Микроволновая экстракция фенольных соединений и антиоксидантов для косметических целей с использованием технологии на основе полиола

В этом протоколе подробно описывается использование метода микроволновой экстракции на основе полиола для экстракции фенольных соединений и природных антиоксидантов, представляя собой практический и экологически устойчивый подход к разработке готовых к использованию экстрактов.

Использование полиолов в качестве зеленых растворителей для извлечения биологически активных соединений из растительного сырья привлекло внимание из-за их безопасности и инертного поведения по отношению к растительным биологически активным химическим веществам. В этом исследовании изучается устойчивая экстракция фенольных соединений и природных антиоксидантов из серебристой кожи кофе с использованием метода микроволновой экстракции (MAE) с растворителями на основе полиола: глицерином, пропиленгликолем (PG), бутиленгликолем (BG), метилпропандиолом (MPD), изопентилдиолом (IPD), пентиленгликолем, 1,2-гександиолом и гексиленгликолем (HG). Был проведен сравнительный анализ традиционных и нетрадиционных экстракций растворителями, в котором основное внимание уделялось их влиянию на биологически активные соединения МАЭ, включая такие параметры, как общее содержание фенольных соединений (ТПК), общее содержание флавоноидов (ТФК) и антиоксидантная активность, такие как анализ поглощения радикалов 1,1-дифенил-2-пикрилгидразил (DPPH), анализ поглощения радикалов 2,2'-азино-бис(-3-этилбензотиазолин-6-сульфоновая кислота) (ABTS) и анализ антиоксидантной способности железа (FRAP). Наибольшие значения наблюдались для ТПК с экстракцией водно-1,2-гександиола (52,0 ± 3,0 мг ГАЕ/г образца), ТФК с экстракцией водного 1,2-гександиола (20,0 ± 1,7 мг QE/г образца), DPPH с водной экстракцией HG (13,6 ± 0,3 мг TE/г образца), ABTS с экстракцией водного пентиленгликоля (8,2 ± 0,1 мг TE/г образца) и FRAP с водной экстракцией HG (21,1 ± 1,3 мг Fe (II) E/г образца). Это исследование направлено на продвижение экологически чистой технологии экстракции за счет натуральных растительных компонентов, способствуя устойчивому развитию за счет минимизации использования опасных химических веществ при одновременном сокращении времени и потребления энергии, с потенциальным применением в косметике.

В настоящее время в индустрии красоты наблюдается глобальный тренд на экологическую сознательность, что заставляет производителей сосредоточиться на зеленых технологиях извлечения растительных компонентов с использованием устойчивых альтернатив¹. Как правило, традиционные растворители, такие как этанол, метанол и гексан, используются для извлечения растительных фенольных компонентов и природных антиоксидантов^. Тем не менее, присутствие остатков растворителей в растительных экстрактах представляет потенциальный риск для здоровья человека, вызывая раздражение кожи и^глаз3, особенно в отношении их предполагаемого применения в косметике. Следовательно, удаление таких остатков растворителя из экстрактов является сложной задачей, что требует значительных затрат времени, энергии и человеческих ресурсов⁴. В последнее время перегретая вода, ионные жидкости, глубоководные эвтектические растворители и растворители биологического происхождения стали перспективными подходами^{к экстракции} зелеными растворителями. Тем не менее, их использование все еще ограничено разделением продукта в процессах на водной основе. Для решения этих проблем разработка готовых к использованию экстрактов представляется жизнеспособным решением⁶.

Полиолы часто используются в косметических составах в качестве увлажнителей из-за их хорошей полярности и способности удерживать влагу из окружающей среды⁷. Кроме того, полиолы, такие как глицерин, пропиленгликоль, бутиленгликоль, метилпропандиол, изопентилдиол, пентиленгликоль, 1,2-гександиол и гексиленгликоль, могут быть использованы для экстракции растений. Они считаются нетоксичными, биоразлагаемыми, экологически чистыми, нереактивными и безопасными растворителями для использования в экстракции растений⁸. Кроме того, полиолы могут выдерживать тепло, выделяемое во время микроволновой экстракции (MAE) благодаря их повышенным температурам кипения и^{полярности9}. Эти полиолы в целом признаны безопасными химическими веществами (GRAS) Управлением по санитарному надзору за качеством пищевых продуктов и медикаментов США (FDA). В отличие от обычных растворителей, таких как этанол или метанол, которые могут потребовать тщательного удаления из экстракта из-за их потенциально вредного воздействия, полиолы имеют преимущество минимизации энергии, времени и затрат, связанных^{с процессами удаления} растворителей. Это не только оптимизирует процесс экстракции, но и повышает общую эффективность и экологичность метода экстракции. В предыдущих исследованиях полиолы, такие как пропиленгликоль и бутиленгликоль, использовались в качестве растворителей при экстракции биологически активных соединений из цветков Camellia sinensis ¹⁰ и кофейной мякоти¹¹, что выявило значительный потенциал их роли в качестве устойчивых альтернативных растворителей в процессе экстракции растений. Таким образом, продолжающаяся разработка и оптимизация системы полиол-водный растворитель таит в себе потенциал для значительного прогресса в области зеленой химии и устойчивых промышленных методов.

Как правило, биологически активные соединения, содержащиеся в растениях, синтезируются в виде вторичных метаболитов. Эти соединения можно разделить на три основные группы: терпены и терпеноиды, алкалоиды и фенольные соединения¹². Для выделения конкретных биологически активных соединений из растений в различных условиях используются различные методы экстракции. Биологически активные соединения из растительного сырья могут быть экстрагированы как традиционными, так и нетрадиционными методами. Традиционные методы включают мацерацию, дефлегмацию и гидродистилляцию, в то время как нетрадиционные методы включают экстракцию с помощью ультразвука, экстракцию с помощью ферментов, экстракцию с помощью микроволновой печи (MAE), импульсную экстракцию с помощью электрического поля, сверхкритическую экстракцию жидкостью^{и экстракцию} жидкостью под давлением. Эти нетрадиционные методы предназначены для повышения безопасности за счет использования более безопасных растворителей и вспомогательных средств, повышения энергоэффективности, предотвращения деградации биологически активных компонентов и снижения загрязнения окружающей^среды.

Кроме того, MAE является одной из самых современных «зеленых» технологий для извлечения биологически активных соединений из растений. Обычные процедуры экстракции требуют значительного количества времени, энергии и высоких температур, которые со временем могут привести к^{разложению} чувствительных к нагреванию биологически активных соединений. В отличие от обычной термической экстракции, MAE облегчает экстракцию биологически активных соединений за счет создания локального нагрева внутри образца, разрушения клеточных структур и усиления массообмена, тем самым повышая эффективность экстракции соединений. Тепло передается изнутри растительных клеток микроволнами, которые воздействуют на молекулы воды внутри растительных компонентов¹³. Кроме того, MAE продвинулась вперед в улучшении экстракции и разделения активных соединений, увеличении выхода продукта, повышении эффективности экстракции, требовании меньшего количества химикатов и экономии времени и энергии при предотвращении разрушения биологически активных соединений¹⁵.

Это исследование сосредоточено на экстракции растительных фенольных соединений и природных антиоксидантов с помощью микроволновой экстракции (MAE) с использованием различных типов полиолов в качестве растворителей. Определено общее содержание фенолов (TPC), общее содержание флавоноидов (TFC) и антиоксидантная активность (DPPH, ABTS и FRAP) экстрактов MAE на основе полиола. Кроме того, МАЭ на основе полиола сравнивают с МАЭ с использованием обычных растворителей, таких как вода и этанол. Ожидается, что это исследование внесет вклад в разработку экологически устойчивой технологии экстракции природных компонентов, способствуя устойчивому развитию за счет снижения зависимости от опасных химических веществ, сокращения времени обработки и минимизации потребления энергии при производстве сырья для потенциального применения в косметической промышленности.

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Подготовка к эксперименту

1. Подготовка образцов растений
   1. Соберите свежий кофе серебристой кожицы (Coffea arabica) и высушите его при температуре 60 °C в сушилке для лотков в течение 72 ч¹¹ минут.
   2. Измельчите высушенный кофе Silverskin (CS) в мелкий порошок с помощью кофемолки и храните его при комнатной температуре для дальнейшего анализа¹¹.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В этом исследовании свежий CS (C. arabica) был собран в Баан Дой Чанг, район Мае Суай, Чианграй, Таиланд. CS является побочным продуктом, получаемым в процессе шелушения, который удаляет пергаментный слой с высушенных кофейных зерен после обработки вишни для удаления внешних фруктовых слоев¹⁶.
2. Химикалии
   1. Используйте в эксперименте химические реактивы аналитического качества, за исключением растворителей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В эксперименте использовались растворители косметического качества.
   2. Используйте растворители (воду, этанол, глицерин, пропиленгликоль, бутиленгликоль, гексиленгликоль, изопентилдиол, 1-2 гександиол, пентиленгликоль и метилпропандиол) для экстракции CS с MAE.

2. Процесс экстракции

1. Подготовка образцов и растворителей
   1. Подготовьте образец и растворители для процедуры MAE в соответствии с ранее описанным протоколом⁹ с некоторыми изменениями.
   2. Приготовьте каждый растворитель в концентрации 60%, разбавив 60 мл каждого растворителя дистиллированной водой и доведя объем до 100 мл для тройной экстракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте 100% дистиллированную воду для экстракции воды.
   3. Смассируйте 0,67 г CS и смешайте с 20 мл каждого экстракционного растворителя в соотношении 1:30 в реакционном контейнере (рис. 1A) для MAE.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальное количество твердого тела и жидкости для каждого сосуда составляет 2 г образца и 20 мл растворителя.
   4. Добавьте магнитную мешалку к каждому сосуду, чтобы обеспечить равномерное распределение тепла и растворителя в образце, повышая эффективность процесса экстракции и способствуя лучшему выходу экстракции.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если в процессе экстракции используются неполярные растворители, тефлоновые мешалки могут использоваться вместо магнитных мешалок для обеспечения эффективного нагрева через микроволновую систему.
   5. Плотно закройте каждый сосуд с помощью специального инструмента (Рисунок 2) и поместите все сосуды в камеру MAE (Рисунок 1B).
2. Настройка прибора и процедуры для экстракции с помощью микроволновой печи
   1. Выполните процедуру экстракции в соответствии с эталонным протоколом с некоторыми изменениями⁹.
   2. Откройте экран монитора, чтобы настроить метод, нажав на значок панели инструментов на верхней панели и выбрав ротор SK eT в разделе аксессуаров (рис. 3A, B).
   3. Выберите скорость перемешивания стержней мешалки, щелкнув по секции мешалки и набрав 20% (Рисунок 4A).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Скорость перемешивания можно выбрать от 0% до 100%.
   4. Нажмите на сектор дверного замка и настройте его на активацию при температуре, превышающей 80 °C (Рисунок 4B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эта настройка обеспечивает автоматическое закрытие дверцы камеры, когда внутренняя температура превышает 80 °C.
   5. Нажмите на значок таблицы на верхней панели (рис. 5A) и установите градиент температуры (T1) на продолжительность экстракции 10 минут, мощность микроволновой печи на 1800 Вт и температуру на 120 °C.
   6. Активируйте мешалку, нажимая на кнопку мешалки до тех пор, пока не появится зеленый свет.
   7. Установите скорость вентилятора нагнетателя на уровень 3 (максимальная) (Рисунок 5B).
   8. Чтобы удерживать время экстракции, выберите желаемую температуру экстракции (T2), установив продолжительность экстракции на 15 минут, мощность микроволновой печи на 1800 Вт и температуру на 120 °C.
   9. Установите скорость мешалки и вентилятора, как указано в разделах 2.2.6 и 2.2.7 (рис. 5A, B).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная температура и мощность микроволновой печи составляют 260 °C и 1800 Вт.
   10. Установите время охлаждения, нажав на кнопку охлаждения в левом нижнем углу экрана и выбрав продолжительность 10 минут (Рисунок 6).
   11. Сохраните метод, нажав на значок сохранения в правом верхнем углу экрана (рис. 7A).
   12. Убедитесь, что после сохранения условий метода график условий добычи будет отображаться на экране с кнопкой воспроизведения в правом нижнем углу (рисунок 7B).
   13. Начните процесс экстракции, выбрав количество используемых сосудов (Рисунок 7C).
       ПРИМЕЧАНИЕ: За одну экстракцию можно использовать до 15 сосудов, а при использовании желаемого количества емкостей обеспечить сбалансированное размещение сосудов в камере.
   14. После экстракции экстракты центрифугируются при температуре 4 °C, 9072 x g, в течение 15 мин с помощью охлаждаемой центрифуги.
   15. Соберите надосадочную жидкость стеклянной пипеткой объемом 10 мл (рис. 8) и храните ее при температуре -20 °C в морозильной камере для дальнейшего изучения.
       ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от размера частиц и плотности растительных остатков, для обработки экстрактов потребуется более длительное время центрифугирования (20-30 минут).

3. Определение фенольных соединений

1. Определение общего содержания фенольных соединений
   1. Определение общего содержания фенолов в экстрактах CS путем обращения к протоколу с некоторыми изменениями¹⁷.
   2. Готовят 10-кратное разведение образцов путем разбавления дистиллированной водой.
   3. Смешайте 10 μL разведенного образца с 20 μL неразбавленного реагента Folin-Ciocalteu и дайте им вступить в реакцию в течение 3 минут.
   4. Затем добавьте 100 мкл 7,5% раствора Na₂CO₃ в смесь в каждую лунку 96-луночного планшета.
   5. Для стандартного диапазона концентраций галловой кислоты готовят различные концентрации (см. таблицу 1 и таблицу 2) путем разбавления дистиллированной водой.
   6. Смешайте их с 20 μL реагента Folin-Ciocalteu и дайте им вступить в реакцию в течение 3 минут.
   7. Затем добавьте 100 мкл 7,5% раствора Na₂CO₃ в смесь в каждую лунку 96-луночного планшета.
   8. Инкубируйте реакцию в течение 30 минут в темноте при комнатной температуре.
   9. Измерьте поглощение реакционного раствора при длине волны 765 нм с помощью считывателя микропланшетов (рис. 9A).
   10. Постройте стандартную калибровочную кривую с использованием концентраций стандарта и поглощения на длине волны 765 нм (рис. 10A).
   11. Выразите результаты в мг эквивалента галловой кислоты (ГАЕ) на г образца и рассчитайте с помощью следующего уравнения¹⁸:
       ПРИМЕЧАНИЕ: мг эквивалента галловой кислоты (ГАЕ) на г образца = [((A₇₆₅ - c) / м)) в мкг эквивалент галловой кислоты × Общий объем в реакционной лунке (мл) x Разбавление × масса сухого образца (1 г) x Результирующий объем экстракта (мл)] / [(Объем образца, добавленного в каждую лунку (мл) x Фактический вес сухого образца (г) × коэффициент пересчета из μг в мг (1000)]
       где, c = y-образный пересечение, m = наклон
2. Определение общего содержания флавоноидов
   1. Определяют общее содержание флавоноидов в экстракте КС в соответствии с протоколом с некоторыми изменениями¹⁷.
   2. Готовят 5-кратное разведение проб путем разбавления дистиллированной водой.
   3. Добавьте 50 мкл разведенного образца к 15 мкл 5% NaNO₂ и инкубируйте в темноте в течение 5 минут.
   4. Смешайте 15 μл 10% раствора AlCl₃ с реакцией и выдержите при комнатной температуре 6 минут.
   5. Затем добавьте в реакцию 100 мкл 1 М раствора NaOH и инкубируйте еще 10 минут.
   6. Измерьте впитывающую способность смеси при длине волны 510 нм (рисунок 9B).
   7. Приготовьте кверцетин в различных концентрациях стандартного диапазона (см. таблицы 3 и 4), добавив их к 15 мкл 5% NaNO₂ и инкубируя в темноте в течение 5 минут.
   8. Смешайте 15 μл 10% раствора AlCl₃ с реакцией и выдержите при комнатной температуре 6 минут.
   9. Добавьте в реакцию 100 мкл 1 М раствора NaOH и продолжайте инкубировать в течение 10 мин.
   10. Определите поглощение стандарта на длине волны 510 нм (рис. 9B).
   11. Постройте стандартную калибровочную кривую с использованием концентраций стандарта и поглощения на длине волны 510 нм (рис. 10B).
   12. Выразите результаты в мг кверцетинового эквивалента (QE) на г образца, рассчитанного по уравнению¹⁹ , следующим образом:
       ПРИМЕЧАНИЕ: мг кверцетинового эквивалента (QE) на г образца = [((A₅₁₀ - c) / м)) в μг кверцетинового эквивалента × Общий объем в реакционной лунке (мл) x Разведение × масса сухого образца (1 г) x Результирующий объем экстракта (мл)] / [(Объем образца, добавленного в каждую лунку (мл) x Фактический вес сухого образца (г) × коэффициент пересчета из μг в мг (1000)]
       где, c = y-образный пересечение, m = наклон

4. Определение антиоксидантной активности

1. 1,1-дифенил-2-пикрил-гидразил (DPPH) анализ на удаление радикалов
   1. Определение активности поглощения радикалов DPPH экстракта CS в соответствии с протоколом с некоторыми изменениями¹⁷.
   2. Приготовьте 10-кратное разбавление образцов, разбавив их дистиллированной водой.
   3. Смешайте 20 мкл разведенных образцов со 135 мкл 0,1 мМ раствора DPPH.
   4. Готовят различные концентрации в стандартном диапазоне концентраций Тролокса (см. таблицы 5 и 6), смешивая со 135 мкл 0,1 мМ раствора DPPH.
   5. Выдержать смесь в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.
   6. Измерьте поглощение результирующего вещества при длине волны 517 нм (Рисунок 9C).
   7. Постройте стандартную калибровочную кривую с использованием концентраций стандартного и % ингибирования (рис. 10C).
   8. Рассчитайте % ингибирования анализа DPPH следующим образом:
      % торможения = [(поглощение контроля − поглощение образца)/ поглощение контроля] × 100
   9. Выразите результаты в мг эквивалентной антиоксидантной способности тролокса на г образца, рассчитанной по следующему уравнению²⁰:
      ПРИМЕЧАНИЕ: мг эквивалента тролокса (TE) на г образца = [((% ингибирования-c) / м) в μг эквивалента тролокса × Общий объем в реакционной лунке (мл) x Разведение × масса сухого образца (1 г) x Результирующий объем экстракта (мл)] / [(Объем образца, добавленного в каждую лунку (мл) x Фактическая масса сухой пробы (г) × коэффициент пересчета из μг в мг (1000)]
      где, c = y-образный пересечение, m = наклон
2. 2,2'-Азино-Бис-3-этилбензтиазолин-6-сульфоновая кислота (АБТС)
   1. Определение активности поглощения радикалов АБТС экстракта КС с использованием протокола из справочника с некоторыми изменениями¹⁷.
   2. Приготовьте стоковый раствор ABTS·+, смешав 7 мМ ABTS и 2,45 мМ персульфата калия (1:2) и инкубируйте в темноте при комнатной температуре в течение 16 ч.
   3. Приготовьте рабочий раствор, смешав 5 мл стокового раствора ABTS·+ со 100 мл деионизированной воды.
   4. Смешайте 160 мкл рабочего раствора ABTS·+ с 10 мкл 10-кратно разбавленного образца или стандарта Тролокс в различных концентрациях (см. Таблицу 7 и Таблицу 8).
   5. Инкубируйте реакцию в темноте при комнатной температуре в течение 30 минут.
   6. Определите впитывающую способность смеси при длине волны 734 нм (рисунок 9D).
   7. Постройте стандартную калибровочную кривую с использованием концентраций стандарта и % ингибирования (Рисунок 10D).
   8. Рассчитайте % ингибирования анализа ABTS по следующей формуле:
      % Торможение = [(поглощение контроля - поглощение образца) / поглощение контроля] × 100.
      1. Выразите результаты в мг эквивалентной антиоксидантной способности тролокса на г образца, рассчитанной с использованием следующего уравнения²¹:
         ПРИМЕЧАНИЕ: мг тролокса в эквиваленте (TE) на г образца = [((% ингибирования - c) / м)) в μг Тролокс в эквиваленте × Общий объем в реакционной лунке (мл) x Разведение × масса сухого образца (1 г) x Результирующий объем экстракта (мл)] / [(Объем образца, добавленного в каждую лунку (мл) x Фактическая масса сухой пробы (г) × коэффициент пересчета из μг в мг (1000)]
         где, c = y-образный пересечение, m = наклон
3. Анализ, снижающий антиоксидантную способность железа (FRAP)
   1. Определение железоснижающей антиоксидантной активности экстракта КС по протоколу с некоторыми изменениями¹⁷.
   2. Реагент FRAP готовят с использованием ацетатного буфера 30 мМ при pH 3,6, который представляет собой смесь 10 мМ раствора TPTZ в 40 мМ HCl и 20 мМ раствора FeCl_{3,6H 2}O в соотношении 10:1:1.
   3. Поместите реагент FRAP во флакон янтарного цвета до тех пор, пока это не потребуется.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что реагент FRAP коричневого цвета. При загрязнении ионами металлов или другими химически активными соединениями реагент станет фиолетовым и должен быть утилизирован. Используйте только свежеприготовленные реактивы.
   4. Приготовьте 5-кратное разбавление образцов, разбавив их дистиллированной водой.
   5. Добавьте 10 мкл разбавленного образца или 20 мкл FeSO_{4.7H 2}O в различных стандартных концентрациях (табл. 9 и табл. 10) в 180 мкл раствора FRAP.
   6. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение 4 минут.
   7. Оцените впитывающую способность смеси при длине волны 593 нм (рисунок 9E).
   8. Постройте стандартную калибровочную кривую с использованием концентраций стандарта и поглощения на длине волны 593 нм (рис. 10E).
   9. Выразите результаты в мг FeSO₄ на г образца, рассчитанного с использованием следующего уравнения²¹:
      ПРИМЕЧАНИЕ: мг эквивалент FeSO₄ (Fe (II) E) на г образца = [((A₅₉₃ - c) / м)) в г FeSO₄ эквивалент × Общий объем в реакционной лунке (мл) x Разведение × масса сухого образца (1 г) x Результирующий объем экстракта (мл)] / [(Объем образца, добавленного в каждую лунку (мл) x Фактический вес сухого образца (г) × коэффициент пересчета из μг в мг (1000)]
      где, c = y-образный пересечение, m = наклон
4. Выполняйте все анализы (TPC, TFC, DPPH, ABTS и FRAP) каждого образца в трех экземплярах. В этом исследовании вода использовалась в качестве заглушки для большинства анализов, за исключением DPPH, где этанол служил заглушкой для решения проблемы фонового поглощения.

5. Статистический анализ

1. Используйте программное обеспечение SPSS для проведения статистического анализа экспериментальных данных.
2. Проведите тест на нормальность с помощью теста Шапиро-Уилка.
3. Сравните биологически активные вещества и антиоксидантную активность экстракта MAE CS на основе полиолов и экстрактов MAE CS на основе обычных растворителей с помощью одностороннего анализа ANOVA с помощью многодиапазонных тестов Duncan.
4. Выразим все данные как среднее значение ± SD (n = 3) и определим уровень значимости на p < 0,05.

Влияние полиольных растворителей и обычных растворителей на общее содержание фенольных соединений, общее содержание флавоноидов, анализы антиоксидантов DPPH, FRAP и ABTS
Полярность растворителя должна быть совместима с полярностью целевых активных молекул для повышения эффективности экстракции биологически активных веществ из растений²². Эксперименты проводились с использованием различных растворителей (вода, этанол, глицерин, пропиленгликоль, бутиленгликоль, метилпропандиол, изопентилдиол, пентиленгликоль, 1,2-гександиол и гексиленгликоль) для оценки их влияния на биологически активные соединения и антиоксидантную активность экстракта серебристой кожи кофе MAE.

Влияние полиольных растворителей и обычных растворителей на общее содержание фенолов
Проанализировано общее содержание фенолов в каждой экстракции с различными растворителями. Наибольшее содержание фенолов было получено в образцах с водным 1,2-гександиолом (52,0 ± 3,0 мг ГАЕ/г образца), в то время как наименьшее содержание ТПК было выявлено в образцах с водной экстракцией (31,4 ± 4,3 мг ГАО/г образца), и эти значения значительно отличались от таковых при всех других условиях. Образцы с водным пентиленгликолем показали второе по величине значение TPC, за ними следуют образцы с водным бутиленгликолем, метилпропандиолом и другими растворителями (рис. 11A). При сравнении образцов с обычными растворителями (вода и водно-этаноловая система) и образцов с растворителями на основе полиолов могут наблюдаться значительные различия в значениях ТПК (p < 0,05).

Влияние полиоловых растворителей и обычных растворителей на общее содержание флавоноидов
Проанализировано общее содержание флавоноидов в каждой экстракции с различными растворителями. Наибольшее содержание флавоноидов было получено в образцах с водным 1,2-гександиолом (20,0 ± 1,7 мг QE/г образца), демонстрируя существенное отличие от такового у всех других экстрактов. В образцах с водным изопентидиолом выявлено наименьшее значение TFC (8,8 ± 0,7 мг QE/г образца), которое достоверно не отличалось от водного метилпропандиола и водных экстрактов этанола. Кроме того, второе по величине значение TFC было обнаружено в образце с водным пентиленгликолем, за которым следовали водный гексиленгликоль, водный пропиленгликоль, водный бутиленгликоль и водный глицерин (рис. 11B).

Влияние полиоловых растворителей и обычных растворителей на антиоксидантные анализы
Антиоксидантную активность экстрактов с полиолами и обычными растворителями оценивали с помощью анализов DPPH, ABTS и FRAP. Самое высокое значение для анализа DPPH было измерено в образцах с водным гексиленгликолем (13,6 ± 0,3 мг TE/г образца), а самое низкое — в образцах с водным этанолом (4,5 ± 0,2 мг GAE/г образца), и эти значения значительно отличались от других экстрактов (p < 0,05). Вторые по величине значения DPPH наблюдались в образцах с водным раствором 1,2-гександиола, за которым следовали водный пентиленгликоль, водный метилпропандиол и другие растворители (рис. 11C).

Самое высокое значение ABTS было измерено в образцах с водно-пентиленгликолем (8,2 ± 0,1 мг TE/г образца), а наименьшее — в образцах с водой (5,6 ± 0,04 мг GAE/г образца), и эти значения значительно отличались от других экстрактов (p < 0,05). Вторые по величине значения ABTS были обнаружены в водном бутиленгликоле и водном 1,2-гександиоле, за которыми следовали образцы с водным глицерином, водным метилпропандиолом и другими растворителями (рисунок 11D).

Самые высокие значения FRAP наблюдались в образцах с водным гексиленгликолем (21,1 ± 1,3 мг Fe (II) E/g образца и самые низкие при водной экстракции (11,5 ± 0,2 Fe (II) E/g образца), при этом эти значения значительно различались (p < 0,05) для остальных растворителей. Кроме того, вторые по величине значения FRAP были обнаружены в образцах с водным пентиленгликолем, за которым следовали водный бутиленгликоль, водный глицерин и другие растворители (рис. 11E).

При сравнении антиоксидантной активности образцов с обычными растворителями (водой и водным этанолом) образцы, содержащие полиолы, продемонстрировали значительно более высокую антиоксидантную активность во всех антиоксидантных анализах (DPPH, ABTS и FRAP) (p < 0,05).

Рисунок 1: Реакция в экспериментальных контейнерах и камере МАЭ. (А) Образец и растворитель добавляются в белый межслойный сосуд тефлонового контейнера перед экстракцией. (B) Каждый контейнер помещается внутрь микроволновой камеры перед началом экстракции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 2: Специальные инструменты для закрытия реакционных сосудов. После добавления образца и растворителя в тефлоновую емкость, крышки наклеиваются на верхнюю часть емкости, помещаются в держатель сосуда и плотно закрепляются с помощью инструментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 3: Метод экстракции. (А) Метод экстракции, созданный путем входа в раздел метода. (B) Для процесса MAE применяется принадлежность SK eT. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Иллюстрация 4: Настройка скорости перемешивания и функции блокировки дверцы. (A) Магнитные мешалки внутри каждого сосуда можно активировать, выбрав скорость перемешивания. (B) Функция блокировки дверцы ограничивает температуру, позволяя открыть камеру после извлечения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 5: Настройка условий экстракции. (A) Ввод значка стола и настройка условий извлечения, таких как время, температура и мощность микроволновой печи. (B) Откройте кнопку мешалки и выберите скорость вентилятора. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 6: Установка времени охлаждения. Применение времени охлаждения для снижения внутренней температуры в камере MAE. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 7: Запуск процесса извлечения. (A) Сохранение метода, созданного для извлечения. (B) Нажмите на значок воспроизведения, чтобы начать процесс извлечения. (C) Выбор количества судов для начала добычи. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 8: Изображение конечного экстракта после экстракции с помощью MAE. Получение надосадочной жидкости после центрифугирования. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 9: 96 луночных планшетов для определения активности поглощения экстрактов TPC, TFC, DPPH, ABTS и анализа FRAP. (А) Определение ТПК для стандартной тарелки галловой кислоты в концентрации 2,5-75 мкг/мл и экстрактов образца. (B) Определение TFC для стандартной тарелки кверцетина в концентрациях 2,5-50 г/мл и анализ TFC для измерения экстрактов образцов. (C) Определение активности поглощения DPPH для стандартной пластины Trolox в концентрациях 0,25-12,5 г/мл и пластины для обнаружения активности очистки DPPH в образцах экстрактов. (D) Определение активности поглощения ABTS для стандартной пластины Trolox в концентрациях 0,25-5 г/мл и пластины для обнаружения активности поглощения ABTS экстрактов проб. (E) Определение FRAP-анализа для стандартной пластины FeSO₄ в концентрациях 0,25-10 мкг/мл и с помощью пластины для детектирования пробных экстрактов методом FRAP. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 10: Стандартные калибровочные кривые для продувочной активности TPC, TFC, DPPH, ABTS и анализа FRAP. (A) Стандартная кривая для определения TPC, построенная по концентрациям галловой кислоты и абсорбции на уровне A₇₆₅. (B) Стандартная кривая для определения TFC, построенная по концентрациям стандарта кверцетина и абсорбции на уровне А₅₁₀. (C) Стандартная кривая для определения продувочной активности DPPH, построенная по концентрациям стандарта Trolox и % ингибирования. (D) Стандартная кривая для определения продувочной активности ABTS, построенная по концентрациям стандарта Тролокса и % ингибирования. (E) Стандартная кривая для измерения анализа FRAP, построенная по концентрациям сульфата железа и абсорбции на уровне А₅₉₃. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Рисунок 11: Влияние типов растворителей на активность поглощения TPC, TFC, DPPH, ABTS и анализ FRAP в MAE кофе серебристой кожи. (A) Влияние типов растворителей на общее содержание фенольных соединений. (В) Влияние типов растворителей на общее содержание флавоноидов. (C) Влияние типов растворителей на активность поглощения DPPH. (D) Влияние типов растворителей на активность АБТС по очистке. (E) Влияние типов растворителей на анализ FRAP. Значения обозначаются как среднее значение ± SD (n = 3). Значения с разными надстрочными буквами выражают статистически значимую разницу (p < 0,05). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.

Таблица 1: Подготовка стандартной кривой галловой кислоты. Приготовление стандартного диапазона концентраций 2,5-75 мкг/мл в 96-луночном планшете. B = заготовка, 1-7 = количество лунок на 96-луночной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 2: Окончательный расчет концентрации норм галловой кислоты. Подготовка стандартного диапазона концентраций 2,5-75 г/мл. Конечные концентрации (мкг/мл) галловой кислоты рассчитываются соответственно. Конечная концентрация (мкг/мл) = (Начальная концентрация (мг/мл) × Начальный объем (мкл) / конечный объем (мкл)) × (1000 мкг/1 мг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 3: Приготовление стандартной кривой кверцетина. Приготовление стандартного диапазона концентраций 2,5-50 мкг/мл в 96-луночном планшете. B = заготовка, 1-7 = количество лунок на 96-луночной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 4: Таблица расчета окончательной концентрации для стандартов кверцетина. Подготовка стандартного диапазона концентраций 2,5-50 мкг/мл. Конечные концентрации (мкг/мл) кверцетина рассчитываются соответствующим образом. Конечная концентрация (мкг/мл) = (Начальная концентрация (мг/мл) × Начальный объем (мкл) / конечный объем (мкл)) × (1000 мкг/1 мг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 5: Приготовление стандартной кривой Тролокса в диапазоне концентраций 0,25-12,5 мкг/мл. Подготовка стандартного диапазона концентраций 0,25-12,5 мкг/мл в 96-луночном планшете. B = заготовка, C = контроль, 1-7 = количество лунок на 96-луночной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 6: Окончательный расчет концентраций стандартов Тролокса для анализа DPPH. Подготовка стандартного диапазона концентраций 0,25-12,5 мкг/мл, включая конечные концентрации (мкг/мл) тролокса. Конечная концентрация (мкг/мл) = (Начальная концентрация (мг/мл) × Начальный объем (мкл) / конечный объем (мкл)) × (1000 мкг/1 мг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 7: Получение стандартной кривой Тролокса в диапазоне концентраций 0,25-5 мкг/мл. Подготовка исходного материала стандартного диапазона концентраций 0,25-5 г/мл в 96-луночном планшете. B = заготовка, C = контроль, 1-7 = количество лунок на 96-луночной пластине. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 8: Окончательный расчет концентраций стандартов Trolox для анализа ABTS. Подготовка стандартного диапазона концентраций 0,25-5 мкг/мл, включая конечные концентрации (мкг/мл) Тролокса. Конечная концентрация (мкг/мл) = (Начальная концентрация (мг/мл) × Начальный объем (мкл) / конечный объем (мкл)) × (1000 мкг/1 мг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 9: Итоговая таблица расчета концентраций для стандартов FeSO₄ . Готовится препарат стандартного диапазона концентраций 2,5-100 мкг/мл, включая конечные концентрации (мкг/мл) FeSO₄. Конечная концентрация (мкг/мл) = (Начальная концентрация (мг/мл) × Начальный объем (мкл) / конечный объем (мкл)) × (1000 мкг/1 мг). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Таблица 10: Подготовка стандартной кривой FeSO₄ . Приготовление стандартного диапазона концентраций 0,25-10 мкг/мл в 96-луночном планшете. B = пустой. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы скачать эту таблицу.

Различные факторы играют решающую роль в успешном внедрении MAE, такие как фитохимическое содержание растительных компонентов, продолжительность экстракции, температура, микроволновая мощность, соотношение твердой и жидкой фаз и концентрация растворителя¹³. Растения обычно демонстрируют различные профили фитохимических веществ; Следовательно, выбор натуральных растений, богатых антиоксидантами и фенольными соединениями, имеет важное значение²³. Кроме того, отдельные биологически активные компоненты проявляют различные полярности в зависимости от используемого растворителя. Точно так же растворители демонстрируют различную полярность. Учитывая, что полярность растворителей играет решающую роль в определении эффективности экстракции биологически активных соединений из сырья, крайне важно, чтобы полярность растворителя совпадала с полярностью целевых биологически активных молекул²⁴.

В этом исследовании различные полиолы использовались для извлечения полифенолов и антиоксидантов из серебристой кожи кофе с использованием MAE. Полифенолы являются преимущественно полярными, а растворители с высокой полярностью обычно увеличивают выход фенольных соединений²⁵. По сравнению с образцами с водой и этанолом, образцы с использованием различных полиолов продемонстрировали более высокую эффективность во всех измеряемых ответах, включая TPC, TFC и антиоксидантные анализы, такие как DPPH, ABTS и FRAP. Предыдущие исследования подтверждают выводы о том, что водно-полиольные смеси могут увеличивать выход экстракции биологически активных соединений по сравнению со смесями воды^и этанола ^9,10,11. При сравнении различных полиолов образцы со специфической водно-полиольной системой не дали наибольшего значения. Тем не менее, интересно отметить, что образцы с водным 1,2-гександиолом дали самые высокие значения в анализах TPC и TFC. Между тем, экстракты с водным гексиленгликолем показали самые высокие значения в анализах DPPH и FRAP, а экстракт водного пентиленгликоля показал самые высокие значения в анализе ABTS. Вариации в значениях, полученных с помощью различных анализов, таких как TPC, TFC, DPPH, ABTS и FRAP в системах водно-полиоловых систем, могут быть объяснены несколькими факторами, включая отличительные характеристики используемых полиолов. Полиолы демонстрируют различия в вязкости, полярности и температурах кипения, что напрямую влияет на их эффективность при извлечении биологически активных соединений из растительного сырья²⁶. Одно из возможных объяснений может быть связано с принципом «Подобное растворяет подобное», в котором конкретная система растворителей является наиболее подходящей для облегчения массопереноса конкретных биологически активных соединений²⁷. Это подчеркивает важность выбора растворителя с полярностью, соответствующей полярности целевого биологически активного соединения.

Другой возможной причиной может быть тот факт, что разница в количестве гидроксильных групп (-ОН), присутствующих в растворителе, существенно влияет на выход фенольных соединений²⁸. Среди этих полиолов только глицерин содержит три группы -ОН, в то время как остальные полиолы в данном исследовании содержат две группы -ОН. Растворители с большим числом -ОН-групп, как правило, демонстрируют более высокую вязкость по сравнению с растворителями с меньшим^{числом 29}. Повышенная вязкость может препятствовать эффективному переносу активных соединений в процессе экстракции, тем самым снижая общий выход. Кроме того, диэлектрическая проницаемость растворителя, тесно связанная с его полярностью, играет решающую роль в определении его способности растворять полярные или неполярные растворенные вещества. Растворители с более высокими диэлектрическими проницаемостями лучше растворяют полярные растворенные вещества, а растворители с более низкими диэлектрическими проницаемостями лучше подходят для неполярных растворенных^{веществ30}. Среди полиолов глицерин демонстрирует сравнительно высокую диэлектрическую проницаемость 41,14, в то время как гексиленгликоль, пентиленгликоль и 1,2-гександиол демонстрируют более низкие диэлектрические проницаемости 25,86, 17,31 и 15,45 соответственно^31,32. Результаты этого исследования свидетельствуют о том, что биологически активные соединения в образце могут включать в себя низкополярные компоненты.

Эффективность экстракции может быть повышена за счет оптимизации выбора и состава растворителей, и могут потребоваться дальнейшие эксперименты для определения наиболее подходящей системы растворителей. Несмотря на то, что исследование демонстрирует потенциал, оно ограничено тем, что оно сосредоточено исключительно на микроволновой экстракции с помощью полиолов и ограниченной оценкой других переменных, включая продолжительность экстракции, температуру, концентрацию растворителя, соотношение твердой и жидкой фаз и мощность экстракции. Кроме того, необходимо механистическое исследование, чтобы понять, как полиолы функционируют из-за их различных диэлектрических проницаемостей, непосредственно влияя на их растворимость полярных или неполярных растворенных веществ. Различия в диэлектрических проницаемостях между полиолами подчеркивают важность изучения их специфических механизмов в извлечении биологически активных соединений. Такие исследования позволят получить ценную информацию о взаимодействиях растворителей и растворенных веществ, что поможет оптимизировать и выбрать системы растворителей для эффективных процессов экстракции.

Что касается процесса MAE, то здесь есть некоторые ограничения. В то время как MAE может обеспечить быстрый нагрев, точный контроль температуры может быть сложной задачей, что потенциально может привести к перегреву и деградации термочувствительных соединений³³. Тем не менее, настройка мощности микроволновой печи для градиента и температуры экстракции может быть установлена на ту же мощность микроволновой печи, чтобы избежать снижения температуры во время экстракции. Кроме того, MAE имеет ограничения на термочувствительные компоненты установки. Тем не менее, передовая технология Ethos X MAE может свести к минимуму риск ухудшения состояния за счет поддержки эффективного нагрева в течение более короткого времени с использованием диэлектрического нагрева³⁴. Каждый сосуд камеры MAE имеет свою ограниченную максимальную вместимость твердых и жидких веществ. Соотношение твердой и жидкой фаз выше этого предела также может сильно влиять на концентрацию экстрактов¹¹. Растворение между растворителем и растворенным веществом может быть обеспечено с помощью мешалок, что потенциально может привести к эффективной экстракции и более высокому выходу³⁵. Кроме того, экстрагированные фенольные и флавоноидные соединения в экстрактах могут быть проверены с помощью дополнительного анализа, такого как жидкостная хроматография с тройной квадрупольной масс-спектрометрией (LC-QQQ) и жидкостная хроматография с квадрупольной времяпролетной масс-спектрометрией (LC-QTOF), для установления наличия конкретных биологически активных соединений и их соответствующих количеств³⁶.

Экстракция полифенолов и антиоксидантов из серебристой кожи кофе с использованием водных полиолов с помощью MAE показала более высокую эффективность по сравнению с водными и водными экстрактами этанола. Основываясь на результатах, полученных из МАЭ на основе полиолов экстрактов CS, было замечено, что использование систем водно-гексиленгликоля, водно-1,2-гександиола и водно-пентиленгликоля привело к значительно более высоким выходам экстракции биологически активных соединений и антиоксидантной способности. Более того, эти результаты подчеркивают потенциал использования таких экстрагированных соединений для последующих исследовательских анализов. Использование полиолов в качестве «зеленых» растворителей для экстракции биологически активных соединений из растительного сырья с помощью MAE обещает экологические преимущества и повышение выхода биоактивных соединений, предлагая устойчивый подход с потенциалом использования в косметических целях.

Авторам нечего раскрывать.

Это исследование было профинансировано Университетом Мае Фах Луанг. Авторы хотели бы выразить признательность Институту чая и кофе Университета Мае Фах Луанг за содействие установлению связей между исследователями и местными фермерами в отношении приобретения образцов серебристой кожи кофе.