Стандартизированный конвейер для изучения морфометрии серого вещества мозжечка человека с использованием структурной магнитно-резонансной томографии

Представлен стандартизированный конвейер для изучения морфометрии серого вещества мозжечка. Трубопровод сочетает в себе современные подходы с высоким разрешением для оптимизированной и автоматизированной парцелляции мозжечка и регистрации мозжечка на основе вокселя для объемной количественной оценки.

Многочисленные направления исследований предоставляют убедительные доказательства роли мозжечка в широком спектре когнитивных и аффективных функций, выходя далеко за рамки его исторической ассоциации с двигательным контролем. Структурные и функциональные исследования нейровизуализации позволили дополнительно усовершенствовать понимание функциональной нейроанатомии мозжечка за пределами его анатомических отделов, подчеркнув необходимость обследования отдельных мозжечковых субъединиц при здоровой изменчивости и неврологических заболеваниях. В этой статье представлен стандартизированный конвейер для изучения морфометрии серого вещества мозжечка, который сочетает в себе современные подходы с высоким разрешением для оптимизированной и автоматизированной парцелляции мозжечка (Автоматическая анатомическая парцелляция мозжечка с использованием U-Net Locally Constrained Optimization; ACAPULCO) и регистрацию мозжечка на основе вокселя (пространственно непредвзятый инфратенториальный шаблон; SUIT) для объемной количественной оценки.

Трубопровод имеет широкое применение к целому ряду неврологических заболеваний и полностью автоматизирован, при этом ручное вмешательство требуется только для контроля качества выходов. Конвейер находится в свободном доступе с существенной сопроводительной документацией и может быть запущен на операционных системах Mac, Windows и Linux. Конвейер применяется в когорте лиц с атаксией Фридрейха (FRDA), и представлены репрезентативные результаты, а также рекомендации по групповому выводному статистическому анализу. Этот конвейер может способствовать надежности и воспроизводимости во всем поле, в конечном итоге обеспечивая мощный методологический подход к характеристике и отслеживанию структурных изменений мозжечка при неврологических заболеваниях.

Мозжечок является частью мозга, исторически связанной с^{двигательным} контролем ^1,2,3 и, как полагают, интегрально участвует только в небольшом наборе редких заболеваний, таких как наследственные атаксии 4. Тем не менее, сходящиеся линии исследований анатомического отслеживания у нечеловеческих приматов, а также исследования поражений человека и нейровизуализации предоставляют убедительные доказательства роли мозжечка в широком спектре когнитивных ^5,6,7, аффективных ^8,9,10,11 и других немоторных функций ^7,12 (см.^6).  для ознакомления). Кроме того, аномалии мозжечка все чаще участвуют в широком спектре неврологических и психических расстройств, включая болезнь Паркинсона¹³, болезнь Альцгеймера^14,15, эпилепсию^16,17, шизофрению¹⁸ и расстройство аутистического спектра¹⁹ . Поэтому стало необходимым включить мозжечок в функциональные и структурные модели заболеваний головного мозга человека и нормативной поведенческой изменчивости.

Анатомически мозжечок может быть разделен вдоль его верхней до нижней оси на три доли: переднюю, заднюю и флоккулородулярную. Доли далее подразделяются на 10 долек, обозначаемых римскими цифрами I-X^20,21 (рисунок 1). Мозжечок также может быть сгруппирован в среднюю линию (vermis) и латеральную (полушарие) зоны, которые соответственно получают входные данные от спинного мозга и коры головного мозга. Передняя доля, состоящая из долек I-V, традиционно ассоциируется с двигательными процессами и имеет обратные связи с моторной корой^{головного мозга 22}. Задняя доля, включающая дольки VI-IX, в первую очередь связана с немоторными процессами¹¹ и имеет реципрокные связи с префронтальной корой, задней теменной и верхней височной корой головного мозга ^8,23. Наконец, флоккулонодулярная доля, содержащая дольку X, имеет взаимные связи с вестибулярными ядрами, которые управляют движениями глаз и равновесием тела во время стояния и походки²¹.

Растущее количество недавних работ с использованием функциональной нейровизуализации еще больше улучшило понимание функциональной нейроанатомии мозжечка за пределами его анатомических отделов. Например, методы функциональной магнитно-резонансной томографии (фМРТ) в состоянии покоя были использованы для картирования структуры функциональных взаимодействий между мозжечком и мозжечком²⁴. Кроме того, используя подход парцелляции на основе задач, Кинг и его коллеги⁷ продемонстрировали, что мозжечок демонстрирует богатую и сложную структуру функциональной специализации по всей своей широте, о чем свидетельствуют четкие функциональные границы, связанные с различными двигательными, аффективными, социальными и когнитивными задачами. В совокупности эти исследования подчеркивают важность изучения отдельных подъединиц мозжечка для разработки полных биологических характеристик участия мозжечка как в здоровой изменчивости, так и в неврологических заболеваниях, характеризующихся изменениями в структуре и / или функции мозжечка.

Настоящая работа посвящена методам количественной оценки локальных изменений объема мозжечка с использованием структурной МРТ у людей. В целом, существует два фундаментальных подхода к количественной оценке регионального объема мозга с использованием данных МРТ: сегментация на основе признаков и регистрация на основе воксела. В подходах к сегментации на основе признаков используются анатомические ориентиры и стандартизированные атласы для автоматического определения границ между субрегионами. Основные программные пакеты для сегментации включают FreeSurfer²⁵, BrainSuite²⁶ и FSL-FIRST²⁷. Однако эти пакеты обеспечивают только грубую парцелляцию мозжечка (например, маркировку всего серого вещества и всего белого вещества в каждом полушарии), таким образом, упуская из виду отдельные мозжечковые дольки. Эти подходы также склонны к неправильной сегментации, особенно к чрезмерному включению окружающей сосудистой системы.

Были разработаны новые алгоритмы машинного обучения и маркировки нескольких атласов, которые обеспечивают более точную и тонкую парцелляцию мозжечка, включая алгоритм автоматической классификации мозжечковых долек с использованием неявной межграничной эволюции (ACCLAIM ^28,29), инструментарий анализа мозжечка (CATK³⁰), несколько автоматически генерируемых шаблонов (MAGeT³¹), быструю автоматическую сегментацию мозжечка человека и его долек (RASCAL^32). ), сегментация^{графов 33} и сегментация мозжечка (CERES³⁴). В недавней статье, сравнивающей современные полностью автоматизированные подходы к парцелляции мозжечка, было обнаружено, что CERES2 превосходит другие подходы по сравнению с ручной сегментацией мозжечковых долек³⁵ по золотому стандарту. Совсем недавно Хан и его коллеги³⁶ разработали алгоритм глубокого обучения под названием ACAPULCO (Automatic Cerebellum Anatomical Parcellation using U-Net с локально ограниченной оптимизацией), который работает наравне с CERES2, имеет широкую применимость как к здоровым, так и к атрофированным мозжечкам, доступен в формате контейнера Docker и Singularity с открытым исходным кодом для реализации «готовой» реализации и более эффективен по времени, чем другие подходы. ACAPULCO автоматически разделяет мозжечок на 28 анатомических областей.

В отличие от сегментации на основе признаков, подходы к регистрации на основе воксела работают путем точного сопоставления МРТ с шаблонным изображением. Чтобы достичь этого отображения, воксели в исходном изображении должны быть искажены по размеру и форме. Величина этого искажения эффективно обеспечивает измерение объема на каждом вокселе относительно шаблона золотого стандарта. Эта форма объемной оценки известна как «морфометрия на основе вокселя»³⁷. Подходы к регистрации на основе воксела всего мозга, такие как FSL-FLIRT³⁸ / FNIRT³⁹, унифицированная сегментация^{SPM 40} и CAT12⁴¹, обычно используются для морфометрии на основе воксела. Однако эти подходы плохо учитывают мозжечок, что приводит к низкой надежности и валидности в инфратенториальных областях (мозжечок, ствол мозга⁴²). Чтобы учесть эти ограничения, был разработан алгоритм SUIT (Spatially Unbiased Infra-tentorial Template) для оптимизации регистрации мозжечка и повышения точности морфометрии на основе вокселя^42,43.

Сегментация на основе признаков и подходы к регистрации на основе воксела для оценки регионального объема мозжечка имеют фундаментальные сильные и слабые стороны. Подходы сегментации существенно более точны для количественной оценки объема анатомически определенных областей (например, дольков³⁵). Однако границы между различными функциональными модулями мозжечка не соотносятся с его анатомическими фолиями и трещинами (эквивалентными извилинам и бороздам головного мозга⁷). Поскольку подходы, основанные на регистрации, не ограничены анатомическими ориентирами, возможен более мелкозернистый пространственный вывод и высокомерное структурно-функциональное отображение мозжечка⁴⁴. Взятые вместе, подходы сегментации и регистрации дополняют друг друга и могут использоваться для ответа на различные исследовательские вопросы.

Здесь представлен новый стандартизированный конвейер, который объединяет эти существующие, проверенные подходы для обеспечения оптимизированной и автоматизированной парцелляции (ACAPULCO) и регистрации мозжечка (SUIT) на основе вокселя для объемной количественной оценки (рисунок 2). Конвейер основывается на установленных подходах, включающих протоколы контроля качества, используя качественную визуализацию и количественное обнаружение выбросов, а также быстрый метод получения оценки внутричерепного объема (ICV) с использованием Freesurfer. Конвейер полностью автоматизирован, с ручным вмешательством, необходимым только для проверки выходных данных контроля качества, и может быть запущен на операционных системах Mac, Windows и Linux. Трубопровод находится в свободном доступе без ограничений на его использование в некоммерческих целях и может быть доступен с веб-страницы ENIGMA Consortium Imaging Protocols (в разделе «ENIGMA Cerebellum Volumetrics Pipeline») после заполнения краткой регистрационной формы⁴⁵.

Все необходимое программное обеспечение перечислено в таблице материалов, а подробные учебные пособия, включая живую демонстрацию, доступны при загрузке конвейера в дополнение к протоколу, описанному ниже. Наконец, представлены репрезентативные результаты, полученные в результате внедрения конвейера в когорте людей с атаксией Фридрейха (FRDA) и соответствующими возрасту и полу здоровыми контрольными группами, наряду с рекомендациями по статистическому выводному анализу на уровне групп.

ПРИМЕЧАНИЕ: Данные, использованные в этом исследовании, были частью проекта, одобренного Комитетом по этике исследований человека Университета Монаша (проект 7810). Участники предоставили письменное информированное согласие. Хотя конвейер может быть запущен на операционных системах Mac, Windows или Linux, конвейеры ACAPULCO, SUIT и QC были явно протестированы на операционных системах Linux (Ubuntu) и Mac (Catalina, Big Sur v11.0.1).

1. Модуль 1: ACAPULCO (анатомическая парцелляция)

1. Сбор данных
   1. Соберите 3D T1-взвешенные МРТ-изображения всего мозга с разрешением 1^мм3 или менее. Рекомендуются размеры изотропного вокселя (обычно 1 мм x 1 мм x 1 мм) и сканера 3-Telsa (или выше). Проконсультируйтесь со специалистом по визуализации в их рентгенографическом центре, чтобы настроить и получить данные, которые соответствуют этим спецификациям.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Т2-взвешенные изображения иногда полезны для объемного анализа; однако конвейер, представленный здесь, опирается только на данные, взвешенные по T1, и некоторые из используемых инструментов являются эксклюзивными для этого типа данных. Таким образом, изображения, взвешенные по T2, не могут быть использованы.
   2. Проведите визуальную оценку качества изображений, чтобы исключить грубые пороки развития мозжечка (например, большие поражения) или существенные артефакты движения, которые препятствуют идентификации основных мозжечковых ориентиров (например, основных анатомических трещин). Не следует автоматически исключать атрофированную мозжечную желчь, даже если она существенная.
   3. Для групповых исследований также рассмотрите количественные оценки качества с использованием свободно доступных стандартизированных инструментов, таких как MRIQC⁴⁶, для дальнейшего выявления проблемных данных.
   4. Конвертируйте все данные в формат NIFTI-GZ с помощью такого инструмента, как dcm2niix⁴⁷.
2. Рекомендуемая организация данных
   1. Получите все необходимое программное обеспечение, указанное в Таблице материалов. Убедитесь, что Docker⁴⁸ или Singularity⁴⁹, Matlab⁵⁰ и^{SPM12 51} установлены перед запуском конвейера.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Также доступны обширные письменные и видеоуроки, описывающие конвейер (см. Таблицу материалов).
   2. После установки всего необходимого программного обеспечения создайте папки в рабочем каталоге и пометьте их «acapulco», «suit» и «freesurfer». Сделайте это с помощью команды mkdir из командной строки.
   3. В каталоге 'acapulco' создайте выходную папку. В выходной папке создайте каталог для каждого субъекта исследования, содержащий взвешенное по T1 изображение в формате NIFTI-GZ.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Рекомендуется хранить копию исходных данных в другом месте.
3. Анатомическая парцелляция мозжечка с помощью ACAPULCO
   1. Перейдите в Таблицу материалов и загрузите соответствующие скрипты и контейнеры, необходимые для запуска ACAPULCO (в файлах конвейера acapulco). В каталоге 'acapulco' поместите (i) контейнер ACAPULCO Docker OR Singularity ('acapulco_0.2.1.tar.gz' или '.sif', соответственно), (ii) содержимое архива QC_scripts (3 файла: 'QC_Master.R', 'QC_Plots.Rmd' и 'QC_Image_Merge.Rmd') и (iii) 'R.sif' (сингулярность) OR 'calculate_icv.tar' (docker).
   2. Откройте терминал и из командной строки запустите контейнер ACAPULCO на одном образе (замените <> в следующем). Подождите ~ 5 минут для завершения обработки.
      1. С помощью Docker введите команду:
         загрузка docker --input acapulco_0.2.1.tar.gz
         docker run -v $PWD:$PWD -w $PWD -t --user $(id -u):$(id -g) --rm acapulco:latest -i output/<>/<>.nii.gz -o output/<>
      2. Используя сингулярность, введите команду:
         сингулярность run --cleanenv -B $PWD:$PWD acapulco-0.2.1.sif -i output/<>/<>.nii.gz -o output/<>
   3. Зацикливайтесь на всех субъектах / сканах в когорте. В Таблице материалов приведена ссылка на веб-сайт ENIGMA Imaging Protocols для загрузки конвейера (в разделе ENIGMA Cerebellum Volumetrics Pipeline) и учебное пособие, содержащее примеры создания цикла для последовательной обработки нескольких субъектов.
   4. После обработки найдите следующие файлы, созданные в тематических папках:
      1. Определите "_n4_mni_seg_post_inverse.nii.gz": посылочная мозжечковая маска в оригинальном (предметном пространстве).
      2. Определить "<субъект>_n4_mni_seg_post_volumes.csv": объемы (в^мм3) для каждой из 28 субъединиц, генерируемых акапулько;
      3. Определите репрезентативные изображения (в каталоге 'pics'): сагиттальные, осевые и корональные.
4. Статистическое обнаружение выбросов и контроль качества (QC)
   1. Из терминала и в каталоге 'acapulco' убедитесь, что содержимое QC_scripts находится в каталоге 'acapulco'. Чтобы запустить сценарии контроля качества:
      1. С помощью Docker введите команду:
         calculate_icv.tar загрузки docker
         docker run -v $PWD:$PWD -w $PWD --rm -it luhancheng/calculate_icv:latest Rscript
         QC_Master.R выход/
      2. Используя сингулярность, введите команду:
         singularity exec -B $PWD:$PWD R.sif Rscript /path/to/QC_Master.R /path/to/acapulco/output
5. Изучение изображений контроля качества, генерируемых ACAPULCO
   ПРИМЕЧАНИЕ: Существует 3-этапный процесс проверки качества изображений ACAPULCO.
   1. Откройте «QC_Images.html» в веб-браузере и быстро (~ 10 с на субъект) прокрутите изображения, чтобы выявить очевидные сбои или систематические проблемы. Обратите внимание на идентификаторы субъектов неудачных или подозрительных изображений для последующего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 3 для руководства по нейроанатомии мозжечковых долек и Рисунок 4, Рисунок 5 и Рисунок 6 в разделе репрезентативных результатов ниже для примеров «хороших» парселляций, «тонких неправильных парселляций» и «глобальных неудач» парселляций.
   2. Откройте «Plots_for_Outliers.html», чтобы установить флажки для количественных статистических выбросов. Ищите выбросы (2,698 с.д. выше или ниже среднего) выше или ниже усов участков коробки. Наведите указатель мыши на точки данных, чтобы отобразить идентификатор субъекта. Определите выбросы, обозначаемые «1» в соответствующем столбце в файле «Выбросы.csv», и запишите общее количество сегментов, определенных как выбросы для каждого субъекта в последнем столбце в разделе «Выбросы.csv».
   3. Вручную проверьте каждое изображение, имеющее один или несколько выбросов. КРИТИЧЕСКИЙ: Используя стандартный просмотрщик изображений NIFTI (например, FSLEyes или MRICron), наложите маску ACAPULCO на исходное изображение T1w, чтобы проверить качество парцелляции срез за срезом.
      1. Чтобы сгенерировать наложения для подробного контроля качества из командной строки с помощью FSLEyes, i) измените каталог на каталог 'acapulco', ii) укажите тему для просмотра (заменить <предлагаемый>):
         subj=
      2. Скопируйте/вставьте в терминал следующий код (без ручного изменения {subj}, так как это было задано предыдущей строкой:
         t1_image=выход/${subj}/${subj}.nii.gz
         acapulco_image=выход/${subj}/${subj}_n4_mni_seg_post_inverse.nii.gz
         fsleyes ${t1_image} ${acapulco_image} --overlayType label --lut random_big --outline --outlineWidth 3 ${acapulco_image} --overlayType volume --alpha 50 --cmap random
         ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо будет определить, включать ли аномальный сегмент или нет, т.е. есть ли ошибка парцелляции, или это просто нормальная изменчивость в анатомии индивида? Каждая выделенная область рассматривается индивидуально, поэтому несколько областей могут быть исключены для изображения, в то время как остальные могут быть сохранены, если они верны.
      3. Нужно ли исключать из окончательного набора данных одну или несколько областей, разделенных на участки?
         Если да (выброс подтвержден), исключите эту парцелляцию (парцелляции) из анализа, заменив оценку объема на NA в соответствующей ячейке файла «Cerebel_vols.csv» для этого субъекта.
      4. Приводят ли ошибки парцелляции к тому, что часть мозжечка исключается из маски?
         Если да, (например, если определенные мозжечковые дольки отсутствуют в маске или кажутся «отрезанными»), немедленно исключите субъекта из дальнейших анализов (т. Е. Не приступайте к запуску модуля SUIT на этих субъектах).

2. Модуль 2: Морфометрия на основе вокселя SUIT, оптимизированная для мозжечка

1. Морфометрический анализ на основе Voxel с использованием SUIT
   КРИТИЧЕСКИЙ: Этот конвейер требует, чтобы модуль ACAPULCO уже был запущен, поскольку он опирается на генерацию предметной мозжечковой маски для оптимизации регистрации и нормализации мозжечка в шаблоне SUIT. Если предметная маска, созданная ACAPULCO, не включает весь мозжечок, это требует исключения из модуля SUIT. Инструкции по автономному запуску SUIT см. в^{разделе 52}.
   1. Приобретите все необходимое программное обеспечение, указанное в Таблице материалов. Убедитесь, что папка SPM12 и все вложенные папки находятся в пути MATLAB. Убедитесь, enigma_suit скрипты сохранены в каталоге 'spm12/toolbox' и добавлены в путь MATLAB. Чтобы проверить путь MATLAB, введите pathtool в командном окне MATLAB, а затем нажмите кнопку Добавить с вложенными папками , чтобы добавить соответствующие папки.
   2. Запустите конвейер SUIT для одного или нескольких субъектов. Подождите ~15-20 мин (при использовании графического интерфейса пользователя [GUI]) и ~5-7 мин при запуске из терминала (bash/shell) для завершения обработки.
      1. Чтобы использовать графический интерфейс (субъекты будут запускаться последовательно), в командном окне MATLAB введите команду:
         suit_enigma_all
      2. В первом всплывающем окне выберите папки темы из каталога 'acapulco/output' для включения в анализ. Нажмите на отдельные папки в правой части окна или щелкните правой кнопкой мыши и выберите все. Нажмите Готово. Во втором всплывающем окне выберите каталог SUIT, в который будут записываться анализы.
      3. ИЛИ Вызовите функцию из командной строки MATLAB для одного субъекта, введите команду:
         suit_enigma_all('/path/to/acapulco/output/subjdir','/path/to/suitoutputdir')
      4. ИЛИ Вызовите функцию из окна терминала за пределами MATLAB для одного субъекта, введя команду:
         matlab -nodisplay -nosplash -r "suit_enigma_all('/path/to/acapulco/output/subjdir','/path/to/suitoutputdir'), exit"
   3. В Таблице материалов приведена ссылка на веб-сайт ENIGMA Imaging Protocols для загрузки конвейера (в разделе ENIGMA Cerebellum Volumetrics Pipeline) и учебное пособие, содержащее примеры создания цикла для последовательной обработки нескольких субъектов.
   4. Обратите внимание на следующие моменты, касающиеся сценария.
      1. Убедитесь, что сценарий копирует в выходной каталог изображение T1 с поправкой на смещение N4, выровненное по MNI (с твердым телом) и маску мозжечка ACAPULCO.
      2. Убедитесь, что сценарий сегментирует серое и белое вещество мозжечка.
      3. Убедитесь, что сценарий исправляет ошибки чрезмерного включения в парселляцию с помощью маски ACAPULCO.
      4. Убедитесь, что скрипт DARTEL нормализует и перерисовывает данные в пространство SUIT с якобианской модуляцией, так что значение каждого вокселя пропорционально его исходному объему.
      5. Проверьте папку каждого субъекта на наличие следующих конечных выходных данных: 'wd_seg1.nii' (серое вещество) и 'wd_seg2.nii' (белое вещество).
2. Статистическое обнаружение выбросов и контроль качества
   1. Визуально проверьте нормализованные, модулированные изображения (wd*) на наличие серьезных сбоев. В MATLAB введите команду:
      spm_display_4D
   2. Вручную выберите изображения 'wd*seg1' из подпапок костюма или перейдите в каталог 'suit'; вставьте '^wd.*seg1' в поле Фильтр (без кавычек) и нажмите кнопку Rec . Нажмите Готово.
   3. Прокрутите изображения, чтобы убедиться, что все они хорошо выровнены. См. рисунок 7 для правильно нормализованных изображений от здоровых контрольных групп (A, B) и человека с сильно атрофированным мозжечком (D).
      ПРИМЕЧАНИЕ: На данном этапе анатомия между субъектами очень похожа (поскольку они были зарегистрированы в одном и том же шаблоне), а различия в объеме вместо этого кодируются различными интенсивностями вокселя. Основные неудачи будут очевидны, например, пустые изображения, большие участки недостающей ткани, необычные градиенты интенсивности (т. Е. Яркие воксели вверху, темные воксели внизу). Эти изображения должны быть исключены из последующих шагов.
   4. Проверьте пространственную ковариацию на наличие выбросов. В MATLAB введите команду:
      check_spatial_cov
      1. Выберите изображения 'wd*seg1' в соответствии с предыдущим шагом. При появлении запроса выберите следующие параметры: Масштабирование опоры: Да; Переменная для выхода: Нет; Срез (мм): - 48 , Зазор: 1.
      2. Посмотрите на прямоугольник, отображающий среднюю пространственную ковариацию каждого изображения относительно всех остальных в выборке. Определите точки данных, >2s.d. ниже среднего значения в командном окне MATLAB. Для этого проверьте изображение «_n4_mni.nii.gz» в папке SUIT на наличие артефактов (движение, анатомические аномалии), проблем с качеством изображения или ошибок предварительной обработки.
      3. Если качество изображения и предварительная обработка приемлемы, а визуальный осмотр модулированных изображений на предыдущем шаге не указывает на проблему с сегментацией и нормализацией, сохраните эти данные в образце. В противном случае исключите эти данные.

3. МОДУЛЬ 3 (опционально): Оценка внутричерепного объема (ICV) с помощью FreeSurfer

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот модуль будет использовать конвейер FreeSurfer для расчета ICV. Его не нужно повторно запускать, если есть существующие выходы Freesurfer для когорты (любая версия).

1. Настройка FreeSurfer
   1. Убедитесь, что FreeSurfer загружен и установлен⁵³. Перейдите в Таблицу материалов и загрузите соответствующие скрипты для запуска этого модуля (в разделе Файлы конвейера ICV). При работе с FreeSurfer задайте следующие переменные:
      export FREESURFER_HOME=каталог
      источник $FREESURFER_HOME/SetUpFreeSurfer.sh
   2. Замените <путь> следующим образом:
      export SUBJECTS_DIR=
2. Запуск Freesurfer autorecon1
   1. Для одного субъекта из каталога 'freesurfer' (время обработки ~20 мин) введите команду:
      cd
   2. В учебном пособии приведены примеры создания цикла for-loop для последовательной обработки нескольких субъектов.
3. Расчет ICV
   1. Организация данных
      1. В каталоге 'freesurfer' поместите (i) контейнер Docker OR Singularity, используемый в модуле 1 ('calculate_icv.tar' или 'R.sif' соответственно) и (ii) скрипт xfm2det (см. Таблицу материалов). Затем выполните клон git, чтобы клонировать требуемый icv-скрипт:
         https://github.com/Characterisation-Virtual-Laboratory/calculate_icv клонирования git
   2. Запуск экстракции ICV (время обработки ~5 мин)
      1. Из каталога 'freesurfer', с контейнером сингулярности ('R.sif'), введите:
         singularity exec --cleanenv -B $PWD:$PWD R.sif calculate_icv/calculate_icv.py --freesurfer_dir=/path/to/freesurfer --acapulco_dir=/path/to/acapulco/QC/Cerebelvolsfile --output_csv_name=Cerebel_vols.csv calculate_icv
      2. Из каталога 'freesurfer', с контейнером docker, введите:
         docker run -v $PWD:$PWD -w $PWD -rm -it luhancheng/calculate_icv:latest
         calculate_icv/calculate_icv.py --freesurfer_dir=/path/to/Freesurfer --
         acapulco_dir=/path/to/acapulco/QC/Cerebelvolsfile --output_csv_name=Cerebel_vols.csv
         calculate_icv
      3. Запуск скрипта без контейнера — см. Таблицу материалов для дополнительного необходимого программного обеспечения и зависимостей. В каталоге 'freesurfer' введите:
         ./calculate_icv/ calculate_icv.py ---freesurfer_dir=/path/to/freesurfer --
         acapulco_dir=/path/to/acapulco/QC/Cerebelvolsfile --
         output_csv_name=Cerebel_vols.csv calculate_icv
         ПРИМЕЧАНИЕ: Это позволит рассчитать ICV для каждого субъекта и добавить столбец с ICV в конец файла 'Cerebel_vols.csv'.

Парцелляция мозжечка (ACAPULCO)

Контроль качества мозжечковых пакетированных масок:
Следующие примеры демонстрируют распределенные результаты АКАПУЛЬКО и направляют принятие решений о а) качестве посылочной маски на индивидуальном уровне и б) последующем включении или исключении конкретной дольки (дольок) из статистического анализа. В конечном счете, решение о включении или исключении субъекта является субъективным; Здесь приведены примеры «хороших парселляций», «тонких ошибок парцелляции» и «глобальных неудач» из различных здоровых и клинических групп.

Примеры «хороших парселляций» представлены на рисунке 4, в том числе у здорового и сильно атрофированного мозжечкового мозга. На рисунке 5 изображены тонкие над- и недо-включения отдельных мозжечковых долек. Они являются наиболее распространенным типом ошибки парцелляции и не могут быть обнаружены как статистические выбросы в количественном протоколе контроля качества. Эти типы ошибок, как правило, требуют исключения отдельных поражаемых долек, в то время как остальная часть выделенного мозжечка не затрагивается и может быть сохранена. Напротив, «Глобальные сбои», как показано на рисунке 6, требуют полного исключения предмета.

Статистическое обнаружение выбросов:
Чтобы проиллюстрировать конвейер, ACAPULCO был запущен на выборке из 31 человека с FRDA (средний возраст = 36,5 лет; SD = 13,0 лет, 14 женщин) и 37 возрастных и половых здоровых контрольных групп (HC) (средний возраст = 37,1 года; SD=12,8 лет, 17 женщин), как описано ранее⁵⁵. По всей выборке было обнаружено 18 долек в качестве статистических выбросов (<1% от общей выборки). После выполнения детального контроля качества на изображениях 17 выделяющихся долек были удалены из анализа на уровне группы путем удаления индивидуального объема дольки для соответствующего субъекта (субъектов) из файла мозжечковых томов на уровне группы (т. Е. Файла «Cerebel_vols.csv»). Оставшийся выброс считался не ошибкой сегментации, а скорее из-за изменчивости анатомии мозжечка человека и, следовательно, был сохранен в анализе. Также было два глобальных сбоя парцелляции (1 пациент FRDA). Базовый показатель исключения по всем мозжечковым долькам (т.е. глобальные неудачи парцелляции) составил 1,5%. В таблице 1 показаны показатели исключения для каждого из 28 анатомических ROI. Левая долька IX и правая долька Crus I имели самые высокие показатели исключения.

Статистический анализ на уровне группы:
В общей сложности 66 субъектов (30 пациентов FRDA) были включены в групповой анализ. Были проведены тесты независимых образцов двуххвостого манна-Уитни для проверки значительных различий в объемах дольки мозжечка между FRDA и HC. Результаты показали значительное снижение белого вещества в медуллярном теле в FRDA по сравнению с HC (p < 0,05, Бонферрони скорректировал для 28 сравнений). Других существенных межгрупповых различий не было. См. Дополнительную таблицу S1 для объемов всех 28 мозжечковых субъединиц в образце.

Анализ морфометрии мозжечка на основе воксела (SUIT)

Контроль качества:
Примеры хорошо выровненных изображений и примеры исключений как для здоровых контрольных групп, так и для клинических групп, включая FRDA и Spinocerebellar ataxia pateints, показаны на рисунке 7. Анализы SUIT были проведены в общей сложности на 64 субъектах (28 FRDA; 36 HC) из образца, описанного выше, после исключения еще двух субъектов из-за неполного полного покрытия мозжечка в маске мозжечка.

После тестирования пространственной ковариации всех нормализованных изображений в выборке относительно друг друга два сканирования были обнаружены как статистические выбросы на основе их средней пространственной ковариации с остальной частью выборки (рисунок 8). Тем не менее, визуальный осмотр как исходных, так и нормализованных изображений показал, что, хотя эти люди имели некоторую уникальную нейроанатомию, ни в одном из изображений не было значительных артефактов, и этапы обработки выполнялись нормально. Таким образом, оба субъекта были сохранены в анализе.

Статистический анализ на уровне группы:
Изображения были сглажены с использованием гауссовского ядра полной шириной 3 мм при половинном максимуме (FWHM). Непараметрические перестановочные тесты были проведены в SnPM для проверки значительных межгрупповых различий в объемах серого вещества мозжечка. С этой целью было выполнено 5000 перестановок с кластерообразующим порогом p < 0,001. Изображения были явно замаскированы атласом серого вещества SUIT, чтобы ограничить вывод областями серого вещества. Чтобы скорректировать размер головы, внутричерепной объем был введен в качестве ковариата в модель. Окончательный вывод групповых результатов проводился при p < 0,05, исправлена семейная ошибка (FWE) на уровне кластера.

По сравнению с HC, FRDA показал значительное уменьшение объема серого вещества в двусторонних передних дольках I-V (слева: x= -10, y= -46, z= -26; T= 5,61; Ke= 754; справа: x= 10, y= -38, z= -21; T= 6,83; Ke= 569); и в медиальных областях задней доли, включая Вермис VI, простирающийся двусторонне в Лобулу VI (x= 3, y= -65, z= -20; T= 7,25) и Vermis IX, простирающийся двусторонне в Lobule IX (x= 3, y= -65, z= -20; T= 6,46; Ke= 3974; Рисунок 9).

Рисунок 1: Мозжечок человека. (А) Уплощенное изображение мозжечка и его основных трещин, долей и долек. Красный = передняя доля (дольки I-V); крем = задняя доля (дольки IV-IX); фиолетовый = флоккулородулярная доля. Мозжечок можно разделить на среднеочевидные «вермисные» и боковые «полусферальные» зоны. Все дольки идентифицированы в вермисе и полушариях. В долькуле VII, VIIAf в вермисе расширяется в полушариях, чтобы стать Crus I, долька VIIAt в вермисе становится Crus II в полушариях, а долька VIIB сохраняет свою метку как в вермисе, так и в полушариях. (B) Вверху: Плоская карта мозжечка, показывающая анатомические субъединицы мозжечка в разных цветах. Внизу: вид сзади мозжечка. Эта цифра была адаптирована из ⁵⁶ и ⁵⁷. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Схематическая иллюстрация конвейера. Требуется изображение T1 MPRAGE с высоким разрешением. Существует три модуля: ACAPULCO, SUIT и ICV. Конвейер полностью автоматизирован (за исключением ручного вмешательства, необходимого для контроля качества выходов), доступен в формате контейнера Docker и Singularity и занимает около 20 минут для запуска до конца для каждого субъекта. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Парцелляция ACAPULCO, демонстрирующая каждую из 28 анатомических субъединиц. Эта цифра была адаптирована из³⁶. Сокращения: CM = corpus medullare; Ver = vermis; R/L = правый/левый. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Примеры «хороших» парцелляций мозжечка. Показаны сагиттальные (x= 0) и корональные (y= -57) срезы. (А, Б) Сагиттальные и корональные срезы с изображением пакетированных масок от двух здоровых мозжечков. Алгоритм правильно локализовал границы отдельных субъединиц и не включил поперечный синус в маркировку и количественную оценку Crus I. (C) Сильно атрофированный мозжечок пациента SCA2. Здесь атрофия проявляется по всей протяженности мозжечка, борозды широкие, а также много недостающей ткани. Наблюдается незначительное чрезмерное включение сосудистой системы в задние доли, которое более выражено с правой стороны (желтая стрелка). Помимо этого чрезмерного включения, ACAPULCO работает хорошо. Сокращения: CM = corpus medullare; Ver = vermis; L/R = влево/вправо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Примеры мозжечковых «неправильных парселляций». ' (A) Сагиттальный срез (x= 0) и корональный срез (y = -57), показывающие ошибку парцелляции у пациента FRDA. Алгоритм плохо работал вдоль средней линии, и недовключения Crus I и II (красная стрелка) очевидны вдоль задней протяженности. Эти дольки будут исключены из последующего группового анализа. (B) Сагиттальный срез (x= 8), корональный срез (y= -47), показывающий ошибку парцелляции у здорового мозжечка. Алгоритм полностью пропустил левую дольку VIIIb (красные стрелки). Эта долька будет исключена из последующего группового анализа. (C) Сагиттальный срез (x= -24) и корональный срез (y= -47), показывающие ошибку парцелляции у здорового мозжечка. Присутствует некоторая мозжечковая атрофия, и есть недоумение Crus I (красная стрелка). Сокращения: FRDA = Friedreich ataxia; CM = corpus medullare; Ver = vermis; L/R = влево/вправо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Примеры «глобальных сбоев» мозжечковой парцелляции. (A) Сагиттальный срез (x= 0) и корональный срез (y= -57), показывающие отказ парцелляции. Здесь мозжечок лишь частично сегментирован, а части затылочной доли неправильно помечены как мозжечок. Эти типы сбоев, вероятно, связаны с проблемой с заголовком исходного изображения, которая повлияет на аффинное преобразование изображения ACAPULCO в мировую координату и последующую локализацию мозжечка. (B) Сагиттальный срез (x= 0) и корональный срез (x= -57), показывающие неудачу парцелляции у человека с FRDA. Здесь КМ был полностью неправильно сегментирован. Алгоритм обозначил КМ на затылке (красный овал), вне мозга. Границы белого вещества не были захвачены и ошибочно обозначены как серое вещество, особенно затрагивая левые дольки VIIIb и IX. Левая долька X также была пропущена (красная стрелка на корональном срезе). Эти примеры требуют немедленного исключения из анализа на уровне группы для анализов ACAPULCO и SUIT. Сокращения: CM = corpus medullare; Ver = vermis; L/R = влево/вправо. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Искривленные и модулированные карты морфометрии на основе воксела. (A, B) Хорошо выровненное серое вещество мозжечка из двух ГК. (C) Мозжечок из HC, который был обнаружен как статистический выброс, но был сохранен в анализе. (D) Атрофированный мозжечок от человека с FRDA. Мозжечок был правильно деформирован к шаблону; следовательно, это не оправдывает исключения. e) исключение. Существует контрастный градиент сверху вниз изображения, который отражает ошибку в обработке. (F) Артефакт гиперинтенсивной плоскости в правом нижнем углу изображения неизвестного происхождения требует исключения. (G) Пример сильно атрофированного мозжечка пациента SCA2. Мозжечок был правильно деформирован к шаблону; тем не менее, есть много недостающих тканей, что приводит к низкой контрастности. Это не было бы исключением. H) Пример плохой маскировки, требующей исключения. Сокращения: VBM = морфометрия на основе вокселя; HC = здоровый контроль; FRDA = атаксия Фридрейха; SCA2 = Спиноцеребеллярная атаксия 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Пространственная ковариация карт морфометрии на основе вокселя SUIT. График коробки, иллюстрирующий пространственную ковариацию морфометрических карт на основе вокселя для когорты из 64 (28 FRDA) субъектов. Пространственная ковариация — это мера того, насколько хорошо выровнено каждое изображение по отношению к любому другому изображению в выборке. Данные плотно сгруппированы вместе со средней пространственной ковариационной корреляцией ~0,95. Здесь были обнаружены два выброса (1 FRDA, 1 HC), так как >2 SD ниже среднего значения. Сокращения: FRDA = Friedreich ataxia; HC = здоровый контроль; SD = стандартное отклонение; cont = контроль. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 9. Межгрупповые результаты морфометрического анализа морфометрии мозжечкового серого вещества на основе вокселя. (A) Сагиттальные, (B) корональные и (C) солевые карты статистических карт на уровне вокселя у лиц с FRDA и контрольными элементами, контролирующими ICV. Показаны только вокселы, пережившие p < 0,05 FWE на уровне кластера. Цветовая шкала указывает на статистику T. Сокращения: FRDA = Friedreich ataxia; ICV = внутричерепной объем; FWE = семейная ошибка. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Мозжечковые анатомические дольки, полученные из ACAPULCO, и показатели исключения (%) среди выборки из 31 человека с FRDA и 37 HCs. Сокращения: FRDA = Friedreich ataxia; HC = здоровые контрольные элементы.

Дополнительная таблица S1: Объемы (мм³) 28 мозжечковых анатомических долек у атаксии Фридрейха и здоровых контрольных лиц. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить эту таблицу.

Мозжечок имеет решающее значение для широкого спектра моторных^{функций человека 3}, когнитивных⁵⁸, аффективных¹⁰ и языка ^7,59 и участвует во многих неврологических и психиатрических заболеваниях. Наличие стандартизированного и легко реализуемого подхода к количественной оценке региональных мозжечковых объемов будет способствовать все более детальному картированию структуры и функции «всего мозга», полному моделированию заболеваний и улучшению возможностей для определения и отслеживания вклада мозжечка в заболевания головного мозга. Этот стандартизированный конвейер, описанный здесь, сочетает в себе современные подходы к автоматической парцелляции мозжечка и более тонкозернистому пространственному профилированию морфометрии серого вещества мозжечка как в здоровье, так и в болезни.

Результаты анализа поперечной парцелляции мозжечка с использованием ACAPULCO, представленные здесь, показали, что люди с FRDA (по сравнению с HC) значительно уменьшили объемы белого вещества. Эти результаты подтверждают предыдущие исследования FRDA, которые последовательно показывают раннюю, надежную и прогрессирующую потерю объема белого вещества, особенно в зубчатых ядрах, в FRDA. Кроме того, было показано, что характер и степень прогрессирующей нейродегенерации в верхних и нижних мозжечковых ножках и зубчатых ядрах различаются в качестве фактора возраста начала FRDA⁴⁴. Результаты анализа SUIT выявили дополнительные результаты. В частности, наблюдалась значительная потеря объема на уровне вокселя в FRDA (по сравнению с HC) в передних областях доли, соответствующих двусторонним долечкам I-IV и Right V, простирающимся в дольку VI. Кроме того, анализ SUIT выявил значительные потери объема в FRDA (по сравнению с HC) в медиальных областях задней доли, включая дольку IX, X и Vermis. Эта картина различий между группами сопоставима с ранее опубликованной работой в той же когорте пациентов FRDA с использованием подхода VBM^{всего мозга 55}.

Определение мозжечковых аномалий при неврологических и психиатрических заболеваниях является приоритетной областью исследований с трансляционным воздействием. Инструментом для отслеживания и лечения неврологических заболеваний, особенно тех, где мозжечок является основным местом нейродегенерации, является разработка полных биологических характеристик поражения мозжечка. Представленный в настоящем описании конвейер позволяет установить взаимосвязи между индивидуальной морфометрией серого вещества мозжечковых дольков и клиническими мерами, которые используются в качестве «золотого стандарта» для клинических конечных точек заболевания. Такие исследования могут оказать значительное трансляционное воздействие. Например, в области редких мозжечковых заболеваний идентификация определенного профиля атрофии серого вещества мозжечка в подгруппе пациентов, которая отображает или предсказывает клинические симптомы, будет иметь значение для руководства клинической практикой. Включение модуля SUIT дополнительно позволяет решать интересные исследовательские вопросы, такие как структурно-функциональное картирование мозжечка или анализ функциональных градиентов мозжечка⁶⁰.

Общие рекомендации в отношении статистического анализа на уровне групп
АКАПУЛЬКО: Объемы каждой мозжечковой дольки (в^мм3) для каждого субъекта записываются в Cerebel_vols.csv. Во время статистического вывода эффектов на уровне группы следует контролировать внутричерепный объем (ICV; также зарегистрирован в Cerebel_vols.csv) для учета изменчивости размера головы. Пороговые значения альфа-значимости должны быть скорректированы с учетом вывода по нескольким долькам.

КОСТЮМ: Мозжечковое VBM серого вещества может быть выполнено на изображениях wdseg1.nii с использованием стандартного программного обеспечения для обработки МРТ, такого как SPM или FSL. Смотрите руководство CAT12 для отличного введения в VBM с использованием SPM12⁵⁴. ICV следует контролировать, чтобы учесть изменчивость размера головы.

Для VBM в мозжечке обычно рекомендуется использовать гауссовское пространственное сглаживающее ядро полной шириной не более 3 мм при половинном максимуме (FWHM). Для учета многочисленных сравнений между вокселями необходимо применять соответствующую статистическую коррекцию. В целом, рекомендуется использовать непараметрические подходы (например, SnPM или FSL-Randomise).

Наиболее важным шагом для успешной парцелляции мозжечка с использованием ACAPULCO является общая проверка качества изображений T1 до и после обработки. Настоятельно рекомендуется, чтобы пользователь проверял наличие плохих контрастных изображений (например, непоследовательного градиента по всему изображению) и сильного наклона головы и артефактов движения, которые могут повлиять на производительность алгоритма. Кроме того, в то время как алгоритм ACAPULCO был обучен на атрофированном мозжечке, он не был обучен на данных о поражении. Предполагается, что поражения в коре головного мозга не будут влиять на производительность алгоритма и последующую точность парцелляции; однако большие инфаркты в мозжечке, вероятно, приведут к ошибкам парцелляции. Проверка качества после обработки маски мозжечка имеет важное значение. Незначительные ошибки парцелляции (например, незначительные недо- и чрезмерные включения мозжечковых долек) иногда не обнаруживаются как статистические выбросы; и наоборот, случаи неправильных невыходов могут возникать там, где данные находятся в пределах нормального диапазона, несмотря на очевидную ошибку парцелляции. Если субъект идентифицирован как выброс, важно выполнить последующую, подробную проверку качества маски мозжечка по срезу, чтобы направлять принятие решения о том, включать или исключать дольку (ы) для этого субъекта. Другим важным шагом при запуске конвейера SUIT (модуль 2) является то, что он требует, чтобы модуль ACAPULCO уже был запущен. В частности, SUIT требует, чтобы маска мозжечка, произведенная в ACAPULCO, выполняла изоляцию и сегментацию мозжечка. Важно, чтобы маска мозжечка была проверена на качество, чтобы обеспечить полное мозжечковое покрытие.

У протокола есть некоторые ограничения. Во-первых, хотя ACAPULCO достигает современной точности для парцелляции мозжечкового серого вещества, он не оптимизирован для парцелляции белого вещества; медуллярное тело покрывает основное тело белого вещества, но не обеспечивает измерения всего белого вещества. Во-вторых, сверточные нейронные сети, используемые для локализации и сегментации мозжечка в ACAPULCO, плохо обобщаются на изображения с различными контрастами или изображения, которые не использовались при обучении. Например, поскольку в обучении использовались только изображения 3T, качество парцелляции с использованием изображений, полученных на 1,5-тонном сканере, как правило, не так хорошо; кроме того, нет никаких статистических данных в отношении достоверной истины, которая была выполнена на этих изображениях. Наконец, трубопровод контролирует смешанное влияние размера головы на оценки объема мозжечка, предоставляя оценку ICV, которая может быть включена в качестве регрессора, не представляющего интереса для статистического анализа на уровне группы. Тем не менее, идеальным подходом было бы рассчитать ICV-скорректированные объемы мозжечка на индивидуальном уровне до запуска QC, так что обнаруженные выбросы отражают истинную ошибку парцелляции, а не естественную изменчивость в нейроанатомии субъектов (например, наличие большой головы).

В заключение мы представляем стандартизированный конвейер для изучения серой морфометрии мозжечка, которая имеет широкое применение к целому ряду неврологических заболеваний. Трубопровод создан для проведения крупных многосайтовых исследований и «мега-анализов» и является общедоступным для использования исследовательскими группами для обеспечения надежности и воспроизводимости по всему полю. В конечном счете, этот конвейер обеспечивает мощный методологический подход для дальнейшей характеристики и отслеживания структурных изменений мозжечка с прогрессированием заболевания при неврологических заболеваниях. В настоящее время разрабатывается продольный трубопровод.

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Работа, представленная в этой рукописи, финансировалась Австралийским национальным советом по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Ideas Grant: APP1184403.