Оценка эффективности фотосинтеза у фотодыхающих мутантов методом флуоресцентного анализа хлорофилла

Описан подход к измерению изменений эффективности фотосинтеза у растений после обработки низким содержанием_СО2 с использованием флуоресценции хлорофилла.

Фотосинтез и фотодыхание представляют собой наибольшие потоки углерода в первичном метаболизме растений и необходимы для выживания растений. Многие из ферментов и генов, важных для фотосинтеза и фотодыхания, были хорошо изучены в течение десятилетий, но некоторые аспекты этих биохимических путей и их перекрестные помехи с несколькими субклеточными процессами еще не полностью поняты. Большая часть работы, которая идентифицировала гены и белки, важные для метаболизма растений, была проведена в строго контролируемых средах, которые могут не лучше всего представлять, как фотосинтез и фотодыхание функционируют в естественной и сельскохозяйственной среде. Учитывая, что абиотический стресс приводит к нарушению эффективности фотосинтеза, необходима разработка высокопроизводительного экрана, который может контролировать как абиотический стресс, так и его влияние на фотосинтез.

Поэтому мы разработали относительно быстрый метод скрининга абиотических стресс-индуцированных изменений эффективности фотосинтеза, который может идентифицировать нехарактеризованные гены с ролями в фотодыхании с использованием флуоресцентного анализа хлорофилла и скрининга с низким содержанием CO₂ . В данной работе описан метод изучения изменений эффективности фотосинтеза у нокаутирующих мутантов переносимой ДНК (Т-ДНК) у Arabidopsis thaliana. Этот же метод может быть использован для скрининга мутантов, индуцированных этилметансульфонатом (EMS), или скрининга супрессоров. Использование этого метода может идентифицировать гены-кандидаты для дальнейшего изучения первичного метаболизма растений и абиотических стрессовых реакций. Данные этого метода могут дать представление о функции генов, которая может быть не распознана до воздействия повышенной стрессовой среды.

Абиотические стрессовые условия, обычно наблюдаемые на фермерских полях, могут негативно повлиять на урожайность сельскохозяйственных культур, снижая эффективность фотосинтеза. Вредные условия окружающей среды, такие как тепловые волны, изменение климата, засуха и засоление почвы, могут вызывать абиотические стрессы, которые изменяют доступность CO₂ и уменьшают реакцию растения на высокий световой стресс. Двумя крупнейшими наземными потоками углерода являются фотосинтез и фотодыхание, которые необходимы для роста растений и урожайности сельскохозяйственных культур. Многие из важных белков и ферментов, участвующих в этих процессах, были охарактеризованы в лабораторных условиях и идентифицированы на генетическом уровне¹. Хотя был достигнут большой прогресс в понимании фотосинтеза и фотодыхания, многие этапы, включая транспорт между органеллами растений, остаются нехарактеризованными ^2,3.

Фотодыхание, второй по величине поток углерода в растениях после фотосинтеза, начинается, когда фермент Rubisco фиксирует кислород вместо углекислого газа к рибулозе 1,5 бисфосфату (RuBP), генерируя ингибирующее соединение 2-фосфогликолат (2PG)¹. Чтобы свести к минимуму ингибирующее действие 2PG и рециркулировать ранее фиксированный углерод, растения C3 развили мультиорганелларный процесс фотодыхания. Фотодыхание превращает две молекулы 2PG в одну молекулу 3-фосфоглицерата (3PGA), которая может повторно войти в цикл фиксации углерода C3¹. Таким образом, фотодыхание преобразует только 75% ранее зафиксированного углерода из генерации 2PG и потребляет АТФ в процессе. В результате процесс фотодыхания представляет собой значительное 10%-50% сопротивление процесса фотосинтеза в зависимости от наличия воды и температуры вегетационного периода⁴.

Ферменты, участвующие в фотодыхании, были областью исследований в течение десятилетий, но только небольшое количество транспортных белков было охарактеризовано на генетическом уровне, хотя в процессе ^5,6,7 участвует не менее 25 этапов транспорта. Двумя транспортными белками, которые непосредственно участвуют в движении углерода, образующегося в процессе фотодыхания, являются пластидный транспортер гликолята/глицерата PLGG1 и симпортер натрия желчной кислоты BASS6, оба из которых участвуют в экспорте гликолата из хлоропласта ^5,6.

В окружающей среде [CO₂] Рубиско фиксирует молекулу кислорода к RuBP примерно в 20%^{случаев 1}. Когда растения подвергаются воздействию низкого [CO₂], скорость фотодыхания увеличивается, что делает низкий [CO₂] идеальной средой для тестирования мутантов, которые могут быть важны при повышенном фотодыхании. Тестирование дополнительных предполагаемых линий Т-ДНК переноса хлоропластов при низком содержании CO₂ в течение 24 ч и измерение изменений флуоресценции хлорофилла привело к идентификации линий растений бас-6-1 , которые продемонстрировали фотодыхание мутантного фенотипа⁵. Дальнейшая характеристика показала, что BASS6 является транспортером гликолята во внутренней мембране хлоропласта.

В этой статье подробно описывается протокол, аналогичный тому, который первоначально использовался для идентификации BASS6 в качестве переносчика фотодыхания, который пришел из списка предполагаемых транспортных белков, расположенных внутри мембраны хлоропласта⁸ Этот протокол может быть использован в эксперименте с высокой пропускной способностью, характеризующем мутанты Т-ДНК Arabidopsis или мутантные растения, генерируемые EMS, как способ идентификации генов, важных для поддержания эффективности фотосинтеза при ряде абиотических стрессов, таких как тепло, высокий световой стресс, засуха и доступность CO₂ . Скрининг растительных мутантов с использованием флуоресценции хлорофилла использовался в прошлом для быстрой идентификации генов, важных для первичного метаболизма⁹. Поскольку до 30% генома Arabidopsis содержит гены, которые кодируют белки с неизвестной или плохо охарактеризованной функцией, стресс-индуцированный анализ эффективности фотосинтеза может дать представление о молекулярных функциях, не наблюдаемых в контролируемых условиях у мутантных растений¹⁰. Целью этого метода является идентификация мутантов фотодыхательного пути с использованием скрининга с низким содержанием CO₂ . Представлен метод идентификации мутантов, которые нарушают фотодыхание после воздействия низкого уровня CO₂. Преимуществом данного метода является то, что это высокопроизводительный скрининг рассады, который можно сделать за относительно короткий промежуток времени. Разделы видеопротокола содержат подробную информацию о подготовке и стерилизации семян, росте растений и обработке с низким содержанием_CO2 , конфигурации системы флуоресцентной визуализации, измерении квантового выхода обработанных образцов, репрезентативных результатах и выводах.

1. Подготовка и стерилизация семян

ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка семян состоит из впитывания семян и стерилизации семян. Важно отметить, что все эти этапы должны выполняться в ламинарной проточной вытяжке для поддержания стерильных условий. Все необходимые материалы, реагенты и питательные среды должны быть автоклавированы (см. Таблицу материалов).

1. Усвоение и стратификация семян
   ПРИМЕЧАНИЕ: Используются семенные линии plgg1-1 (salk_053463), abcb26 (salk_085232) и дикий тип (WT, Col-0).
   1. Распределите семена в микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 мл. Впитайте семена в стерильную воду в ламинарной проточной вытяжке и расслаивайте при 4 °C в темноте в течение 2 дней.
2. Стерилизация семян
   1. В стерильных условиях приготовьте 10 мл 50% (v/v) отбеливающего раствора и добавьте приблизительно 20 мкл Tween 20. Для стерилизации семян удалите воду из впитанных семян, добавьте 1 мл раствора отбеливателя в микроцентрифужные пробирки и инкубируйте при комнатной температуре в течение 5 мин.
   2. Удалите раствор отбеливателя пипеткой.
   3. Промыть семена в 1 мл стерильной воды для повторного суспендирования. Удалите воду, как только семена осядут на дно. Повторите шаги 1.6 и 1.7 семь раз.
   4. Повторно суспендировать семена в стерильном 0,1% растворе агарозы.
3. Покрытие семян
   1. Сделайте 1 л объема базальной среды Murashige & Skoog с витаминами и 1,0 г / л 2-(N-morphonio)этанесульфоновой кислоты (MS), добавив 5,43 г порошка в 500 мл дистиллированной воды. Отрегулируйте рН от 5,6 до 5,8 с помощью гидроксида калия (KOH). Залить до 1 л, используя дистиллированную воду.
      1. Разделите жидкий раствор на 500 мл и поместите каждую половину в колбу объемом 1 л, содержащую магнитный перемешивание. Добавьте 5 г порошка агара для получения 1% агара с раствором для каждой колбы.
      2. Автоклав при 121 °C и 15 psi в течение 30 мин; затем поместите при комнатной температуре, медленно помешивая. После охлаждения налейте 25 мл MS-агара в квадратную чашку Петри. Дайте ему затвердеть.
         ПРИМЕЧАНИЕ: Эти пластины Murashige & Skoog Basal Medium содержат 1% СРЕДЫ MS с витаминами и 1% агара для выращивания тестовых мутантов.
   2. Вырежьте наконечник пипетки объемом 200 мкл лезвием бритвы. Поместите одно семя в центр назначенной квадратной сетки для каждого испытуемого мутанта или генотипа (1 см² квадрата) квадратной пластины MS (рисунок 1) с использованием микропипетки объемом 200 мкл.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Квадратная сетка размером 1 см х 1 см помогает сохранить равномерное расстояние между саженцами и избежать перекрытия, что будет важно при последующей флуоресцентной визуализации и анализе.
   3. После того, как семена будут покрыты, оберните хирургической лентой вокруг крышки, чтобы запечатать, и поместите ее в камеру роста в условиях, описанных ниже.

2. Рост растений и обработка низким содержанием_CO2

1. Выращивайте растения в течение 7-9 дней при 20 °C при 8-часовом световом цикле 120 мкмоль·м⁻²с⁻¹ и 16 ч темноты при 18 °C. Проверьте растения на 6-й день, чтобы определить, достаточно ли они велики для визуализации. На 8-й день после покрытия подвергайте растения низкому уровню CO₂.
2. Обработка с низким_{содержанием CO2}
   1. Через 7-9 дней поместите четыре из восьми пластин из условий камеры роста окружающей среды в фотореспираторные условия 20 °C, непрерывные уровни освещенности 200 мкмоль·м⁻²с⁻¹ и низкий уровень CO₂ в течение 12 ч.
   2. Создайте условия с низким содержанием CO₂ , используя герметичный прозрачный контейнер со 100 г натриевой извести, помещенной в нижнюю часть контейнера. Поместите контейнер в ту же камеру роста, что и регулятор. Держите контрольные установки при температуре 120 мкмоль·^м−2с⁻¹ в окружающем_со-2 в течение 12 ч.

3. Настройка системы флуоресцентной визуализации

1. Поместите испытательную пластину (подготовленную в соответствии с разделами 1 и 2), центрированные под камерой на фиксированном расстоянии в системе флуоресцентной визуализации.
2. В программном обеспечении прибора перейдите в Окно Live Window и установите флажок Вспышки , чтобы включить неактинические измерительные вспышки.
3. Нажимайте на инструменты «Масштаб» и «Фокусировка», пока не появится полное и четкое изображение. Для этого используйте сцену или полку для регулировки расстояния между растениями и камерой. Сохраняйте масштаб, фокус и расстояние от камеры постоянными в течение всего эксперимента.
4. Установите значение El. Shutter равным 0 и отрегулируйте Чувствительность , чтобы получить флуоресцентный сигнал в диапазоне 200-500 цифровых единиц.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Более низкое значение затвора (0-1) гарантирует, что измерительные вспышки не будут актиническими, в то время как более высокое значение (2) улучшит разрешение изображения.
5. Поместите измеритель освещенности в то же положение, которое используется для настройки параметров камеры.
6. В окне Live Установите флажок Super , чтобы запустить насыщающий импульс продолжительностью 800 мс. Не забывайте каждый раз отмечать флажок для нового импульса.
7. Используйте ползунок для регулировки процента относительной мощности для суперимпульса до тех пор, пока измеритель освещенности не считывает 6000-8000 мкмоль·м⁻²с⁻¹.

4. Разработка программы квантового выхода

1. Импорт стандартных операционных инструментов для системы обработки изображений.
   Включить default.inc
   Включить light.inc
   ПРИМЕЧАНИЕ: Синтаксис программы, используемый для справки в этом эксперименте, предназначен для системы визуализации FluorCam.
2. Определите следующие глобальные переменные в соответствии с настроенными параметрами освещения:
   Затвор = 0
   Чувствительность = 40
   Супер = 65
3. Включите шаг времени для регистрации данных:
   TS = 20 мс
4. Соберите измерение Fo путем отбора проб флуоресценции в адаптированном к темноте состоянии.
   F0duration = 2s;
   F0период = 200 мс;
   ПРИМЕЧАНИЕ: F0duration определяет временной диапазон, в течение которого регистрируется флуоресценция, адаптированная к темноте. F0period определяет временной интервал, в течение которого повторяется измерение флуоресценции, адаптированное к темноте.
5. Запишите измерения Fo в таблицы данных.
   <0,F0период.. F0duration>=>mfmsub
   <0s>->чек-точка,"startFo"
   =>checkpoint,"endFo";
   Где < , > представляет собой набор значений флуоресценции, индексируемых временем; => хранит измерения в системном файле; mfmsub представляет весь набор данных для эксперимента; и контрольная точка создает подмножество для данных конкретных измерений, таких как startFo.
6. Соберите и сохраните измерение Fm путем отбора проб флуоресценции после насыщенного импульса.
   ПульсДуляция=960мс; ##
   a1=F0 + 40 мс
   a2 = a1 + 480 мс;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>чек-точка,"startFm"
   =>чековая точка,"endFm"
   =>чек-точка,"timeVisual";
   Где a1 и a2 являются переменными для координации времени отбора проб с насыщенным импульсом; a1 представляет собой время начала измерения Fm; а a2 представляет собой среднее время импульса.

5. Измерение квантового выхода обработанных образцов

1. Непосредственно после обработки накройте пластины алюминиевой фольгой на 15 мин для темной адаптации. Снимите фольгу для измерения квантового выхода фотосистемы II с помощью флуорометра, модифицированного амплитудой импульса. Затем поместите пластину рассады непосредственно под камеру и запустите протокол квантовой урожайности, найденный в репозитории GitHub.
2. Загрузите протокол quantum_yield с GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) или используйте программу аналогичной разработки из раздела 4. Используйте программное обеспечение флуорометра, чтобы открыть файл программы, щелкнув значок папки и перейдя к расположению файла.
3. Запустите программу квантового выхода, нажав на значок красной молнии.
4. После завершения протокола перейдите в окно предварительного анализа . Разделите пластину на отдельные саженцы с помощью инструментов выделения, чтобы выделить все пикселы для каждого саженца на изображении пластины. Щелкните Исключение фона , чтобы удалить все выделенные пикселы фона, оставив только область рассада.
5. Нажмите « Анализировать», чтобы сгенерировать данные флуоресценции для каждого саженца на изображении пластины. Вручную отрегулируйте диапазон значений флуоресценции для отображения последовательных минимальных и максимальных значений среди всех пластин.
6. Нажмите на Число-Среднее на вкладке Эксперимент | Экспорт | Числовой. Выберите Все данные и по столбцам и нажмите кнопку ОК , чтобы создать текстовый файл, содержащий измерения QY для каждого саженца.

6. Открытие файла данных

1. Откройте текстовый файл в электронной таблице для анализа. Из заголовков, показывающих номер области, размер пикселей, Fm, Ft, Fq и QY, определите номер области для основного генотипа (WT или тестовый мутант) и QYmax. Выполните парный t-тест относительно дикого типа, чтобы определить значимость. Данные интерпретируются как существенно отличающиеся, когда p-значения ниже 0,05.

Результаты показывают пластинчатые изображения необработанных и флуоресцентных изображений из окружающей среды и скрининга с низким содержанием_CO2 WT и тестовых мутантов. Каждое растение маркируется номером области, с соответствующими показаниями флуоресценции, указанными как QY. Данные экспортируются в виде текстового файла и могут быть открыты в электронной таблице для анализа (см. Дополнительную таблицу S1). Мутантные линии plgg1-1 и abcb26 были выбраны для демонстрации положительной и отрицательной идентификации генов, связанных с фотодыхательным стрессом. PLGG1 кодирует первый транспортер в пути, следующем за оксигенацией RuBP⁶, в то время как ABCB26, как полагают, кодирует транспортер антигена, который, как известно, не участвует в фотодыхании¹¹. Адаптированная к темноте эффективность Fv / Fm QY WT и мутантов визуализируется графиками коробки и усов. Для проверки статистической разницы между WT и тестовыми мутантами использовался попарный t-тест с p-значением < 0,05. Здесь мы использовали фотодыхательные мутантные линии с уменьшенным QY Fv / Fm в качестве тестовых мутантов для проверки эффективности метода скрининга. Результаты показывают, что тестируемые мутанты имеют значительно более низкую эффективность QY, чем WT. Рисунок 3B показывает значительное снижение отношения переменной к максимальной флуоресценции (Fv / Fm) для plgg1-1 , но не abcb26 при низком уровне CO₂. Этот результат согласуется с ролью PLGG1 как транспортера, участвующего в фотодыхании, в то время как abcb26 не демонстрирует фенотип, отличный от контроля WT в условиях низкого уровня CO₂ . Таким образом, этот метод скрининга может идентифицировать фотодыхающих мутантов с использованием скрининга с низким уровнем CO₂ .

Рисунок 1: Пример схемы макета семенной пластины. Показаны две технические реплики с шестью семенами, расположенными в ряд. Контрольные семена WT, размещенные над мутантными семенами. Аббревиатура: WT = дикий тип. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Адаптированные к темноте изображения F_v/F_m 9-дневных саженцев. Контроль дикого типа сравнивается с мутантными линиями Т-ДНК при окружающей среде и низком уровне CO₂. Цветовая шкала представляет собой среднее значение F_v/F_m каждого саженца. Шкала бара = 1 см. Сокращения: Fv/Fm = отношение переменной к максимальной флуоресценции; WT = дикий тип; plgg1-1 = транслокатор пластидального гликолата/глицерата 1; abcb26 = ATP-переплетная кассета B26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Флуоресцентные наблюдения. Измерения максимальной квантовой урожайности (Fv/Fm), выполненные на саженцах в условиях (A) окружающей среды и (B) низкого уровня CO₂. Квадраты представляют диапазон между внутренними квартилями, линии внутри квадратов представляют медианы, а усы представляют максимальные и минимальные наблюдения. * Указывает на существенную разницу, основанную на попарном t-испытании относительно WT (n > 44, p < 0,05; Дополнительная таблица S2). Сокращения: Fv/Fm = отношение переменной к максимальной флуоресценции; WT = дикий тип; plgg1-1 = транслокатор пластидального гликолата/глицерата 1; abcb26 = ATP-переплетная кассета B26. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Дополнительная таблица S1: Собранные флуоресцентные данные со всех пластин рассады, использованных в эксперименте. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Дополнительная таблица S2: Статистические данные представлены из t-теста между диким типом и обоими мутантными генотипами. Мутанты считаются значительно отличающимися от дикого типа, когда p-значение ниже 0,05. Таблица А представляет собой т-тесты_, проведенные на растениях, выращенных в окружающем со2, в то время как таблица В представляет собой т-тесты, проведенные на растениях, выращенных с низким содержанием_СО2. t-Test: две выборки, предполагающие равные дисперсии. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Экспериментальные методы, описанные в этой статье, имеют некоторые преимущества и ограничения. Одним из преимуществ является то, что этот метод может просеивать многие саженцы растений, хотя некоторые меры предосторожности должны быть приняты для предотвращения загрязнения пластины растительной среды во время процесса покрытия и выращивания. Поэтому крайне важно запечатать пластины Arabidopsis хирургической лентой. Еще одним преимуществом этого эксперимента является то, что он имеет более короткий 12-часовой период фотодыхательного напряжения по сравнению с ранее опубликованной работой⁸. Сокращение времени лечения должно было лучше различать различия в Fv / Fm между WT и выбранными мутантами. Время лечения может потребоваться варьировать в зависимости от тяжести фенотипа у мутантных штаммов и уровня CO₂ в экспериментальной установке. Одно из ограничений, однако, заключается в том, что этот метод требует площади листа, достаточно большой для измерения флуорометром и для расчета значений Fv/Fm. Корректировка начального времени роста испытуемых саженцев гарантирует, что флуорометрический тепловизор имеет достаточную площадь листьев для измерения для каждого саженца без перекрытия листьев во время визуализации. Саженцы должны быть изображены на первых настоящих листьях, чтобы сохранить размер листьев и углы листьев равномерными. Разрешение изображения может быть улучшено за счет увеличения выдержки и чувствительности камеры. Соседние пиксели будут лучше различаться; однако чрезмерное повышение чувствительности приведет к чрезмерному воздействию камеры и приведет к ложным максимумам флуоресценции. Оптимизация и устранение неполадок могут быть необходимы для балансировки значений разрешения и флуоресценции.

Важна возможность скрининга фотосинтетических мутантов в стандартизированной процедуре. Это может позволить последовательный, высокопроизводительный метод идентификации фотодыхающих мутантов с генами, представляющими интерес для фотосинтеза и метаболизма фотодыхания. В целом, скрининг на Fv / Fm в этом анализе занимает примерно 30 с на тарелку саженцев растений, что позволяет отсеивать более 1000 саженцев в день. Флуоресцентный анализ хлорофилла позволяет идентифицировать фотодыхающих мутантов с использованием скрининга с низким содержанием CO₂ , что важно для поддержания эффективности фотореспираторов. Учитывая большое количество неизвестных транспортеров, которые, как предполагается, находятся в пути фотодыхания³, этот метод может быть использован для быстрой оценки влияния генотипа на эффективность фотосинтеза. Кроме того, флуорометры могут измерять другие аспекты эффективности фотосинтеза, такие как нефотохимическая закалка и эффективность работы фотосистемы II. Эти дополнительные протоколы занимают больше времени на тарелку рассады, но могут быть использованы для дальнейшего и более чувствительного анализа, в отличие от этого быстрого высокопроизводительного скрининга мутантов. Этот метод не ограничивается Арабидопсисом, а также может быть скорректирован для скрининга мутантов Т-ДНК в ряде других абиотических стрессовых состояний, таких как высокие и низкие температуры, стресс при высоком освещении и условия засухи, для выявления генов, важных для фотосинтеза и фотодыхания. Любые дополнительные изменения необходимо будет оптимизировать на индивидуальной основе.

Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов или конфликта интересов.

Это исследование финансировалось Советом регентов Луизианы (AWD-AM210544).