Катетер-ассоциированная модель инфекции Candida albicans у мышей

Мы создали мышиную модель катетер-ассоциированной инфекции (CRI), связанной с C.albicans, при которой на катетере образуется биопленка, а взаимодействие между C.albicans и хозяином хорошо коррелирует с клиническим CRI. Эта модель помогает проводить скрининг терапии для биопленкоассоциированных CRI, связанных с C.albicans , закладывая основу для клинической трансформации.

Катетер-ассоциированная инфекция (CRI) является распространенной внутрибольничной инфекцией, вызываемой Candida albicans во время имплантации катетера. Как правило, биопленки образуются на внешней поверхности катетера и приводят к диссеминированным инфекциям, которые приводят к летальному исходу для пациентов. В клиниках отсутствует эффективная профилактика и ведение лечения. Поэтому необходимо срочно создать животную модель КРИ для доклинического скрининга новых стратегий его профилактики и лечения. В этом исследовании полиэтиленовый катетер, широко используемый медицинский катетер, был введен в заднюю часть мышей BALB/c после удаления волос. Кандида белая (Candida albicans) ATCC MYA-2876 (SC5314), экспрессирующий усиленный зеленый флуоресцентный белок, впоследствии инокулировали на поверхность кожи вдоль катетера. Интенсивная флуоресценция наблюдалась на поверхности катетера под флуоресцентным микроскопом через 3 суток. Зрелые и толстые биопленки были обнаружены на поверхности катетера с помощью сканирующей электронной микроскопии. Эти результаты указывали на адгезию, колонизацию и образование биопленки Candida albicans на поверхности катетера. Гиперплазия эпидермиса и инфильтрация воспалительных клеток в образцах кожи указывали на гистопатологические изменения CRI-ассоциированной кожи. Подводя итог, можно сказать, что модель CRI мыши была успешно создана. Ожидается, что эта модель будет полезна в исследованиях и разработке терапевтического менеджмента при CRI, ассоциированном с Candida albicans .

В последние годы, с развитием и применением биомедицинских материалов, инфекции, связанные с имплантатами, становятся сложными клиническими проблемами ^1,2. При широком применении медицинских катетеров в клиниках количество сопутствующих инфекций и смертей ежегодно огромно ^3,4. Распространенные пути инфицирования катетер-ассоциированной инфекции (CRI) включают: (1) патогенные микроорганизмы на поверхности кожи проникают в организм и прикрепляются к внешней поверхности катетера ^5,6,7; (2) патогенные микроорганизмы, полученные в результате неправильной асептической операции, проникают, прилипают и колонизируются на катетере; (3) болезнетворные микроорганизмы в кровотоке прикрепляются и колонизируются на катетере; (4) лекарственные средства, контаминированные патогенными микроорганизмами.

Кандидоз является третьей по частоте причиной CRI ^8,9. Очень вероятно, что он вызовет инфекцию кровотока и другие опасные для жизни инвазивные кандидозы после того, как на поверхности имплантата образуются биопленки. Прогноз неблагоприятный, а летальность высокая². Сообщается, что биопленки образуются на поверхности катетера в течение 2 недель после введения центральной вены и в просвете катетера через несколько недель^10,11.

Биопленки Candida albicans (C. albicans), образующиеся на медицинских катетерах, представляют собой двухслойную сеть, состоящую из дрожжей, стромы и мицелия^12,13. Образование биопленок C. albicans является не только ключом к лекарственной устойчивости и уклонению от иммунного ответа¹³, но и жизненно важным для образования диссеминированных спор, что приводит к дальнейшей гематогенной инфекции ^2,12 и приводит к более серьезным и даже опасным для жизни последствиям. C. albicans-ассоциированный CRI является основной причиной клинических грибковых инфекций кровотока ^7,14, и более чем у 40% пациентов с инфекцией C. albicans в центральном венозном катетере развивается бактериемия¹⁵.

По данным Американского общества инфекционных заболеваний, рекомендуемое лечение Candida CRI включает: (1) удаление инфицированного катетера; (2) 14-дневная системная противогрибковая терапия⁸; (3) реимплантация нового катетера⁴. Однако в клинической практике катетеры иногда не могут быть полностью удалены. Некоторые пациенты могут лечиться только системными антибиотиками и антимикробной замочной терапией, сопровождающейся сильными побочными эффектами^16,17.

Существующие животные модели C. albicans, такие как модель кандидоза ротоглотки, модель вагинального кандидоза и модель инвазивной системной инфекции, вызванной кандидозом^18,19, не могут хорошо коррелировать с клиническим CRI. Таким образом, в данном исследовании была установлена модель CRI, ассоциированная с C. albicans, у мышей. В качестве подкожных имплантатов использовали клинически широко используемые полиэтиленовые катетеры^20,21, а C. albicans инокулировали на поверхность кожи для имитации адгезии C. albicans к медицинским катетерам и образования биопленок.

Эта модель была успешно использована в нашей лаборатории для скрининга антибиопленочного эффекта различных терапевтических средств²². Кроме того, из-за задержки обнаружения C. albicans после катетерной инфекции был сконструирован штамм C. albicans , содержащий усиленный зеленый флуоресцентный белок (EGFP), и инокулирован мышам, чтобы облегчить интуитивное наблюдение колоний и биопленок C. albicans на имплантированном катетере.

Экспериментальные животные, самцы мышей BALB/c (12-16 г), были приобретены в Центре лабораторных животных Научного центра здоровья Сианьского университета Цзяотун. Все процедуры были одобрены Институциональным комитетом по этике животных Сианьского университета Цзяотун с номером лицензии SCXK (Шэньси) 2021-103.

1. Подготовка буфера и оборудования

1. Трансфект штаммов C. albicans плазмидой pCaExp с высокой экспрессией.
   1. Приобретите C. albicans (SC5314) в ATCC. Флуоресцентный штамм²² с высокой экспрессией EGFP получают путем трансфекции C. albicans плазмидой pCaExp с высокой экспрессией, содержащей полную открытую рамку считывания гена EGFP (плазмидная карта показана на рисунке 1), и используют ее для последующих экспериментов.
2. Культивирование трансфицированных штаммов C. albicans .
   1. Выберите моноклональные колонии флуоресцентного штамма C. albicans из чашки пептона декстрозы экстракта дрожжей (YPD) и культивирования в течение ночи (30 °C и 220 об/мин) в 5 мл жидкой среды YPD (YPD + 50 мкг/мл карбенициллина).
   2. Ресуспендант C. albicans в физиологическом растворе после центрифугирования при 400 x g в течение 5 мин при RT.
   3. Отрегулируйте концентрацию суспензии C. albicans до 1 x 10⁸ клеток/мл, сравнив мутность со стандартом 0,5 по Мак-Фарланду.
3. Подготовьте хирургические инструменты.
   1. Убедитесь, что все хирургические инструменты (ножницы, щипцы, гемостатические щипцы, иглодержатели, шовные иглы) автоклавированы при температуре 121°C в течение 30 минут. Используются стерильные полиэтиленовые катетеры (внутренний диаметр: 0,28 мм; наружный диаметр: 0,63 мм).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Катетеры, использованные в этом исследовании, были стерилизованы газообразным окисью этилена, а упаковка была открыта в сверхчистом столе, подверженном воздействию ультрафиолета в течение более 30 минут. Перед имплантацией мышам катетеры погружали в 75% этанол для предотвращения загрязнения.

2. Создание модели CRI мыши

ПРИМЕЧАНИЕ: Хирургическая процедура показана на рисунке 2.

1. Акклиматизируйте 30 мышей BALB/c (12-16 г, самец) в условиях, свободных от специфических патогенов (SPF) со свободным доступом к воде и пище и чередованием светового и темного цикла в течение 12-12 часов.
2. Случайным образом разделите 30 мышей BALB/c на три группы (n = 10 мышей/группа): (A) нормальная контрольная группа; (В) катетерная группа (катетеры, имплантированные без C. albicans); (C) Модельная группа (катетеры, имплантированные C. albicans).
3. Обезболивайте мышей 1-4% изофлураном и положите мышей на операционный стол в положении лежа. Потеря рефлекса выпрямления и отсутствие реакции на стимуляцию пальцев ног подтверждает успешную анестезию. Удалите волосы и простерилизуйте место операции тремя чередующимися циклами йодофора или хлоргексидина и спиртовыми скрабами.
4. Оставьте мышей в нормальной контрольной группе без какого-либо лечения и обеспечьте свободный доступ к еде и воде.
5. Для мышей в катетерной и модельной группах поддерживайте анестезию на уровне 3% изофлурана. Подтвердите достаточную глубину анестезии отсутствием реакции на защемление пальца ноги и при необходимости отрегулируйте концентрацию изофлурана.
6. Для мышей в катетерной группе внутрикожно введите стерильную иглу шприца объемом 1 мл в область обратной депиляции, чтобы сделать отверстие. Вставьте катетер (около 1 см в длину) в отверстие после извлечения иглы шприца.
7. Для мышей в модельной группе пипетка 20 мкл суспензии C. albicans на область депиляции спины, чтобы имитировать комменсал C. albicans на коже.
8. После того, как раствор впитается кожей, введите катетер в область обратной депиляции, выполнив те же процедуры, что описаны в шаге 2.5.
9. Пипеткой еще 20 мкл суспензии C. albicans вдоль катетера в ткани для имитации C. albicans во внешней среде.
10. Зафиксируйте катетеры скотчем и марлей и верните мышей в клетки для кормления. В конце лечения мышам подкожно вводят мелоксикам (4 мг/кг) в качестве обезболивающего средства в течение трех дней подряд.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После операции мышей осторожно кормили водой и пищей. За мышами наблюдали два раза в день. Мышей усыпляли методом, одобренным IACUC, если они испытывали трудности с кормлением, значительную потерю веса (10-20%) и гипотермию.

3. Оценка модели CRI

1. Через 3 дня обезболивайте мышей 3% изофлураном и приносите их в жертву вывихом шейки матки. Соберите катетеры и образцы кожных тканей со спины мышей.
2. Наблюдение за C. albicans и биопленками на катетере с помощью сканирующей электронной микроскопии.
   1. Погружают катетеры в 2,5% раствор глутарового альдегида при 4 °C на 48 ч. Промыть катетеры стерильным ПБС три раза.
   2. Зафиксируйте катетеры 1% осминовой кислотой на 3 ч и трижды промойте стерильным ПБС.
   3. Обезвоживают клетки на катетерах в градиентном растворе этанола с возрастающими концентрациями (50%, 70%, 80%, 90% и 100%, 15 мин/градиент).
   4. Погрузить катетеры в трет-бутиловый спирт три раза (каждый раз по 30 мин).
   5. Быстро заморозьте катетеры в жидком азоте и высушите образец в сублимационной сушилке в соответствии с инструкциями производителя.
   6. Напылите на образцы катетера золото с длиной волны 10 нм методом осаждения ионным пучком.
   7. Наблюдение за присутствием C. albicans и его биопленки на поверхности катетера каждой группы под сканирующим электронным микроскопом (в условиях высокого вакуума, 1,5 кВ) и запись изображений в каждой группе.
3. Наблюдают C. albicans на катетере с помощью флуоресцентной микроскопии.
   1. Погружают катетеры в 4% раствор параформальдегида для фиксации при 4 °С на 48 ч.
   2. Наблюдают присутствие C. albicans и его биопленки на поверхности катетера каждой группы с помощью флуоресцентного микроскопа при возбуждении 484 нм и записывают изображения в каждой группе.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение составляет 400x. Флуоресценцию Candida albicans можно наблюдать при возбуждении на длине волны 490 нм и испускании на длине волны 510 нм.
4. Понаблюдайте за C. albicans, живущим в коже мышей.
   1. Погружают дорсальные ткани кожи мышей в 4% раствор параформальдегида для фиксации при 4 °С на 48 ч.
   2. Обезвоживают ткани тыльной поверхности кожи в градиентном растворе этанола с возрастающими концентрациями (50%, 70%, 80%, 90% и 100%, 15 мин/градиент).
   3. Обезвоженные ткани спинной кожи закапывают в парафин при температуре 55-60 °С. Обращайте внимание на температуру, чтобы избежать ломкости тканей. Чтобы удалить как можно больше загрязнений, повторите этот шаг три раза (по 30 мин).
   4. Разрез дорсальных тканей кожи (толщина = 5 мкм) с помощью микротома.
   5. Очистите парафиновые срезы от парафина, дважды погрузив предметные стекла в ксилол на 20 минут.
   6. Регидратируйте срезы с помощью элюирования градиентным этанолом (абсолютный этанол, 90% этанол, 75% этанол, вода) каждый раз в течение 5 минут.
   7. Окрасьте срезы периодической кислотой, погрузив срез в периодический раствор кислоты на 15 мин, перед промывкой проточной водой один раз и дистиллированной водой дважды.
   8. Прокрасьте срезы раствором для окрашивания шеврона (в соответствии с инструкциями производителя) в течение 30 минут в темноте и промойте срезы под проточной водой в течение 5 минут.
   9. Срезы погружают в раствор гематоксилина на 3-5 мин перед промыванием проточной водой (2-3 мин), дифференцированным раствором (5-10 мин) и проточной водой соответственно.
   10. Погрузите срезы в этанол три раза (по 5 минут каждый) и ксилол два раза (по 5 минут каждый), прежде чем заклеить срез нейтральной смолой.
   11. Посмотрите на изображения образца с помощью микроскопа и проанализируйте остатки C. albicans в коже мыши.
       ПРИМЕЧАНИЕ: Увеличение составляет 10x для окуляра и 4x или 10x для объектива.
5. Наблюдают за гистопатологическими изменениями в дорсальных тканях кожи.
   1. Погрузить ткани тыльной кожи в 4% раствор параформальдегида для фиксации при 4 °С на 48 ч. Обезвоживают дорсальные ткани кожи в градиентном растворе этанола с возрастающими концентрациями (50%, 70%, 80%, 90% и 100%, 15 мин/градиент).
   2. Поместите обезвоженные ткани дорсальной кожи в парафин, как описано в шаге 3.4.3.
   3. Разрез дорсальных тканей кожи (толщина = 5 мм) микротомом.
   4. Очистите парафиновые срезы от парафина, дважды погрузив предметные стекла в ксилол на 20 минут.
   5. Регидратируйте срезы с помощью элюирования градиентным этанолом (абсолютный этанол, 90% этанол, 75% этанол, вода) каждый раз в течение 5 минут.
   6. Окрасьте срезы гематоксилином в течение 4 минут, а затем промойте водопроводной водой, чтобы удалить цвет поплавка.
   7. Дифференцируйте образец 1%-ным раствором соляной кислоты и этанола перед промывкой предметных стекол проточной водой.
   8. Погрузите образец в 85% и 95% этанол на 5 минут и окрасьте их раствором эозина на 3 минуты.
   9. Обезвоживайте образцы, погружая их в градиентный этанол (70%, 90%, 95% и 100%) и ксилол на 2 минуты каждый.
   10. Запечатайте образец нейтральной смолой.
   11. Наблюдайте за изображениями образца с помощью микроскопа и анализируйте патологические изменения.

C. albicans и биопленки на катетерах могут быть обнаружены с помощью SEM. Как показано на рисунке 3²², поверхность полиэтиленовых катетеров в катетерной группе была гладкой, и прилипших патогенных микроорганизмов не наблюдалось. Однако на поверхности полиэтиленовых катетеров в модельной группе были видны зрелые и плотные биопленки C. albicans, что указывает на то, что C. albicans может успешно колонизировать и формировать биопленки на поверхности катетера у мышей в экспериментальных условиях. Более того, результаты флуоресцентной микроскопии дополнительно подтвердили вышеуказанные выводы (рис. 4)²². Явной флуоресценции на поверхности полиэтиленовых катетеров в катетерной группе не было. Однако сильная флуоресценция, испускаемая адгезивными клетками C. albicans, была видна на поверхности катетера в модельной группе. Это указывало на то, что большое количество клеток C. albicans прилипало к поверхности катетеров, что продемонстрировало успешное построение моделей CRI, связанных с биопленкой C. albicans, у мышей.

Для более интуитивной верификации инфекции кожных тканей мышей был проведен анализ окрашивания по шкале Шеффа Периодата. Он обнаруживает углеводы в грибковых клетках, что обычно используется в клинических исследованиях (рис. 5)²². Кожная ткань в нормальной контрольной и катетерной группе была окрашена периодической кислотой-Шиффом (PAS), что свидетельствовало об отсутствии клеток C. albicans в тканях. В модельной группе было обнаружено небольшое количество положительных PAS-окрашенных клеток C. albicans , что еще раз подтвердило успешное моделирование инвазии и адгезии, связанных с C. albicans.

Далее патологические изменения в кожных тканях мышей, индуцированные C. albicans , оценивали с помощью гистопатологического анализа. Как показано на рисунке 6²², в модельной группе слой эпидермиса был значительно утолщен и расширен до внутренней части кожи. Также была видна воспалительная инфильтрация, указывающая на то, что инфекция C. albicans вызвала явные патологические изменения в кожной ткани мыши. Слой эпидермиса, слой дермы, сальные железы, волосяные фолликулы и другие структуры были чистыми и полными в катетерной группе. Отека и воспалительной инфильтрации не наблюдалось, как и в контрольной группе в норме. Эти результаты показали, что введение катетера само по себе не вызывает явных изменений в кожной ткани. Патологические изменения в тканях модельной группы обусловлены инфекцией, вызванной C. albicans. Таким образом, полученные результаты подтверждают успешное создание мышиной модели CRI, ассоциированной с биопленкой C. albicans .

Рисунок 1: Атлас плазмид pCaExp. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схема, показывающая процедуру модели CRI мышей, ассоциированных с C.albicans. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: СЭМ на поверхности катетера в каждой группе. (А) группа катетеров; (B) Модельная группа (1000x, масштабная линейка = 50 мкм; 5000x, масштабная линейка = 10 мкм). Эта цифра была изменена с разрешения Mo et ^al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Катетерная поверхностная флуоресцентная микроскопия в каждой группе. (А) Катетерная группа; (B) Группа моделей (масштабная линейка = 100 мкм). Эта цифра была изменена с разрешения Mo et ^al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Окрашивание H&E кожи спины мышей в каждой группе. (А) Катетерная группа; (B) Модельная группа; (C) Контрольная группа, (40x, масштабная линейка = 400 мкм; 100x, масштабная линейка = 200 мкм). Эта цифра была изменена с разрешения Mo et ^al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: PAS-окрашивание кожи спины мышей в каждой группе. (А) Катетерная группа; (B) Модельная группа; (C) Контрольная группа, (40x, масштабная линейка = 400 мкм; 100x, масштабная линейка = 200 мкм). Значительное утолщение и расширение слоя эпидермиса на внутреннюю часть кожи можно увидеть в модельной группе (красные прямоугольники). Эта цифра была изменена с разрешения Mo et ^al.22. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

ХРИ является одной из наиболее распространенных внутрибольничных инфекций в клинической практике²³. Патогенные микроорганизмы в придатках кожи, таких как эпидермис, сальные железы и волосяные фолликулы, являются возможными причинами CRI ^23,24. Кандида является третьим по величине патогеном, вызывающим CRI, при этом Candida albicans был наиболее распространенным типом инфекции биопленки^25,26. Таким образом, мы стремились построить соответствующую животную модель CRI, связанную с биопленкой Candida albicans, чтобы поддержать лечение и профилактику родственных CRI.

Для построения модели CRI небольшое количество C. albicans было добавлено в дорсальную кожу мышей, что моделирует клиническую ситуацию, при которой часть C. albicans не может быть полностью уничтожена в глубоких тканях и придатках кожи путем обычной стерилизации. После имплантации катетера C. albicans был повторно инокулирован, чтобы имитировать присутствие C. albicans во внешней среде во время операции.

В этом исследовании для построения модели был выбран 3-дневный временной отрезок, который ниже, чем у традиционных моделей животных, связанных с биопленкой C. albicans ^18,27 из-за трудности формирования биопленки. На поверхности катетера в этой модели была видна постинфекционная адгезия C. albicans и образование биопленки, что было доказано результатами СЭМ и флуоресцентной микроскопии (рис. 3 и рис. 4). Это может быть связано с тем, что концентрация C. albicans в данном исследовании составила 1 × 10⁸ КОЕ/мл, что было значительно выше, чем у других моделей животных^18,27. Кроме того, кожа вокруг катетера находится в постоянном контакте с внешней средой. Чтобы смоделировать экстремальные условия, с которыми может столкнуться CRI, C. albicans снова привили после операции.

Рецидив инфекции часто вызывается болезнетворными микроорганизмами, которые остаются в окружающих тканях 23,28,29. Поэтому наличие или отсутствие возбудителей в тканях имеет важное значение для CRI. В данной работе было проведено окрашивание PAS для исследования остатков C. albicans в тканях кожи. Этот метод также может быть использован для оценки эффекта клиренса новых терапевтических препаратов или методов лечения CRI.

В заключение, штамм Candida albicans с eGFP был использован для построения модели CRI мыши, чтобы облегчить интуитивное наблюдение колонизации Candida albicans на катетерах. Этот штамм также может быть использован для оценки взаимодействия между Candida albicans и клетками хозяина, например, инвазии и адгезии Candida albicans к хозяину, эффекта терапии против Candida albicans и иммунного ответа. Кроме того, был использован двухэтапный метод инокуляции для моделирования патогенов, полученных из внешней среды и организма. Стоит отметить, что последующая микробная культура после заражения не проводилась. Наличие биопленок является важным фактором низкой чувствительности культур 30,31,32. Предыдущие сообщения свидетельствуют о том, что микробный посев после инфекции имел низкую чувствительность, специфичность и точность 30,31,32,33,34. Зато наличие биопленок на имплантате является более надежным показателем. Поэтому в данном исследовании были использованы СЭМ и флуоресцентная микроскопия для визуализации и идентификации Candida albicans, образующих биопленки.

Однако эта модель не имитировала взаимодействие между ослабленным иммунитетом пациента и инфекцией Candida albicans , наблюдаемой в клиниках. Если бы модель могла учитывать лечение ослабленного иммунитета (например, непрерывные инъекции глюкокортикоидов^{) до} инокуляции Candida albicans , можно было бы лучше моделировать инфекции, возникающие в клинических ситуациях.

Авторы заявляют, что у них нет известных конкурирующих финансовых интересов или личных отношений, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.

Мы благодарны за финансовую поддержку Фонду естественных наук провинции Шэньси (номер гранта 2021SF-118) и Национальному фонду естественных наук Китая (грант No 81973409, 82204631).