мониторинг потомства
   1. Убедитесь, что все потомство содержится в надлежащих жилищных условиях, обеспечивая надлежащую температуру, свет и вентиляцию.
   2. Регулярно наблюдайте за щенками на предмет любых проблем со здоровьем или развитием, таких как аномальная масса тела или задержка в развитии.
2. Базовая оценка
   1. При необходимости оцените исходные показатели, такие как масса тела, рефлексы или другие соответствующие параметры развития, прежде чем начинать эксперименты на потомстве.
3. Распределение экспериментальных групп
   1. Распределяйте щенков по экспериментальным группам случайным образом, чтобы свести к минимуму любые погрешности при тестировании.
   2. Ограничьте количество щенков, используемых в эксперименте, до 1-2 щенков из каждого помета, чтобы уменьшить потенциальные эффекты помета.

Чтобы установить добровольное потребление ТГК, были опробованы многочисленные лакомства, чтобы определить, какие из них были приятны крысам и будут потребляться быстро и последовательно.

Первоначально были опробованы кубики желатина со вкусом клубники без сахара (объемом 1 кубический мл), как с ТГК, так и без него. Количество ароматизатора клубничного сиропа было увеличено, и ТГК был испытан в трех различных концентрациях (2 мг/кг/доза, 3 мг/кг/доза и 5 мг/кг/доза). Крысы не потребляли кубики постоянно и, как было отмечено, быстро прекращали потребление при более высоких концентрациях ТГК. Известно, что крысы могут отказываться от пищи с горьким или кислым вкусом, что вызвало опасения, что эта модель может оказаться нежизнеспособной для добровольного потребления.

После консультации с ветеринаром учреждения были опробованы различные другие лакомства, в том числе крекеры с арахисовым маслом или сыром, мини-шоколадное печенье с арахисовым маслом, сырные крекеры с арахисовым маслом и крекеры в форме рыбы с сыром, все они были получены с Amazon. Самки крыс постоянно ели мини-шоколадное печенье с арахисовым маслом, часто в течение 10-30 минут после того, как им предложили угощение. Затем ТГК добавляли в мини-шоколадное печенье с арахисовым маслом, и процент женщин, которые потребляли ежедневное лакомство, был одинаковым между контрольной группой и группой, подвергшейся воздействию ТГК (67% против 62% соответственно; p = 0,14).

Затем матери подвергались воздействию ТГК, как описано в протоколе, до беременности и пренатальному воздействию каннабиноидов. Перед разведением самки были рандомизированы в контрольную группу или группу PCE (воздействие ТГК в дозе 3 мг/кг/доза). Размер помета и прибавка в весе матери были схожими между группами. Уровень смертности (процент смертности от рождения до P2) и масса тела при рождении приближались к значимости между контролем и PCE (0% против 0,04%, p = 0,06 и 6,25 г против 5,96 г, p = 0,07 соответственно). Уровень смертности имел тенденцию к росту в группе ОФП, а вес потомства при рождении имел тенденцию к снижению в группе ОФП (Таблица 1 и Рисунок 2), что согласуется с литературой по изучению человека²⁰.

Рисунок 1: Экспериментальный дизайн. Самки добровольно употребляли печенье с добавлением ТГК ежедневно перед разведением, чтобы обеспечить постоянное потребление. Плотины, не употребляющие печенье, были исключены из эксперимента. Остальные самки были рандомизированы для употребления либо обычного, либо насыщенного ТГК печенья (3 мг/кг) во время беременности. Роды протекали нормально, и детенышей отлучили от груди на 23-й день после родов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Графическое представление характеристик матери и потомства для модели PCE. На этом рисунке представлено графическое представление характеристик матери и потомства в модели PCE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Характеристики матери и потомства для модели PCE. Прибавка матери в весе на 22-й день беременности (ГД) измерялась как увеличение массы тела в граммах и существенно не различалась между группами (p = 0,48). Таблица также включает средний размер помета, коэффициент смертности (процент смертей от рождения до P2), вес потомства при рождении в помете и вес на уровне P21. Все данные отображаются в виде среднего значения ± стандартной погрешности среднего значения (SEM); Значения *p были рассчитаны с использованием t-критерия Стьюдента.

Описанная здесь парадигма ОФП предполагает добровольное потребление ТГК беременными крысами-самками. Это первое исследование, в котором изучалось введение ТГК беременным крысиным матерям путем добровольного приема внутрь в доклинической модели. Обе группы крысиных матерей потребляли одну и ту же диету крысиного корма, сводя к минимуму потенциальную вариативность в питании и потреблении калорий между группами. Животные модели предлагают преимущество контроля времени и дозы ОФП в исследовательских целях.

Потребление до беременности оценивается для выявления крыс, которые потребляют ТГК в желаемых количествах для последующих фаз протокола потребления. Такой подход гарантирует, что все самки крыс имеют предыдущий опыт приема ТГК до беременности, что более точно^{отражает поведение человека}, где особи часто используют ТГК до беременности. В этой модели ОФП происходит на протяжении всего гестационного развития, примерно в соответствии с первыми двумя триместрами гестации человека. Данные свидетельствуют о том, что употребление каннабиноидов наиболее распространено в течение первого триместра, снижается во втором триместре и еще больше снижается в третьем^{триместре}.

Эндоканнабиноидные рецепторы не экспрессируются у плода до 5-6 недели беременности²¹. Воздействие до этого периода может не оказывать прямого влияния на развитие мозга плода, хотя косвенные эффекты через экспрессию эндоканнабиноидных рецепторов в плаценте все еще возможны²². Следовательно, исследователи, сосредоточенные на исходах развития нервной системы, должны будут учитывать время воздействия по отношению к конкретным интересующим их результатам.

Важным шагом в протоколе является возможность частого измерения уровня ТГК, чтобы гарантировать, что потребление достигает целевых уровней в сыворотке. В ходе текущих экспериментов измеряются уровни в сыворотке крови на протяжении всей беременности, чтобы гарантировать, что стабильный уровень может поддерживаться, несмотря на метаболические изменения, происходящие во время беременности.

Мы рассмотрели другие методы перорального введения, такие как пероральный зонд. Тем не менее, цель этой модели состоит в том, чтобы оставаться как можно более клинически значимой. Введение зонда может вызвать значительный стресс у крыс, что приводит к повышению артериального давления, повышению уровня кортикостерона в плазме крови и другим неблагоприятным эффектам^23,24. Таким образом, мы выбрали добровольный прием, чтобы свести к минимуму любые непреднамеренные побочные эффекты.

Ограничения этого исследования включают обеспечение постоянного потребления и необходимость осторожности при приготовлении лакомств, так как неточности в дозировке ТГК во время приготовления могут повлиять на результаты. Хотя отдельные крысы могут различаться по метаболизму, это также является преимуществом, учитывая стремление к клинической корреляции.

В целом, доклиническая модель добровольного приема пищи для получения умеренного воздействия ТГК возможна. Эта разработка модели позволит провести дальнейшие углубленные исследования исходов развития нервной системы, а также других областей, представляющих интерес. Будущие исследования внесут свой вклад в растущее количество литературы о влиянии ОФЭ на развитие плода.

У авторов нет конфликта интересов, который можно было бы раскрыть.

Благодарим Программу поставок лекарств Национального института по борьбе со злоупотреблением наркотиками (NIDA) за щедрые поставки ТГК. При поддержке гранта Комитета по распределению исследований Департамента педиатрии Университета Нью-Мексико и Отделения неонатологии.