マウスにおけるカテーテル関連 カンジダ・アルビカンス 感染モデル

カテーテル上にバイオフィルムが形成され、C.albicansと宿主の相互作用が臨床CRIとよく相関するC.albicans関連カテーテル関連感染症(CRI)のマウスモデルを確立しました。このモデルは、C.albicansバイオフィルム関連CRIのスクリーニング療法に役立ち、臨床的変革の基礎を築きます。

カテーテル関連感染症(CRI)は、カテーテル留置中に カンジダアルビカンス によって引き起こされる一般的な院内感染です。通常、バイオフィルムはカテーテルの外表面に形成され、患者にとって致命的な播種性感染症を引き起こします。診療所には効果的な予防と治療管理はありません。したがって、CRIの予防と治療のための新しい戦略の前臨床スクリーニングのためのCRIの動物モデルを確立することが急務です。本研究では、BALB/cマウスの背中に、広く使用されている医療用カテーテルであるポリエチレンカテーテルを脱毛後に挿入しました。 カンジダ その後、増強された緑色蛍光タンパク質を発現するATCC MYA-2876(SC5314)をカテーテルに沿って皮膚表面に接種しました。3日後に蛍光顕微鏡でカテーテル表面に強い蛍光が観察された。成熟した厚いバイオフィルムは、走査型電子顕微鏡によってカテーテルの表面に見つかりました。これらの結果は、カテーテル表面における カンジダ・アルビカンスの 接着、コロニー形成、およびバイオフィルム形成を示しました。表皮の過形成および皮膚標本における炎症細胞の浸潤は、CRI関連皮膚の組織病理学的変化を示した。以上をまとめると、マウスCRIモデルの確立に成功しました。このモデルは、 カンジダ・アルビカンス 関連CRIの治療管理の研究開発に役立つことが期待されます。

近年、バイオメディカル材料の開発と応用に伴い、インプラント関連の感染症が困難な臨床問題として浮上しています^1,2。診療所での医療用カテーテルの幅広い適用により、関連する感染症と死亡の数^は毎年膨大になっています^3,4。カテーテル関連感染症(CRI)の一般的な感染経路には、(1)皮膚表面の病原体が体内に侵入し、カ^{テーテルの}外表面に付着する^5,6,7;(2)不適切な無菌操作由来の病原体がカテーテルに侵入し、付着し、コロニーを形成します。(3)血液循環中の病原体がカテーテルに付着してコロニーを形成する。(4)病原微生物に汚染された薬物。

カンジダはCRI ^8,9の3番目に多い理由です。インプラントの表面にバイオフィルムが形成された後、血流感染やその他の生命を脅かす侵襲性カンジダ症を引き起こす可能性が非常に高いです。予後は不良で、^{死亡率は高い}2。中心静脈挿入後2週間以内にカテーテルの表面にバイオフィルムが形成され、数週間後にカテーテルの内腔にバイオフィルムが形成されることが報告されています^10,11。

医療用カテーテル上に形成されるカンジダ・アルビカンス(C. albicans)バイオフィルムは、酵母、間質、菌糸体からなる二重層ネットワークを示す^12,13。 C.アルビカンスバイオフィルムの形成は、薬剤耐性と免疫回避の鍵であるだけでなく¹³、播種性胞子の生成にも不可欠であり、さらなる血行性感染^2,12につながり、より深刻で生命を脅かす結果をもたらします。C.アルビカンス関連CRIは、臨床的真菌血流感染症の主な原因であり^7,14、中心静脈カテーテルにおけるC.アルビカンス感染症患者の40%以上が菌血症に発展します¹⁵。

米国感染症学会によると、カンジダCRIの推奨治療には、(1)感染したカテーテルの除去が含まれます。(2)患者を14日間の全身抗真^菌療法にさらす8;(3)新しいカテーテルを再移植する⁴.しかし、臨床現場では、カテーテルを完全に抜去できないことがあります。一部の患者は、全身性抗生物質と抗菌ロック療法でのみ治療でき、強い副作用を伴います^16,17。

口腔咽頭カンジダ症モデル、膣カンジダ症モデル、カンジダ症によって引き起こされる侵襲性全身感染モデルなど、C.アルビカンスの既存の動物モデルは、臨床CRIとうまく相関できません^18,19。そこで、本研究では、C. albicansをマウスに関連させたCRIモデルを確立した。臨床的に一般的に使用されるポリエチレンカテーテルを皮下インプラントとして使用し^20,21、C.アルビカンスを皮膚表面に接種して、C.アルビカンスの医療用カテーテルへの接着とバイオフィルムの形成をシミュレートしました。

このモデルは、さまざまな治療薬の抗バイオフィルム効果をスクリーニングするために私たちの研究室で成功裏に使用されています²²。また、カテーテル感染後のC.アルビカンスの検出遅延により、植込みカテーテル上のC.アルビカンスのコロニーやバイオフィルムを直感的に観察できるように、増強緑色蛍光タンパク質(EGFP)を含むC.アルビカンス株を作製し、マウスに接種しました。

実験動物、雄のBALB / cマウス(12〜16 g)は、西安交通大学健康科学センターの実験動物センターから購入しました。すべての手順は、西安交通大学の動物倫理委員会によって承認され、ライセンス番号はSCXK(陝西省)2021-103です。

1. バッファーと機器の準備

1. 高発現プラスミドpCaExpをC .アルビカンス 株にトランスフェクトします。
   1. C. albicans (SC5314) を ATCC から購入。C. albicansに、EGFP遺伝子の完全なオープンリーディングフレームを含む高発現プラスミドpCaExp(プラスミドマップを図1に示します)をトランスフェクションして、EGFP高発現蛍光株²²を入手し、これをその後の実験に使用します。
2. トランスフェクションされた C.アルビカンス 株を培養します。
   1. 酵母抽出物ペプトンデキストロース培地(YPD)プレートから C.アルビカンス 蛍光株のモノクローナルコロニーを選択し、5 mLのYPD液体培地(YPD + 50 μg/mLカルベニシリン)で一晩(30°Cおよび220rpm)培養します。
   2. 室温で400 x gで5分間遠心分離した後、C.アルビカンスを通常の生理食塩水に再懸濁します。
   3. 濁度を 0.5 McFarland 標準試料と比較し、 C. albicans 懸濁液の濃度を 1 x 10⁸ cells/mL に調整します。
3. 手術器具を準備します。
   1. すべての手術器具(ハサミ、鉗子、止血鉗子、ニードルホルダー、縫合針)を121°Cで30分間オートクレーブします。滅菌ポリエチレンカテーテル(内径0.28mm、外径0.63mm)を使用します。
      注:この研究で使用したカテーテルはエチレンオキシドガスで滅菌され、パッケージはUVに30分以上さらされた超クリーンテーブルで開封されました。マウスに移植する前に、カテーテルを75%エタノールに浸漬して汚染を防止しました。

2. マウスCRIモデルの確立

注:外科的処置を 図2に示します。

1. 30匹のBALB/cマウス(12-16g、雄)を、水と餌に自由にアクセスし、12時間から12時間の明暗サイクルを交互に行う特異的病原体フリー(SPF)条件で順応させます。
2. 30匹のBALB/cマウスを3つのグループ(n = 10匹/グループ)にランダムに分ける:(A)正常な対照群。(b)カテーテル群( C.アルビカンスなしで埋め込まれたカテーテル);(C)モデル群( C.アルビカンスを埋め込んだカテーテル)。
3. マウスに1〜4%のイソフルランを麻酔し、マウスを手術台に腹臥位で置きます。矯正反射が失われ、つま先の刺激に反応しないことは、麻酔の成功を裏付けています。毛を取り除き、ヨードフォアまたはクロルヘキシジンとアルコールスクラブを交互に3回繰り返して手術部位を滅菌します。
4. マウスを治療せずに正常な対照群に残し、餌と水を自由に利用できるようにします。
5. カテーテル群およびモデル群のマウスでは、麻酔を3%イソフルランに維持する。つま先のつまみに反応しないことで適切な麻酔深度を確認し、必要に応じてイソフルラン濃度を調整します。
6. カテーテル群のマウスの場合、1 mLの滅菌シリンジ針を背中脱毛領域に皮内に挿入して穴を開けます。シリンジ針を外した後、穴にカテーテル(長さ約1cm)を挿入します。
7. モデル群のマウスについて、20 μLの C.アルビカンス 懸濁液を背中脱毛部位にピペットで移し、皮膚上の共生 C.アルビカンス をシミュレートしました。
8. 溶液が皮膚に吸収されたら、ステップ2.5で説明したのと同じ手順で、背中の脱毛領域にカテーテルを挿入します。
9. さらに20 μLの C.アルビカンス 懸濁液をカテーテルに沿って組織にピペットで移し、外部環境で のC.アルビカンス をシミュレートします。
10. カテーテルをテープとガーゼで固定し、マウスをケージに戻して給餌します。治療終了時に、鎮痛剤としてメロキシカム(4mg/kg)を3日間連続してマウスに皮下注射する。
    注:手術後、マウスに水と餌を注意深く与えました。マウスは1日2回モニターされた。マウスは、摂食困難、著しい体重減少(10〜20%)、および低体温症を経験した場合、IACUC承認の方法で安楽死させました。

3. CRIモデルの評価

1. 3日後、マウスに3%イソフルランを麻酔し、子宮頸部脱臼によって犠牲にする。マウスの背中からカテーテルと皮膚組織サンプルを採取します。
2. 走査型電子顕微鏡でカテーテル上のC.アルビカンス とバイオフィルムを観察します。
   1. カテーテルを2.5%グルタルアルデヒド溶液に4°Cで48時間浸します。カテーテルを滅菌PBSで3回すすぎます。
   2. カテーテルを1%オスミン酸で3時間固定し、滅菌PBSで3回すすぎます。
   3. カテーテル上の細胞をグラジエントエタノール溶液中で濃度を上げて脱水します(50%、70%、80%、90%、100%、15分/グラジエント)。
   4. カテーテルをtert-ブチルアルコールに3回(毎回30分)浸します。
   5. カテーテルを液体窒素ですばやく凍結し、メーカーの指示に従って凍結乾燥機でサンプルを凍結乾燥します。
   6. カテーテルサンプルをイオンビーム堆積により10nmの金でスパッタコートします。
   7. 走査型電子顕微鏡(高真空、1.5 kV条件下)で各グループのカテーテル表面上の C.albicans とそのバイオフィルムの存在を観察し、各グループの画像を記録します。
3. カテーテル上の C.albicansを 蛍光顕微鏡で観察します。
   1. カテーテルを4%パラホルムアルデヒド溶液に浸し、4°Cで48時間固定します。
   2. 484 nmの励起下で蛍光顕微鏡により、各グループのカテーテル表面上の C.albicans とそのバイオフィルムの存在を観察し、各グループの画像を記録します。
      注:倍率は400倍です。 カンジダ・アルビカンスの 蛍光は、490 nmの励起と510 nmの発光で観察できます。
4. マウスの皮膚に生息する C.albicans を観察します。
   1. マウスの背側皮膚組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に浸し、4°Cで48時間固定します。
   2. 背側皮膚組織を、濃度が上昇するグラジエントエタノール溶液(50%、70%、80%、90%、および100%、15分/グラジエント)で脱水します。.
   3. 脱水した背側皮膚組織を55〜60°Cのパラフィンに埋め込みます。 もろい組織を避けるために温度に注意してください。できるだけ多くの不純物を除去するには、この手順を3回(各30分)繰り返します。
   4. 背側の皮膚組織(厚さ=5μm)をミクロトームで切片化する。
   5. スライドをキシレンに20分間2回浸漬して、パラフィン切片を脱ワックスします。
   6. グラジエントエタノール(無水エタノール、90%エタノール、75%エタノール、水)で毎回5分間溶出して切片を再水和します。
   7. 過ヨウ素酸溶液に15分間浸漬してから、流水1回、蒸留水2回洗浄して、切片を過ヨウ素酸で染色します。
   8. 切片をシェブロン染色液(製造元の指示による)で暗所で30分間染色し、流水で切片を5分間すすぎます。
   9. 切片をヘマトキシリン溶液に3〜5分間浸してから、流水(2〜3分)、分化溶液(5〜10分)、流水でそれぞれ洗浄します。
   10. 切片をエタノールに3回(各5分)浸し、キシレンに2回(各5分)浸してから、中性ガムで切片を密封します。
   11. 標本の画像を顕微鏡で観察し、マウスの皮膚中の C.アルビカンス 残基を分析します。
       注意: 倍率は接眼レンズの場合は10倍、対物レンズの場合は4倍または10倍です。
5. 背側皮膚組織の組織病理学的変化を観察します。
   1. 背側皮膚組織を4%パラホルムアルデヒド溶液に浸し、4°Cで48時間固定します。背側皮膚組織をグラジエントエタノール溶液で濃度を上げて脱水します(50%、70%、80%、90%、および100%、15分/グラジエント)。
   2. ステップ3.4.3で説明したように、脱水した背側皮膚組織をパラフィンに埋め込みます。
   3. 背側の皮膚組織(厚さ= 5 mm)をミクロトームで切片化します。
   4. スライドをキシレンに20分間2回浸漬して、パラフィン切片を脱ワックスします。
   5. グラジエントエタノール(無水エタノール、90%エタノール、75%エタノール、水)で毎回5分間溶出して切片を再水和します。
   6. 切片をヘマトキシリンで4分間染色してから、水道水ですすぎ、浮遊物の色を取り除きます。
   7. 流水でスライドをすすぐ前に、1%塩酸-エタノール溶液で試料を区別します。
   8. 検体を85%および95%エタノールに5分間浸漬し、エオシン溶液で3分間染色します。
   9. 検体をグラジエントエタノール(70%、90%、95%、100%)とキシレンにそれぞれ2分間浸漬して脱水します。
   10. 試験片を中性樹脂で密封します。
   11. 顕微鏡で標本の画像を観察し、病理学的変化を分析します。

カテーテル上の C.アルビカンス とバイオフィルムはSEMで観察できました。 図 3²²に示すように、カテーテル群におけるポリエチレン製カテーテルの表面は平滑であり、病原微生物の付着は認められなかった。しかし、モデル群のポリエチレンカテーテルの表面には成熟した高密度の C.アルビカンス バイオフィルムが見られ、実験条件下でマウスのカテーテル表面に C.アルビカン スがコロニーを形成してバイオフィルムを形成することに成功したことが示されました。さらに、蛍光顕微鏡の結果は、上記の結論をさらに検証しました(図4)²²。カテーテル群のポリエチレンカテーテルの表面に明らかな蛍光は認められなかった。しかし、付着した C.アルビカンス 細胞から発せられる強い蛍光は、モデル群のカテーテル表面に見られました。このことから、カテーテル表面に多数の C.アルビカンス 細胞が付着していることが示され、マウスにおける C.アルビカンス バイオフィルム関連CRIモデルの構築に成功したことが示されました。

マウスの皮膚組織の感染をより直感的に確認するために、Sheff過ヨウ素酸染色解析を実施しました。臨床研究で一般的に使用される真菌細胞の炭水化物を検出します(図5)²²。正常対照群およびカテーテル群の皮膚組織は、過ヨウ素酸シッフ(PAS)によって陰性に染色され、組織内に C.アルビカンス 細胞が存在しないことが示されました。モデル群では、少数の陽性のPAS染色C .アルビカンス 細胞が観察され、 C.アルビカンス関連の浸潤と接着のシミュレーションの成功がさらに検証されました。

次に、 C. albicans によって誘発されたマウスの皮膚組織の病理学的変化を病理組織学的解析により評価した。 図6²²に示すように、モデル群では表皮層が有意に厚くなり、皮膚の内側まで伸びていた。炎症の浸潤も見られ、 C.アルビカンスの 感染がマウスの皮膚組織に明らかな病理学的変化を引き起こしたことを示しています。表皮層、真皮層、皮脂腺、毛包、その他の構造は、カテーテル群において明瞭かつ完全であった。浮腫や炎症浸潤は認められず、正常対照群と同様であった。これらの結果は、カテーテル単独を挿入しても皮膚組織に明らかな変化が生じないことを示しました。モデル群の組織の病理学的変化は、 C.アルビカンスによって引き起こされた感染に起因しました。要約すると、この結果は、 C. albicans バイオフィルムに関連するCRIマウスモデルの確立に成功したことを検証しています。

図1:pCaExpプラスミドアトラス。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図2: C.albicans関連CRIマウスモデルの手順を示す模式図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図3:各グループのカテーテル表面のSEM。 (a)カテーテルグループ;(B)モデル群(1000倍、スケールバー=50μm、5000倍、スケールバー=10μm)。この図は、Mo et ^al.22 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図4:各グループのカテーテル表面蛍光顕微鏡。 (a)カテーテルグループ;(B)モデル群(スケールバー=100μm)。この図は、Mo et ^al.22 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図5:各群のマウスの裏面皮膚のH&E染色。 (a)カテーテルグループ;(B)モデルグループ。(C)対照群(40倍、スケールバー=400μm;100倍、スケールバー=200μm)。この図は、Mo et ^al.22 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

図6:各群のマウスの裏面皮膚のPAS染色。 (a)カテーテルグループ;(B)モデルグループ。(C)対照群(40倍、スケールバー=400μm;100倍、スケールバー=200μm)。表皮層の皮膚内部への著しい肥厚と拡張がモデル群(赤い長方形)で見られます。この図は、Mo et ^al.22 の許可を得て変更されています。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。

CRIは、臨床診療で最も一般的な院内感染の1つです²³。表皮、皮脂腺、毛包などの皮膚付属器の病原体はすべて、CRI^23,24 の考えられる原因です。カンジダはCRIを引き起こす3番目に大きな病原体であり、カンジダ・アルビカンスは最も一般的なタイプのバイオフィルム感染症でした^25,26。そこで、カンジダ・アルビカンス・バイオフィルム関連CRIの関連動物モデルを構築し、関連するCRIの治療と予防を支援することを目指した。

CRIモデルを構築するために、マウスの背側皮膚に少量の C.アルビカン スを添加し、定期的な滅菌では皮膚の深部組織や付属器で C.アルビカン スの一部を完全に根絶できない臨床状況をシミュレートしました。 カテーテルの埋め込み後、C . albicans を再接種して、手術中の外部環境における C. albicans の存在を模倣しました。

本研究では、バイオフィルム形成が困難であるため、従来のC. albicansバイオフィルム関連動物モデル^18,27よりも低い3日間の時点をモデル構築に選択した。感染後、このモデルではカテーテル表面にC.アルビカンスの接着とバイオフィルムの形成が見られ、SEMと蛍光顕微鏡の結果によって証明されました(図3および図4)。これは、この研究におけるC.アルビカンスの濃度が1 × 10⁸ CFU / mLであり、他の動物モデルよりもはるかに高かったためである可能性があります^18,27。また、カテーテル周辺の皮膚は常に外部環境と接触しています。CRIが遭遇する可能性のある極端な環境をシミュレートするために、C.アルビカンスは手術後に再度接種されました。

感染の再発は、周囲の組織に残る病原体によって引き起こされることが多い23,28,29。したがって、組織中の病原体の有無はCRIにとって重要です。この論文では、皮膚組織中のC.アルビカンスの残留物を調べるためにPAS染色を行いました。この方法は、新しい治療薬やCRIの方法のクリアランス効果を評価するためにも使用できます。

結論として、eGFPを有するカンジダ・アルビカンス株を用いてマウスCRIモデルを構築し、カテーテル上でのカンジダ・アルビカンスのコロニー形成を直感的に観察することを可能にしました。この菌株は、カンジダ・アルビカンスと宿主細胞との間の相互作用、例えば、カンジダ・アルビカンスの宿主への侵入および接着、治療薬の抗カンジダ・アルビカンス効果、および免疫応答を評価するためにも用いることができる。また、外部環境と身体に由来する病原体をシミュレートするために、2段階の接種方法を使用しました。感染後のその後の微生物培養が行われなかったことは注目に値します。バイオフィルムの存在は、培養物の感度が低い重要な要因です30,31,32。以前の報告では、感染後の微生物培養は感度、特異性、および精度が低いことが示唆されています30,31,32,33,34。代わりに、インプラント上のバイオフィルムの存在は、より信頼性の高い指標です。したがって、この研究では、SEMと蛍光顕微鏡を使用して、バイオフィルムを形成するカンジダアルビカンスを視覚化および識別しました。

しかし、このモデルでは、患者の免疫力の低下と診療所で観察されたカンジダ・アルビカンス感染との相互作用をシミュレートしていませんでした。カンジダ・アルビカンス接種前に免疫不全治療(グルココルチコイドの連続注射など)³⁵をモデルで検討できれば、臨床現場で発生する感染症をより適切にシミュレートすることが可能になる。

著者らは、この論文で報告された研究に影響を与えたと思われる競合する金銭的利害関係や個人的な関係は知られていないと宣言しています。

陝西省自然科学基金会(助成金番号2021SF-118)および中国国家自然科学基金会(助成金番号81973409、82204631)からの財政的支援に感謝します。