Очистка саркоэндоплазматического ретикулума Ca⁺-АТФазы из мышц кролика

Этот протокол описывает усовершенствованный метод очистки SERCA, который включает в себя дисахарид трегалозу на заключительной стадии центрифугирования. Этот углевод стабилизирует белки в суровых условиях. Очищенный SERCA был каталитически активным и демонстрировал высокую чистоту, что делало его пригодным для структурных и функциональных исследований.

Некоторые АТФазы Р-типа, такие как сарко/эндоплазматический ретикулум Ca²⁺-АТФаза (SERCA), по своей сути являются лабильными мембранными белками, которые требуют определенных физико-химических условий при очистке для получения их с высокой чистотой и структурным качеством и в каталитически активной форме. Дисахарид трегалоза является совместимым растворенным веществом, которое синтезируется и накапливается в высоких концентрациях в цитоплазме дрожжей для стабилизации мембран и белков. Использование трегалозы в качестве добавки в протокол очистки плазматической мембраны Н⁺-АТФазы позволяет получить высококачественный препарат, гексамерная структура которого показана биохимическими аналитическими методами. Таким образом, трегалозу можно использовать в качестве стабилизирующей добавки для очистки мембранных белков (Р-АТФаз). Данный протокол описывает модификацию классического протокола очистки SERCA путем центрифугирования SERCA на градиенте концентрации трегалозы. Включение этого углевода привело к очистке SERCA в каталитически активную форму с высокой чистотой и, что немаловажно, в стабильную форму. Частичная биохимическая характеристика очищенного SERCA (SDS-PAGE, кинетика фермента, мечение FITC, спектроскопия кругового дихроизма) показала, что фермент пригоден для функциональных и структурных исследований. Предложено использование трегалозы в протоколе очистки АТФаз Р-типа и других лабильных мембранных (и цитозольных) белков.

Мембранные белки/ферменты являются важными биологическими компонентами клеток, поскольку они играют важнейшую роль в различных процессах ^1,2,3. Некоторые из функций могут включать транспортировку ионов и молекул внутрь и из клетки/внутренних компартментов (активный/пассивный), межклеточное распознавание, межклеточное связывание, закрепление/прикрепление и восприятие внешней среды путем интеграции с механизмом передачи сигнала в нормальных и суровых физических и химических условиях (высокое содержание соли, низкое содержание воды, высокая температура, устойчивость к лекарственным препаратам, и т.д.)³ Таким образом, определение трехмерной (3D) структуры мембранных белков и/или ферментов приобрело большое значение как для фундаментальных, так и для прикладных исследований ^4,7,6. Важно отметить, что мембранные белки/ферменты широко используются в качестве мишеней для разработки лекарств (как естественных, так и преднамеренных)^7,8,9. То есть, мембранные белки имеют неотъемлемое значение для здоровья ^9,10,11.

Гидрофобный характер мембранных белков/ферментов является наиболее технически сложным физико-химическим свойством для экспериментальной лаборатории 12,13,14, особенно при работе с олигомерными и/или высоколабильными интегральными мембранными белками ^15,16. Выделение соответствующих количеств мембранного белка/фермента с максимально возможным качеством для функциональных экспериментальных анализов и структурных исследований крайне желательно¹⁷. Мембранные белки, будучи по своей природе гидрофобными, очень трудно поддаются очистке, и выбор моющего средства обычно является одним из самых важных вопросов, которые следует учитывать 17,18,19,20. В связи с этим лабораторные методы, используемые для выделения мембранных белков, обычно вызывают некоторую степень повреждения трехмерной структурной структуры белка²¹. Некоторые из этих методов включают использование (а) ультразвуковых волн высокой частоты/энергии), (б) растворяющих белки детергентов (жестких, средних или щадящих)²², (в) относительно высоких давлений в колоночной хроматографии и высокоскоростном ультрацентрифугировании23, (г) осаждающих молекул, (д) пищеварительных ферментов и др.²¹. Все эти процессы могут способствовать или быть основной причиной дестабилизации белка при очистке²¹. В этом отношении некоторые протоколы, по-видимому, работают относительно хорошо для данного мембранного белка. Тем не менее, оптимизация всегда приветствуется при использовании новых современных анализов или методов, требующих более высокого качества мембранного белкового препарата для получения удовлетворительных результатов²⁴. Этапы оптимизации могут включать, но не ограничиваться ими, улучшение конструкции конструкции, поиск оптимальных условий для экспрессии мембранных белков, установление лучших условий обработки (т.е. pH, температуры и т.д.), поиск наиболее совместимого моющего средства, корректировку этапов очистки, таких как время ультразвуковой обработки, скорость центрифугирования, изменение рецептуры буферных растворов путем добавления стабилизирующих агентов и т.д.25,26,27. Поэтому любое изменение в методике очистки, которое приводит к повышению качества (чистоты) и активности очищенного мембранного белка/фермента, имеет важное значение.

В семействе АТФаз Р-типа плазматическая мембрана дрожжей H⁺-АТФаза, по-видимому, является одним из наиболее лабильных членов^28,29. H⁺-АТФаза теряет свою гидролизующую активность АТФ при дегидратации (сублимационной сушке), тепловом шоке и т.д.28,29. Использование трегалозы в качестве стабилизатора белка было опробовано при выделении плазматической мембраны Н⁺-АТФазы из дрожжей K. lactis^30,31; полученный препарат H⁺-АТФазы отличался высокой чистотой и каталитически активен. Важно отметить, что это позволило определить олигомерное состояние фермента биохимическими методами, показав, что он является гексамером, и позже подтвердить его с помощью криоэлектронной микроскопии 31,32,33,34,35. Таким образом, представляется вероятным, что тонкое трехмерное (3D) расположение мембранных белков может быть утрачено в относительно суровых условиях во время^{очистки.} Кинетика двухфазной инактивации наблюдается для H⁺-АТФазы во время термоопосредованной инактивации²⁹. В дрожжевых клетках, как и во многих других организмах, дисахарид трегалоза накапливается в высоких концентрациях в условиях стресса окружающей среды 37,38,39. Трегалоза поддерживает целостность мембраны и транспортную функцию, стабилизируя белки (как мембранные, так и цитозольные) и клеточные мембраны^40,41. Стабилизирующий механизм трегалозы был широко изучен несколькими группами и нашей лабораторией ^42,43,44,45. Эксперименты с Н⁺-АТФазой и другими ферментами показали, что трегалоза является наиболее эффективным стабилизатором белка среди моно- и дисахаридов^28,29. Это привело к его включению в протокол очистки H⁺-АТФазы³⁰. В последнее время трегалоза также используется для очистки саркоплазматического ретикулума Ca⁺-АТФазы (SERCA) из быстро сокращающейся мышцы кролика с хорошими результатами по чистоте и активности белка⁴⁶. Таким образом, трегалоза представляется хорошей и подходящей добавкой для очистки АТФаз Р-типа и, вероятно, других мембранных и цитозольных белков.

Для-АТФаз существование структурных цитоплазматических доменов является экспериментальным преимуществом, особенно для исследований взаимодействия субстрата и лиганда⁴⁷; Связывание АТФ было изучено в высокочистых рекомбинантных N-доменах^47,48,49, что устраняет технические соображения по очистке ферментов целой мембраны 47,48,50, в том числе⁵¹. К сожалению, некоторые функциональные (каталитическое/энергетическое преобразование) и структурные (расположение субъединиц и взаимодействие с другими белками) исследования все еще требуют полной Р-АТФазы^52,53. В связи с этим очистка SERCA была достигнута несколькими исследовательскими группами 54,55,56,57,58. Тем не менее, усовершенствования все еще могут^{быть реализованы}, например, увеличение интактности очищенной АТФазы⁵⁹, предотвращение денатурации белка/разрушения белковых комплексов²⁵, повышение солюбилизации без денатурации мембранного белка (т.е. предотвращение образования высокомолекулярных агрегатов)⁶⁰, улучшение совместимости с анализами и другими последующими аналитическими методами⁶¹ Кроме того, поскольку в научной литературе появляются новые экспериментальные стратегии, добавки, ингибиторы ферментов и т.д. 61,62,63,64,65,66, их иногда необходимо тестировать с целой Р-АТФазой. В данной работе описан протокол очистки SERCA и использование трегалозы в качестве добавки для стабилизации структуры белка и активности АТФазы; Т.е., помимо повышения ферментного (структурного) качества, трегалоза помогает предотвратить потерю структуры и активности фермента при выделении и хранении фермента, что способствует сохранению биологического материала и тем самым уменьшению количества ферментных очисток.

Все процедуры на животных выполнялись в соответствии с международными и местными (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) рекомендациями по обращению с животными в экспериментальных лабораториях 51,67,68. Мышечная ткань была получена от дикого вида Oryctolagus cuniculus из местного подразделения по обработке животных (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)⁴⁶. Ветеринарный врач с опытом работы с лабораторными животными провел первоначальное рассечение и обработку мышц. Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Выделение саркоплазматического ретикулума из быстро сокращающейся мышцы кролика (Тайминг, 7 - 9 ч)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Champeil et ^al.69.

1. Получите быстро сокращающуюся мышечную ткань (~70 г с обеих задних ног на животное) от дикого типа Oryctolagus cuniculus.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Требуется предварительная визуальная идентификация мышц, подлежащих рассечению, ^70,71.
2. Измельчите быстро сокращающуюся мышцу в блендере, суспензировав ее в трех объемах по 100 мМ KCl, с 1 минутой на и 1 минутой на ледяном отдыхе, повторите три раза^{по 72}.
3. Удалите остатки ткани центрифугированием (1500 × г) при 4 °C в течение 5 минут; При необходимости проводится повторное центрифугирование (4200 × г).
4. Соберите надосадочную жидкость и гомогенизируйте ее с помощью тканевого измельчителя (10 ударов при низкой скорости, т.е. 500-1 500 об/мин)^72,73. Центрифугируйте гомогенат (10 000 × г) при 4 °C в течение 15 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо соблюдать осторожность при гомогенизации, так как использование относительно высокой скорости может привести к повреждению системы и оператора.
5. Центрифугировать надосадочную жидкость (содержащую саркоплазматический ретикулум) (33 000 × г) при 4 °С в течение 120 мин.
6. Суспензировать гранулы в 40 мл 0,5 М сахарозы и центрифугировать (12 000 × г) при 4 °C в течение 15 минут. Разбавляют надосадочную жидкость (0,6 М KCl и 0,15 М сахарозы) и центрифугируют суспензию (34000 × г) при 4°С в течение 165 мин.
7. Суспендируйте гранулу, содержащую листы везикул саркоплазматического ретикулума (SRV), в 0,3 М сахарозы, 0,1 М KCl и 5 мМ Tris-HCl, pH 7,0. Определите концентрацию белка с помощью анализа Лоури⁷⁴ и сывороточного альбумина человека в качестве стандарта белка.
8. Аликвотируйте SRV (30-32 мг/мл) в объеме 1 мл. Храните образцы SRV при температуре -72 °C для дальнейшей обработки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выход белка составляет 100-110 мг SRV на животное.

2. Очистка SERCA (Время, 18 - 20 часов)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Rivera-Morán et ^al.46.

1. Разбавьте суспензию SRV до 2 мг белка/мл с помощью ледяных 75 мМ Tris-HCl, pH 7,2, 0,6 M KCl, 6 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA и 0,1% (w/v) дезоксихолата (DOC). Инкубировать суспензию СРВ на льду в течение 10 мин при слабом перемешивании. Центрифугировать суспензию SRV (100 000 × г) при 4 °C в течение 60 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: DOC следует добавлять по каплям.
2. Суспендируйте гранулы в <3 мл 25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 М KCl, 45% глицерина (v/v) и 2 мМ ЭДТА. Гомогенизируйте суспензию и доведите до конечного объема 10 мл. Определите концентрацию белка, а затем отрегулируйте ее до 6,5 мг/мл. Добавьте азолектин в дозе 5 мг/мл и 0,85 (масс./масса) Цвиттергент 3-14.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Азолектин и Цвиттергент 3-14 следует добавлять по каплям.
3. Гомогенизируйте суспензию и центрифугу (100 000 × г) при 4 °C в течение 60 минут. Соберите надосадочную жидкость и разведите 1:2 с 2 мМ EGTA (pH 7,2).
4. Аккуратно влейте суспензию на прерывистый градиент концентрации трегалозы (45, 40, 35 и 30% по массе) в 10 мМ трис-HCl, pH 7,0, 1 мМ ЭДТА, 0,1% дезоксихолата и 1 мг/мл азолектина. Центрифуга (100 000 × г) при 4 °C в течение 14 ч. Соберите прозрачные, слегка желтоватые гранулы, образовавшиеся на дне трубочек.
   Примечание: Как формирование градиента трегалозы, так и добавление суспензии образца должны быть выполнены с использованием соответствующих методов. Рекомендуется центрифугирование в течение ночи.
5. Осторожно суспендируйте гранулу в небольшом объеме (<1,5 мл): 25 мМ Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 M KCl, 45% глицерина и 2 мМ ЭДТА. Определите концентрацию белка. Отрегулируйте концентрацию белка путем разведения до 2 мг/мл. Возьмите аликвоты (~50 μл) суспензии и храните очищенную SERCA при температуре −72 °C до ее использования.
6. Выполните SDS-PAGE очищенного SERCA⁷², а также образцов белка, взятых на разных ступенях очистки. Окрасьте гель Coomassie Blue⁷².
   Использование 0,6 М трегалозы вместо глицерина в суспензионном буфере повышает стабильность фермента во время циклов хранения и замораживания-размораживания^28,29.

3. Анализ на активность АТФазы (время, 1 - 2 ч)

1. Ферментный анализ: АТФаза-пируваткиназа-лактатдегидрогеназа
   1. Готовят реакционную смесь (1 мл): 50 мМ MOPS (pH 7,0), 1 мМ EGTA, 80 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂, 3 мМ CaCl₂, 5 мМ фосфоенолпируват, 250 мкМ NADH. Включите переменные концентрации АТФ (от 0,001 до 0,25 мМ).
   2. Тщательно гомогенизируйте реакционный анализ путем вортексирования. Инкубируйте анализ реакции при температуре 37 °C в течение 10 мин. Добавьте 0,9 Ед L-лактатдегидрогеназы (ЛДГ) и 1,5 Ед пируваткиназы (ФК).
   3. Инициируют АТФазную реакцию добавлением 10 мкг SERCA.
   4. Определите образование НАДН. Отслеживайте изменение интенсивности поглощения каждую секунду в течение 600 с на длине волны (λ) 340 нм с течением времени с помощью спектрофотометра с термостатным держателем ячейки.
      Примечание: Временной интервал для измерения абсорбции может варьироваться, но постарайтесь записать как можно больше точек данных, чтобы провести начальную прямую линию АТФазной реакции.
2. Определение скорости гидролиза АТФ
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре обратитесь к Rivera-Morán et ^al.46.
   1. Рассчитайте величину наклона (Δabs/min) линейной части в каждой формируемой кривой. Используйте коэффициент угасания моляров (ε) НАДН (λ = 6,220 М⁻¹·см⁻¹) для определения активности АТФазы (μмоли гидролизованной АТФ/мин.мг прот.)
3. Определение параметров кинетики K_m и V_max
   1. Построение графика зависимости данных о скорости от концентрации АТФ с помощью программного обеспечения для анализа данных и построения графиков.
   2. Подгоним данные с помощью нелинейной регрессии к уравнению Михаэлиса-Ментена (уравнение 1)⁴⁶:
      
      где v — скорость, V_max — максимальная скорость, [S] — концентрация АТФ, а K_m — постоянная Михаэлиса-Ментена.
   3. Определите K_m и V_max с помощью итерации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Включение DOC может увеличить реакцию АТФазы; Для поиска оптимальной концентрации рекомендуется проводить тестирование различных концентраций РОУ.

4. Мечение SERCA флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) (время, 30 - 45 мин, только для мечения FITC)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре см. 54,75,76.

1. Суспендируйте SERCA (20 мкг) в 50 мкл (конечный объем) меченого буфера (100 мМ KCl, 5 мМ MgCl₂ и 30 мМ Tris-HCl, pH 8,9), содержащем 1 мМ FITC. Перемешайте путем вортексинга.
2. Инкубируйте образцы в разное время (15 мин, 10 мин, 7 мин, 5 мин и 2 мин) в темноте и при комнатной температуре.
3. Остановите реакцию мечения, добавив 1 объем ледяного буфера (480 мМ сахарозы и 48 мМ MOPS, pH 7,0), содержащего АТФ (5 мМ). Выдерживать на льду в течение 5 минут в темноте.
4. Подчините SERCA с маркировкой FITC паспорту безопасности (стр.⁷²). Подвергайте прозрачные гели воздействию ультрафиолетового излучения (λ = 302 нм). Задокументируйте результат на фото.
5. Окрасьте гель синим цветом Кумасси. Задокументируйте результат на фото.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнение маркировки FITC в темной комнате может улучшить качество флуоресцентного сигнала.

5. Спектры кругового дихроизма (CD) (Хронометраж, 30 мин)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации о процедуре см.^11,77.

1. Суспендировать SERCA (3 мкМ) в 400 мкл 10 мМ фосфатного буфера (pH 7,0) при 25 °C.
2. Загрузите образец в ячейку с длиной пути 0,1 см. Заданные дальние УФ-спектры λ находятся в диапазоне 190-260 нм. Установите внутреннее разрешение и пропускную способность на 1 нм.
3. Запишите сигнал CD со скоростью 50 нм/мин при 25 °C.

SDS-PAGE SERCA-на разных стадиях очистки (Рисунок 1). Окрашенный в синий цвет гель Coomassie демонстрирует обогащение белковой полосы SERCA (кажущаяся молекулярная масса >100 кДа) по мере прохождения протокола очистки. Белковая полоса, соответствующая SERCA, показывает чистоту >90% после центрифугирования на градиенте концентрации трегалозы. График зависимости скорости гидролиза АТФ от концентрации АТФ (Рисунок 2A). Кинетика АТФазы Михаэлиса-Ментена (гиперболическая картина) наблюдается для очищенного SERCA. График Лайнвивера-Берка данных на рисунке 2А (рисунок 2В). На графике значение K_m для SERCA (10 μM) получено из x-пересечения (K ^m-1), которое аналогично тому, которое было обнаружено в предыдущих исследованиях 25,78,79. Маркировка SERCA с помощью FITC (Рисунок 3). После маркировки SERCA подвергается обработке SDS-PAGE. Затем прозрачный гель подвергается воздействию ультрафиолетового излучения, чтобы обнажить флуоресцентную полосу SERCA-FITC (Рисунок 3A). Мечение SERCA методом FITC указывает на наличие интактного сайта связывания нуклеотидов; это связано с тем, что мечение SERCA методом FITC зависит от правильного расположения аминокислотных остатков для связывания с FITC для последующей химической реакции с остатком лизина (Lys) 47,54,80. То есть маркировка FITC происходит только в правильно сложенном SERCA⁴⁷; На рисунке 3B белок SERCA, окрашенный Coomassie Blue, точно соответствовал белку FITC (рисунок 3B). Спектр кругового дихроизма (CD) SERCA представлен на рисунке 4A. Содержание вторичной структуры SERCA определяется путем анализа спектра CD 27,47,81.

Примечательно, что SRV содержат большое количество SERCA; высокий процент (73%) белка в везикулах соответствует SERCA (рис. 1B). После ультрацентрифугирования на градиенте концентрации трегалозы чистота SERCA увеличилась до более чем 90% (рис. 1В); Т.е. большая часть сопутствующих белков была удалена в ходе этого процесса. Программное обеспечение imageJ (https://imagej.net/ij/)⁸² и Origin использовалось для сбора и анализа данных (гауссова мультипиковая аппроксимация) соответственно. Препарат SERCA отличается высоким структурным качеством (Рисунок 1 и Рисунок 4); Можно проводить анализы белок-белковых взаимодействий, титрование сайта связывания АТФ можно контролировать по изменениям в спектре DC, а также можно рассчитать аффинность нуклеотидов⁴⁶. Каталитическая активность, проявляемая очищенным SERCA (рис. 2), может быть использована для тестирования любых физических и химических условий, которые могут изменить активность (структуру) АТФазы фермента. Кроме того, могут быть проверены исследования переноса ионов в везикулах и преобразования химической энергии в потенциальную ферментом. Кроме того, могут быть проведены испытания ингибиторами, как натуральными, так и синтетическими. В этом контексте интактность нуклеотид-связывающего сайта наглядно демонстрируется с помощью мечения FITC (рис. 3); Могут быть проведены эксперименты по изучению структуры активного центра в различных условиях и на наличие потенциальных взаимодействующих агентов.

Рисунок 1: SDS-PAGE и денситометрический анализ. (A) SDS-PAGE саркоплазматического ретикулума Ca⁺-АТФазы (SERCA). SERCA был очищен из изолированных саркоплазматических везикул (СРВ) из быстро сокращающихся мышц кролика. После центрифугирования на градиенте концентрации трегалозы собирали гранулы (содержащие SERCA чистотой >90%). Рисунок адаптирован из Rivera-Morán et ^al.46. (B) Денситометрический анализ изолированных полос SRV и SERCA в (A). Красными линиями являются наборы экспериментальных данных (с коррекцией базовых линий), сгенерированные программным обеспечением ImageJ после анализа полос SRV и SERCA, а черные и синие линии представляют многопиковую гауссову аппроксимацию; Результаты включаются в виде таблиц-вставок. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Гидролиз АТФ методом SERCA. (A) График зависимости скорости АТФазы от концентрации АТФ. Отслеживали скорость гидролиза АТФ (абсорбция НАДН на длине волны 340 нм) в ферментативном анализе, состоящем из пируваткиназы и лактатдегидрогеназы. Точки данных являются средним значением трех независимых экспериментов ± стандартным отклонением. (B) График Лайнвивера-Берка данных в А. Точка пересечения прямой по оси x — это значение K ^m-1 для SERCA. Рисунок адаптирован из Rivera-Morán et ^al.46. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Маркировка SERCA FITC. (A) SERCA, маркированная FITC, во время инкубации: (1) 15 мин, (2) 10 мин, (3) 7 мин, (4) 5 мин и (5) 2 мин подвергали воздействию SDS-PAGE. Флуоресценция SERCA-FITC наблюдается в прозрачном геле после воздействия ультрафиолетового излучения. (В) Кумасси синее пятно геля в (А). Рисунок адаптирован из Rivera-Morán et ^al.46. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 4: Спектр циркулярдихроизма (CD) SERCA. Спектр CD SERCA (3 мкМ), взвешенный в 10 мМ фосфатного буфера, pH 8,0. Рисунок адаптирован из Rivera-Morán et ^al.46. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Большинство молекул и ионов не могут свободно пересекать клеточные мембраны, например, протону (H⁺) требуется мембранный транспортер в плазматической мембране различных организмов и органелл, таких как митохондрии^83,84. Клеточные мембраны избирательны, а молекулы и ионы, которые пересекают клеточные мембраны, разнообразны, поэтому в клетке можно найти несколько типов мембранных белков, таких как (а) транспортеры ABC, (b) ионные каналы, (c) мембраносвязанные АТФазы, (d) транспортеры SLC и (e) водные^каналы. В структурной биологии получение трехмерной конформации фермента/транспортера на большинстве этапов функционального (каталитического) цикла стало основной проблемой^85,86. То есть, детальное знание функционального структурного ландшафта ферментов важно для понимания каталитического механизма 5,87,88,89. Выделение мембранного белка в высокой чистоте и активной форме является первым шагом в этих исследованиях⁹⁰. Гидрофобность (присущее мембранным белкам физико-химическое свойство), по-видимому, является основной проблемой при работе с этими^{белками12}. Неоптимальные протоколы очистки, неподходящие условия эксперимента, водные буферы, в которых находятся мембранные белки, обычно встречаются при попытке работы с мембранными белками 25,27,91. Потеря каталитической активности во время хранения также может произойти с мембранными ферментами после очистки²¹.

Для-АТФаз отличной альтернативой является проведение экспериментальных исследований в рекомбинантных доменах (например, N-домене)^47,48 и с использованием систем гетерологичной экспрессии белков⁵³. Однако эксперименты иногда требуют использования всей нативной Р-АТФазы⁵³, и поэтому необходим эффективный протокол для получения высококачественного фермента, который стабилизируется во время процедуры выделения, а затем при хранении. Вышесказанное особенно спасло бы от чрезмерного использования биологической ткани и ее живого источника.

В настоящее время использование искусственного интеллекта (ИИ, постоянно развивающийся инструмент) является одной из конечных стратегий, направленных на улучшение растворимости, стабильности и функции белков как в новых, так и в существующих 36,92,93. Тем не менее, ИИ в основном сосредоточен на растворимых белках; Мембранные белки кажутся нетрадиционными для этой новой технологии, по крайней мере, в течение некоторого времени.

Оптимизация протокола для очистки мембранных белков/ферментов — это вариант, над которым наша лаборатория работает уже два десятилетия^. Содержание SERCA в изолированных SRV составляет ~73%. Стадией очистки, определенной для улучшения, была заключительная стадия центрифугирования, которая теперь выполняется на градиенте концентрации трегалозы. Чистота и структурные качества очищенного SERCA были высокими (>90%) (Рисунок 1B и Рисунок 4). _{Максимальное} значение SERCA V было в пределах диапазона, зарегистрированного для других препаратов 94,95,96, в то время как значение K_m было аналогично значению SRV. Трегалоза представляет собой молекулу, которая, как известно, стабилизирует трехмерную структуру белков в условиях стресса окружающей среды, таких как те, которые применяются на некоторых стадиях очистки. Это уже было продемонстрировано для членов семейства АТФазы P-типа, таких как плазматическая мембрана дрожжей H⁺-АТФаза, а теперь и для SERCA^31,46. Вполне вероятно, что другая АТФаза Р-типа может быть очищена с использованием настоящего протокола для биофизических, ферментативных кинетических (тестирование ингибиторов) и структурных (четвертичная структура) исследований. В связи с этим предлагается использование трегалозы в протоколах очистки (а также для хранения) лабильных мембранных/цитозольных белков.

Автор заявляет, что у него нет конкурирующих финансовых интересов.

Автор выражает признательность Эдмундо Мата-Моралесу в монтаже видео, VM, Валентину де ла Крус-Торресу в очистке SRV, Мигелю А. Ривере-Морану в очистке и анализе SERCA, а также Хуану К. Гонсалесу-Кастро, Франко Э. Хуаресу, Алехандре Неварес, Николасу Роча-Визуэту и Джослину И. Рамиресу-Алонсо в производстве видео. Никаких средств, грантов или другой поддержки для проведения данного исследования получено не было.