クロロフィル蛍光解析による光呼吸変異体の光合成効率評価

クロロフィル蛍光を用いて低_CO2 処理後の植物の光合成効率の変化を測定する手法について述べる。

光合成と光呼吸は、植物の一次代謝における最大の炭素フラックスを表し、植物の生存に必要です。光合成と光呼吸に重要な酵素と遺伝子の多くは、何十年にもわたってよく研究されてきましたが、これらの生化学的経路のいくつかの側面といくつかの細胞内プロセスとのクロストークはまだ完全には理解されていません。植物の代謝に重要な遺伝子とタンパク質を特定した研究の多くは、高度に制御された環境下で行われており、自然環境や農業環境下で光合成と光呼吸がどのように機能するかを最もよく表していない可能性があります。非生物的ストレスが光合成効率を阻害することを考慮すると、非生物的ストレスとその光合成への影響の両方をモニタリングできるハイスループットスクリーンの開発が必要である。

そこで、クロロフィル蛍光解析と低_CO2 スクリーニングを用いて、光呼吸に関与する特徴のない遺伝子を同定できる、非生物的ストレスによる光合成効率の変化を比較的迅速にスクリーニングする方法を開発しました。本論文では、 シロイヌナズナの転写DNA(T-DNA)ノックアウト変異体の光合成効率の変化を調べる方法について説明します。同じ方法を、エチルメタンスルホン酸(EMS)誘発変異体のスクリーニングまたはサプレッサースクリーニングに使用することができる。この方法を利用することで、植物の一次代謝と非生物的ストレス応答のさらなる研究のための遺伝子候補を特定することができます。この方法からのデータは、増加したストレス環境にさらされるまで認識されない可能性のある遺伝子機能への洞察を提供することができます。

農家の畑で一般的に見られる非生物的ストレス条件は、光合成効率を低下させることにより、作物収量に悪影響を与える可能性があります。熱波、気候変動、干ばつ、土壌塩分などの有害な環境条件は、CO₂の利用可能性を変化させ、高い光ストレスに対する植物の反応を低下させる非生物的ストレスを引き起こす可能性があります。2つの最大の陸生炭素フラックスは、植物の成長と作物収量に不可欠な光合成と光呼吸です。これらのプロセスに関与する重要なタンパク質および酵素の多くは、実験室条件下で特性評価され、遺伝子レベルで同定されています¹。光合成と光呼吸の理解には多くの進歩が見られましたが、植物小器官間の輸送を含む多くのステップは特徴付けられていません^2,3。

光合成に次いで植物で2番目に大きい炭素フラックスである光呼吸は、酵素Rubiscoが二酸化炭素の代わりに酸素をリブロース1,5ビスリン酸(RuBP)に固定し、阻害化合物2-ホスホグリコール酸(2PG)¹を生成するときに始まります。2PGの阻害効果を最小限に抑え、以前に固定された炭素をリサイクルするために、C3植物は光呼吸の多器官プロセスを進化させました。光呼吸は、2分子の2PGを1分子の3-ホスホグリセリン酸(3PGA)に変換し、C3炭素固定サイクル¹に再入することができます。したがって、光呼吸は、2PGの生成から以前に固定された炭素の75%のみを変換し、その過程でATPを消費します。その結果、光呼吸のプロセスは、水の利用可能性と成長期の気温に応じて、光合成プロセスに10%〜50%の大幅な抗力をもたらします⁴。

光呼吸に関与する酵素は何十年にもわたって研究の焦点となってきましたが、少なくとも25の輸送ステップがプロセスに関与しているにもかかわらず、遺伝子レベルで特徴付けられている輸送タンパク質はごくわずかです^5,6,7。光呼吸過程で発生する炭素の移動に直接関与する2つの輸送タンパク質は、プラスチジン酸/グリセリン酸トランスポーターPLGG1と胆汁酸ナトリウムシンポーターBASS6であり、どちらも葉緑体^5,6からのグリコール酸の輸出に関与しています。

周囲[_CO2]の下で、Rubiscoは酸素分子を約20%の確率でRuBPに固定します¹。植物が低[CO2]にさらされると、光呼吸速度が増加するため、低[_CO2]は、高い光呼吸ストレス下で重要になる可能性のある突然変異体を試験するのに理想的な環境になります。追加の推定葉緑体輸送タンパク質T-DNA株を低_CO2下で24時間テストし、クロロフィル蛍光の変化を測定することで、光呼吸変異表現型⁵を示すbass6-1植物株が同定されました。さらなる特性評価により、BASS6が葉緑体の内膜にあるグリコール酸トランスポーターであることが実証されました。

この論文は、葉緑体膜内に位置する推定輸送タンパク質のリストから来た、光呼吸トランスポーターとしてBASS6を同定するために最初に使用されたものと同様のプロトコルを詳細に説明^{しています8} このプロトコルは、熱などの非生物的ストレスの範囲下で光合成効率を維持するために重要な遺伝子を同定する方法として、シロイヌナズナT-DNA変異体またはEMS生成変異植物を特徴付けるハイスループット実験に使用することができる。 高い光ストレス、干ばつ、およびCO₂ の可用性。クロロフィル蛍光を用いた植物変異体のスクリーニングは、一次代謝に重要な遺伝子を迅速に同定するために過去に使用されてきました⁹。シロイヌナズナのゲノムの30%にも、機能が不明または特性が不十分なタンパク質をコードする遺伝子が含まれているため、ストレス誘発による光合成効率の解析は、変異植物の制御条件下では観察されない分子機能に関する洞察を提供する可能性があります¹⁰。この方法の目的は、低_CO2 スクリーニングを用いて光呼吸経路の変異体を同定することである。我々は、低_CO2への曝露後に光呼吸を妨害する変異体を特定する方法を提示する。この方法の利点は、比較的短時間で行うことができる苗のハイスループットスクリーニングであるということです。ビデオプロトコルセクションは、種子の調製と滅菌、植物の成長と低_CO2 処理、蛍光イメージングシステムの構成、処理されたサンプルの量子収率の測定、代表的な結果、および結論に関する詳細を提供します。

1.種子の準備と滅菌

注:種子の準備は、種子の吸収と種子の滅菌で構成されます。これらのステップはすべて、無菌状態を維持するために層流フード内で実行されることに注意することが重要です。必要なすべての材料、試薬、および成長培地はオートクレーブ滅菌する必要があります(材料の表を参照)。

1. 種子の吸収と層別化
   注:使用されるシードラインは、 plgg1-1 (salk_053463)、 abcb26 (salk_085232)、および野生型(WT、Col-0)です。
   1. 種子を1.5 mLの微量遠心チューブに分注します。種子を層流フード内の滅菌水に吸収し、暗所で4°Cで2日間成層します。
2. 種子殺菌
   1. 無菌条件下で、10 mLの50%(v / v)漂白剤溶液を調製し、約20 μLのTween 20を追加します。種子滅菌のために、吸収された種子から水を取り除き、1 mLの漂白剤溶液を微量遠心管に加え、室温で5分間インキュベートします。
   2. ピペットで漂白剤溶液を取り除きます。
   3. 種子を1 mLの滅菌水ですすぎ、再懸濁します。種子が底に落ち着いたら水を取り除きます。手順 1.6 と手順 1.7 を 7 回繰り返します。
   4. 種子を滅菌0.1%アガロース溶液に再懸濁します。
3. シードメッキ
   1. 5.43 gの粉末を500 mLの蒸留水に加え、ビタミンと1.0 g/Lの2-(N-モルフォニオ)エタンスルホン酸(MS)を含む1 L容量のMurashige & Skoog基礎培地を作ります。水酸化カリウム(KOH)を使用してpHを5.6〜5.8に調整します。蒸留水を使用して1 Lまで充填します。
      1. 溶液を500 mLに分割し、各半分を磁気攪拌子を含む1 Lフラスコに入れます。寒天粉末5gを加えて、各フラスコに1%寒天w/v溶液を得た。
      2. オートクレーブを121°C、15psiで30分間;その後、ゆっくりと攪拌しながら室温に置く。冷却したら、25 mLのMS寒天を正方形のペトリ皿に注ぎます。固まるのを待ちます。
         注:これらのMurashige & Skoog Basal Mediumプレートには、ビタミンを含む1%MS培地と、試験変異体の培養用の1%寒天が含まれています。
   2. 200 μLのピペットチップをかみそりの刃で切ります。200 μLマイクロピペットを使用して、正方形のMSプレート(図1)の各試験変異体または遺伝子型(1 cm²の正方形)について、指定された正方形のグリッドの中央に1つのシードを置きます。
      注:1 cm x 1 cmの正方形のグリッドは、苗間の距離を均一に保ち、重なりを避けるのに役立ち、これは後の蛍光イメージングと分析で重要になります。
   3. 種子が播種されたら、蓋にサージカルテープで包んで密封し、以下に説明するような条件で成長室に置きます。

2.植物の成長と低CO₂ 処理

1. 120 μmol·m⁻²s⁻¹ の8時間の光サイクルと18°Cで16時間の暗闇の下で、20°Cで7〜9日間植物を育てます。 6日目に植物をチェックして、イメージングに十分な大きさかどうかを判断します。メッキ後8日目に、植物を低CO₂にさらします。
2. 低_CO2 処理
   1. 7〜9日後、8枚のプレートのうち4枚を周囲成長チャンバー条件から20°Cの光呼吸条件、200μmol・m−^2s−1の連続光レベル、および低CO2に₁₂時間配置します。
   2. 容器の底に100gのソーダライムを置いた気密透明容器を使用して、低_CO2状態を構築します。コントロールと同じ成長チャンバー内に容器を置きます。対照植物を周囲CO₂で120μmol·m−2 s⁻¹未満に¹²時間維持する。

3. 蛍光イメージングシステムの構成

1. 蛍光イメージングシステムのカメラの下に一定の距離を置いてテストプレート(セクション1およびセクション2に従って準備)を配置します。
2. 機器のソフトウェア内で、 ライブウィンドウ に移動し、フラッシュチェックボックスをオンにして、非活性 測定フラッシュをオンにします 。
3. ズームツールとフォーカスツールをクリックして、完全で鮮明な画像を表示します。この目的のために、ステージまたは棚を使用して、植物とカメラの間の距離を調整します。ズーム、フォーカス、カメラからの距離は、実験全体を通して一定に保ちます。
4. El.シャッターの値を0に設定し、感度を調整して、200〜500デジタル単位の範囲の蛍光信号を取得します。
   注意: El.シャッター値を低くすると(0-1)、測定フラッシュが非活性であることが保証され、高い値(2)は画像の解像度が向上します。
5. カメラの設定を調整するのと同じ位置に露出計を置きます。
6. ライブウィンドウで、スーパーチェックボックスをオンにして、800ミリ秒続く飽和パルスを開始します。新しいパルスのたびにチェックボックスをオンにすることを忘れないでください。
7. スライダーを使用して、露出計が6,000〜8,000μmol・m−²s⁻¹を読み取るまで、スーパーパルスの相対電力のパーセンテージを調整します。

4. 量子収率プログラムを設計する

1. イメージングシステムの標準操作ツールをインポートします。
   デフォルトを含める
   ライトインクルード ライト.inc
   注:この実験で参照に使用されているプログラム構文は、FluorCamイメージングシステム用です。
2. 設定されたライト設定に従って、次のグローバル変数を定義します。
   シャッター = 0
   感度 = 40
   スーパー = 65
3. データをログに記録するための時間ステップを含めます。
   TS = 20ms
4. 暗順応状態で蛍光をサンプリングすることにより、Fo測定値を収集します。
   F0デュレーション= 2秒;
   F0周期 = 200ms;
   注: F0duration は、暗順応蛍光が記録される時間範囲を定義します。 F0period は、暗順応蛍光測定が繰り返される時間間隔を定義します。
5. Fo測定値をデータテーブルに記録します。
   <0,F0period..F0duration>=>mfmsub
   <0s>->チェックポイント,"startFo"
   =>チェックポイント,"endFo";
   ここで 、<、> は時間でインデックス付けされた蛍光値のセットを表します。=>は測定値をシステムファイルに保存します。 mfmsub は、実験のデータセット全体を表します。 チェックポイント は、 startFoなどの特定の測定値のデータのサブセットを作成します。
6. 飽和パルス後の蛍光をサンプリングすることにより、Fm測定値を収集して保存します。
   パルス持続時間=960ms;##
   a1=F0期間 + 40ms
   a2 = a1 + 480ms;
   =>SatPulse(PulseDuration);
   =>mfmsub
   =>mfmsub;
   =>チェックポイント,"startFm"
   =>チェックポイント,"endFm"
   =>チェックポイント,"timeVisual";
   ここで、 a1 と a2 は、サンプリング時間を飽和パルスと調整するための変数です。 a1 はFm測定の開始時間を表します。 a2 はパルスの中間点時間を表します。

5.処理されたサンプルの量子収率の測定

1. 治療の直後に、暗順応のためにプレートをアルミホイルで15分間覆います。箔を取り除き、パルス振幅修飾蛍光光度計で光化学系IIの量子収率を測定した。次に、苗プレートをカメラの真下に置き、GitHub リポジトリにある量子収量プロトコルを実行します。
2. GitHub (https://github.com/South-lab/fluorescent-screen) から quantum_yield プロトコルをダウンロードするか、セクション 4 の同様の設計のプログラムを使用します。蛍光光度計のソフトウェアを使用して、フォルダアイコンをクリックしてファイルの場所に移動し、プログラムファイルを開きます。
3. 赤い稲妻アイコンをクリックして、量子収率プログラムを実行します。
4. プロトコルが完了したら、 事前分析 ウィンドウに移動します。 選択ツールを使用して プレートを個々の苗に分割し、プレート画像上の各苗のすべてのピクセルを強調表示します。[ 背景の除外] をクリックして、強調表示された背景ピクセルを削除し、苗領域だけを残します。
5. [分析]をクリックして、プレート画像上の各苗の蛍光データを生成します。蛍光値の範囲を手動で調整して、すべてのプレート間で一貫した最小値と最大値を表示します。
6. [実験|]タブから 数値平均 をクリックします エクスポート|数値。[ すべてのデータ と 列別 ] を選択し、[ OK ] をクリックして、各苗の QY 測定値を含むテキスト ファイルを生成します。

6. データファイルを開く

1. 分析のためにスプレッドシートでテキスト ファイルを開きます。エリア番号、ピクセルのサイズ、Fm、Ft、Fq、およびQYを示す見出しのうち、コア遺伝子型(WTまたはテスト変異体)およびQYmaxのエリア番号を特定します。有意性を判断するために、野生型に関してペアワイズ t検定を実行します。p値が0.05未満の場合、データは有意に異なると解釈されます。

結果は、WTおよび試験変異体の周囲および低_CO2スクリーニングからの生および蛍光画像のプレート画像を示す。各植物にはエリア番号で標識され、対応する蛍光測定値はQYとして与えられます。データはテキストファイルとしてエクスポートされ、分析のためにスプレッドシートで開くことができます(補足表S1を参照)。変異株plgg1-1およびabcb26は、光呼吸ストレスに関連する遺伝子の陽性および陰性の同定を実証するために選択された。PLGG1はRuBP⁶の酸素化に続く経路の最初のトランスポーターをコードするが、ABCB26は光呼吸に関与することが知られていない抗原トランスポーターをコードすると考えられている¹¹。WTおよび変異体の暗順応Fv/Fm QY効率は、箱ひげ図およびウィスカープロットによって視覚化されます。WT変異体と試験変異体との間の統計的差を検定するために、p値が0.05<ペアワイズt検定を使用した。ここでは、QY Fv/Fmが低下した光呼吸変異株を試験変異株として使用し、スクリーニング方法の効率を確認しました。結果は、試験変異体がWTよりも有意に低いQY効率を有することを示している。 図3Bは、plgg1-1では可変蛍光対最大蛍光(Fv/Fm)の比の有意な減少を示すが、低_CO2ではabcb26では有意に減少しない。この結果は、光呼吸に関与するトランスポーターとしてのPLGG1の役割と一致するが、abcb26は低_CO2条件下でのWT対照とは異なる表現型を示さない。したがって、このスクリーニング方法は、低_CO2スクリーニングを用いて光呼吸変異体を同定することができる。

図1:シードプレートレイアウトの概略図の例。2つのテクニカルレプリケートが6つのシードを連続して配置して示されています。WTコントロール種子を変異種子の上に置いた。略語:WT =野生型。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図2:9日齢の苗の暗順応F_v / F_m 画像。 野生型対照を、周囲および低_CO2におけるT−DNA変異株と比較する。カラースケールは、各苗の平均F_v / F_m を表します。スケールバー= 1 cm。 略語:Fv / Fm =可変蛍光と最大蛍光の比率。WT =野生型; plgg1-1 = 色素体グリコレート/グリセレートトランスロケーター1; abcb26 = ATP結合カセットB26。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

図3:蛍光観察。 (A)周囲および(B)低CO₂ 条件での苗の最大量子収率(Fv / Fm)測定。ボックスは内側の四分位数間の範囲を表し、ボックス内の線は中央値を表し、ひげは最大観測値と最小観測値を表します。*は、WTに対するペアワイズ t検定に基づく有意差を示します(n > 44、p < 0.05; 別表S2)。略語:Fv / Fm =最大蛍光に対する可変蛍光の比率。WT =野生型; plgg1-1 = 色素体グリコレート/グリセレートトランスロケーター1; abcb26 = ATP結合カセットB26。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。

補足表S1:実験に用いた全苗板から蛍光データをまとめた。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

補足表S2:統計は、野生型と両方の変異遺伝子型との間のt検定から報告される。変異体は、p値が0.05より低い場合、野生型とは有意に異なると見なされます。表Aは、周囲CO2で生育した植物に対して実施されるt検定を表し、一方、表Bは、低_CO2で生育した植物に対して実施されるt検定を表す。t検定:等分散を仮定した2標本。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。

このホワイトペーパーで概説されている実験方法には、いくつかの利点と制限があります。1つの利点は、この方法が多くの植物苗をスクリーニングできることですが、メッキおよび成長プロセス中の植物培地プレートの汚染を防ぐためにいくつかの予防措置を講じる必要があります。したがって、シロイヌナズナプレートをサージカルテープで密封することが重要です。この実験の別の利点は、以前に発表された研究⁸と比較して12時間の光呼吸ストレス期間が短いことです。治療時間の短縮は、WTと選択された変異体との間のFv/Fmの違いをよりよく区別することであった。治療時間は、変異株における表現型の重症度および実験セットアップにおける_CO2 のレベルに応じて変える必要があるかもしれない。ただし、この方法では、蛍光光度計が測定し、Fv / Fm値を計算するのに十分な大きさの葉面積が必要であるという制限があります。テストされた苗の初期成長時間を調整することで、蛍光光度計イメージャーが、イメージング中に葉が重なることなく、各苗を測定するのに十分な葉の面積を確保できます。葉のサイズと葉の角度を均一に保つために、苗は最初の本物の葉で画像化する必要があります。カメラのシャッタースピードと感度を上げることで、画像の解像度が向上する場合があります。隣接するピクセルがよりよく区別されます。ただし、感度を上げすぎると、カメラの露出オーバーになり、蛍光の最大値が偽になります。分解能と蛍光値のバランスをとるために、最適化とトラブルシューティングが必要になる場合があります。

標準化された手順で光合成変異体をスクリーニングする能力は重要です。これにより、光合成および光呼吸代謝に関心のある遺伝子を持つ光呼吸変異体を同定するための一貫したハイスループット法が可能になります。全体として、この分析におけるFv/Fmのスクリーニングは、植物苗のプレートあたり約30秒かかり、1日あたり1,000本以上の苗のスクリーニングを可能にします。クロロフィル蛍光分析は、光呼吸効率を維持するために重要な低_CO2 スクリーニングを用いた光呼吸変異体の同定を可能にする。光呼吸経路³に存在すると理論化された未知のトランスポーターが多数あることを考えると、この方法は、遺伝子型が光合成効率に及ぼす影響を迅速に評価するために使用できます。さらに、蛍光光度計は、非光化学消光や光化学系IIの動作効率など、光合成効率の他の側面を測定できます。これらの追加のプロトコルは、苗プレートごとに時間がかかりますが、変異体のこの迅速なハイスループットスクリーニングとは対照的に、さらに感度の高い分析に使用できます。この方法はシロイヌナズナに限らず、高温・低温、高光ストレス、乾燥条件など、さまざまな非生物的ストレス条件のT-DNA変異体をスクリーニングするように調整して、光合成や光呼吸に重要な遺伝子を特定することもできます。追加の変更は、個別に最適化する必要があります。

著者には、競合する金銭的利益や利益相反はありません。

この研究は、ルイジアナ州理事会(AWD-AM210544)から資金提供を受けました。