Обнаружение агрегации белка с помощью спектроскопии корреляции флуоресценции

Здесь мы вводим процедуру измерения олигомеров белка и агрегации в лисате клеток и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии.

Агрегация белка является отличительной чертой нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера (AD), болезнь Паркинсона (PD), болезнь Генттона (HD), и так далее. Для обнаружения и анализа растворимых или диффузных белковых олигомеров или агрегатов была использована флуоресцентная корреляционная спектроскопия (FCS), которая может обнаруживать скорость диффузии и яркость одной частицы с одной чувствительностью молекулы. Тем не менее, надлежащая процедура и ноу-хау для обнаружения агрегации белка не получили широкого широкого общего широкогоства. Здесь мы показываем стандартную процедуру измерения FCS для диффузионных свойств склонных к агрегации белков в лизате клетки и живых клетках: ALS-ассоциированный 25 kDa карбоксил-терминальный фрагмент TAR DNA/RNA-связывающего белка 43 kDa (TDP25) и супероксиддисмутазы 1 (SOD1). Репрезентативные результаты показывают, что часть агрегатов зеленого флуоресцентного белка (GFP) с тегами TDP25 была слегка включена в растворимую долю лизата клеток murine neuroblastoma Neuro2a. Кроме того, GFP-тегами SOD1 проведения ALS связанных мутации показывает более медленное распространение в живых клетках. Соответственно, мы здесь вводим процедуру обнаружения агрегации белка с помощью его диффузионные свойства с помощью FCS.

Белковые агрегации с участием нейродегенеративных расстройств, таких как боковой амиотрофический склероз (ALS), болезнь Альцгеймера, болезнь Паркинсона, болезнь Хантингтона, и^{так далее 1, как} известно, токсичны и будет нарушать белок гомеостаз (протеостаз) в клетках и органах, которые затем могут привести к^{старению 2}. Очистка агрегации белка ожидается в качестве терапевтической стратегии; однако химические вещества, предотвращая образование агрегации белка и ухудшая белковые агрегаты (например, небольшие молекулы или наркотики), еще не установлены. Более того, как агрегация белка оказывает токсичность остается неуловимым. Поэтому для продвижения исследовательских проектов, связанных с агрегацией белка, важно ввести процедуры высокой пропускной способности, чтобы просто обнаружить агрегацию белка. Обнаружение агрегации белка с использованием антител, распознающих конформацию агрегации белка и агрегации специфических флуоресцентных красителей широко используется³. Однако, трудно обнаружить агрегацию, особенно в живых клетках с помощью таких классических процедур.

Фюрстер резонансной передачи энергии (FRET) является процедура для обнаружения агрегации белка и структурных изменений. Тем не менее, FRET не в состоянии анализировать белковую динамику (например, диффузию и олигомеризацию белка в живых клетках)^3. Поэтому мы вводим здесь простой протокол для обнаружения агрегации белка в растворе (например, лисате клеток) и живых клетках с использованием флуоресцентной корреляционные спектроскопии (FCS), которая измеряет диффузионные свойства и яркость флуоресцентных молекул с одной^{чувствительностью молекулы 4}. FCS — это метод фотон-подсчета с помощью лазерного сканирования конфокального микроскопа (LSM). Используя высокочувствительный фотон-детектор и расчет функции автокорреляции (ACF) времени прибытия фотона, измеряется проход во времени и яркость флуоресцентных молекул в объеме обнаружения. Диффузия замедляется с увеличением молекулярного веса; таким образом, интермолекулярное взаимодействие можно оценить с помощью FCS. Еще мощнее, увеличение яркости флуоресцентной молекулы указывает на гомо-олигомеризацию молекул. Таким образом, FCS является мощным инструментом для обнаружения такой агрегации белка.

1. Материалы и реагенты

1. Используйте пирогенные свободные растворы и средние для клеточной культуры(таблица 1).
2. Подготовка решений для биохимического эксперимента с использованием ультрачистой воды и использовать в качестве DNase / RNase бесплатно.
3. Выберите подходящий FBS для клеточной культуры с большим количеством процесса проверки. Поскольку выбранный лот FBS регулярно меняется, каталог и номер лота для FBS не могут быть представлены здесь.
4. Плазмидная ДНК
   1. Подготовка pmeGFP-N1^{5 для} выражения мономера eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ для выражения GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ для выражения SOD1-G85R-GFP; и pCAGGS⁸ в качестве перевозчика.
      ПРИМЕЧАНИЕ: MEGFP является мономерным вариантом, несущим мутацию A206K расширенного GFP (eGFP). TDP25 — связанный с ALS фрагмент C-терминала TDP-43. SOD1-G85R — связанный с ALS мутант SOD1.
5. Напряжение клеток
   1. Используйте клетки муриной нейробластомы Neuro2a.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Клетки Neuro2a имеют высокую эффективность трансфекции и высоко экспресс-экзогенные белки. Для выражения TDP25 необходимы клеточные штаммы с высокой эффективностью выражения, такие как клетки Neuro2a или HEK293. В ячейках HeLa TDP25 не могли быть эффективно выражены.

2. Культура клеток и трансфекция

1. Приготовьте 100-мм пластиковую тарелку, растущую клетками Neuro2a в условиях нормального роста.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение примерно 48-72 часов после предыдущего посева, пока полу-слияние не будет достигнуто.
2. Удалите носитель.
3. Добавьте 0,5 мл раствора трипсина-ЭДТА в блюдо клеточной культуры и инкубировать их при 37 градусов по Цельсию в течение 1 мин.
4. Добавьте в блюдо 9,5 мл нормальной среды роста и приостановит отдельные клетки.
5. Используя trypan синий, чтобы испачкать мертвые клетки, подсчитайте количество ячеек с помощью счетчика ячейки или вручную. Затем разбавить клетки в среде культуры (1,0 × 10⁵/мл).
6. Добавьте 2 мл клеточной суспензии в пластиковую тарелку диаметром 35 мм для клеточного лиза или стеклянное базовое блюдо для измерения живых клеток.
7. Инкубировать блюдо при 37 градусов по Цельсию в течение 1 дня.
8. Начните следующие приготовления за 15 минут до дня трансфекции.
9. Подготовь две трубки по 1,5 мл и добавьте по 100 мкл Opti-MEM I к каждой трубке.
10. В первой трубке смешайте 1,0 мкг плазмидной ДНК (решение А). Во второй трубке смешайте 2,5 МКЛ липофектамина 2000 (раствор В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для поддержания эффективности трансфекции, сохранить общее количество ДНК то же самое. Чтобы снизить уровень экспрессии для измерения FCS в живых клетках, доля количества плазмидной ДНК для экспрессии белка должна уменьшиться (например, 0,2 мкг смеси pmeGFP-N1-SOD1-G85R и 0,8 мкг смеси pCAGGS). Кроме того, сохранить то же соотношение между объемом липофектамина 2000 года и количество плазмидной ДНК.
11. Аккуратно смешайте раствор A и B, добавив один в обе трубки, а затем инкубировать его в течение 1 мин при комнатной температуре (Solution C).
12. Добавьте решение C в культурную среду; и инкубировать клетки в течение 24 ч при 37 градусов по Цельсию.

3. Сотовыйлиз и средний обмен

1. Проверьте выражение GFP с помощью обычного микроскопа.
2. Удалите среду в блюдо.
3. Добавьте 2 мл PBS при 25 градусов по Цельсию, чтобы вымыть среду. Удалите PBS.
4. Поместите блюдо на алюминиевую тарелку поверх дробленого льда.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мы используем алюминиевую пластину толщиной 1 мм, вырезанную в воскресном магазине инструментов или коммерчески доступную в качестве лабораторного оборудования.
5. Добавьте 200 МКЛ буфера лиза при 4 градусах Цельсия. Встряхните блюдо мягко так, что буфер равномерно распределены в нижней части блюда.
6. Очисти блюдо с помощью клеточного скребка и восстановить лизолировать с неразрешеной ячейки мусора в новой трубке 1,5 мл.
7. Центрифуга раствор при 20 400 х г в течение 5 минут при 4 градусах Цельсия.
8. Восстановите супернатант в новой трубке 1,5 мл и держите его при 4 градусах Цельсия или на льду.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте лизат.
9. Для измерения живых клеток замените носитель перед измерением. Проверьте вложение клеток с помощью фазово-контрастного микроскопа. Подтвердите экспрессию с помощью флуоресцентной микроскопа.

4. Калибровка корреляции флуоресценции (FCS)

1. Запустите систему и запустите программное обеспечение для работы. Включите аргон и^лазер (458/477/488/514 нм). Стабилизировать систему по крайней мере в течение 30 минут.
2. Настройка оптического пути: главный сплиттер пучка: HFT488; Дихроическое зеркало: NFT600; Фильтр барьера флуоресценции: фильтр пластыря 505-540 (BP505-540); Детектор: лавинный фотодиод (APD)).
3. Установите размер пинхол, введя значение напрямую (66 мкм; 1 воздушный блок).
4. Добавьте раствор родамин 6G (Rh6G) в колодец стеклянной камеры крышки на сцене.
5. Добавьте сверхчистую воду для погружения в цель. Не используйте масло для погружения.
6. Установите камеру на сцене микроскопа. Перемести сцену в соответствующее положение.
7. Сосредоточьтесь на верхней поверхности стекла, измеряя рассеянный свет от поверхности стекла. После снижения объектива цели на дно, поверните ручку фокусировки по часовой стрелке, чтобы настроить.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте направление поворота ручки фокусировки, потому что она противоположна тем, которые сделаны в Японии и Германии.
8. Поднимите координационный центр на 200 мкм над верхней стеклянной поверхностью, чтобы наблюдать внутри раствора.
9. Нажмите на скорость подсчета и отслеживайте скорость подсчета фотона.
10. Постепенно увеличивайте значение акустооптических настраиваемых фильтров (AOTF) (например, возбуждающей лазерной передачи), так что значение скорости подсчета составляет более 10 кГц.
11. Нажмите на корректировку Pinhole и откройте мастер регулировки пинхол. Найдите положение пинхол с самым высоким (пиковым) числом фотонов как в х-, так и в оси.
12. Поверните кольцо коррекции объектива цели так, чтобы количество на молекулу (CPM) значение является самым высоким.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку толщина крышки стекла камеры, указанной здесь, составляет 0,12-0,17 мм, коррекционный кольцо находится на минимальном уровне или всего в нескольких поворотах от него, где CPM находится на максимуме.
13. Постепенно уменьшаем значение AOTF, так что значение CPM становится 2-3 кГц.
14. Приобрети функцию автокорреляции (ACF) Rh6G на 90 с.
15. Как только измерение завершено, нажмите Fit для выполнения анализа установки кривой.
16. Выберите модель для однокомпонентного трехмерного (3D) диффузии с тройным состоянием.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Rh6G является монодисперсным и однокомпонентным диффузным с тройным состоянием.
17. Установите подходящее время начала, перемещая красную линию. Нажмите Fit All и проверьте пригонку отклонения. После выполнения установки кривой убедитесь, что время диффузии (DT) и параметр структуры (SP) находятся примерно в диапазоне 20-30 и 4-8, соответственно.
18. Помните значение структурных параметров. Используйте значение SP для анализа кривой установки всех ACFs измеряется в тот же день, в тех же оптических условиях, и с использованием того же типа стеклянной основы блюдо или камерной крышкой стекла, установленного на стадии микроскопа.

5. Измерение FCS в ликате клетки

1. Подготовь ячейку лисаты (см. выше).
2. Поместите лисат на крышку стеклянной камеры. Поместите крышку, чтобы избежать высыхания и крышку сцены для светлого затенения.
3. Установите условие приобретения, мощность лазера, время измерения и повторения.
4. Нажмите Скорость подсчета и отрегулируйте значение AOTF лазера так, чтобы значение CPM стало больше 1 кГц.
5. Выполните пробный замер в течение 1 мин. Проверьте, показывает ли рассчитанный ACF положительную амплитуду и плавный распад.
6. Выполните основное измерение в течение 5 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Общее время измерения постепенно увеличивается до тех пор, пока форма ACF не изменится, даже если время измерения увеличено.
7. Нажмите Fit для выполнения анализа установки кривой.
8. Выберите модель для двухкомпонентной 3D диффузии с тройным состоянием. Не забудьте ввести значение SP и изменить его настройки на "Fixed" не "Бесплатно", прежде чем нажать Fit все.
9. Экспорт оборудованной таблицы в качестве файла текста с делимитацией вкладок.
10. При необходимости экспорт записи скорости ACF и Count в качестве текстового файла, делимитированного вкладкой.

6. Измерение FCS в живых клетках

1. Замените носитель на свежий перед измерением.
2. Используйте инкубатор тепловой ступени. Установите клеточно-культурное блюдо на сцене микроскопа.
3. Подтвердите фокус и положение с помощью конфокального микропа. Выберите измерительную ячейку. Увеличьте и отрегулируйте положение ячейки. Приобретайте флуоресцентные изображения ячейки, выражаюющей GFP, используя режим медленного сканирования.
4. Выберите измерительное положение FCS с помощью позиции в разделе "FCS".
5. Выберите по крайней мере одну точку измерения FCS с помощью перекрестия(рисунок 1).
6. Измерьте ACF в течение 1 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Потому что флуоресцентные белки, как правило, photobleached в живых клетках из-за медленного движения по сравнению с раствором, время измерения должно быть минимальным. Как правило, трудно получить ACF в клетке так гладко, как раствор измерений, поскольку длительное измерение приведет к фотоотбеливания флуоресцентных белков.
7. Нажмите Fit для выполнения анализа установки кривой с помощью модели для двухкомпонентного 3D диффузии с тройным состоянием.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для измерения живых клеток, модель для двухкомпонентной 3D диффузии с тройным состоянием было бы лучше, потому что эмпирически трудно уменьшить чи-квадратное значение с однокомпонентной 3D диффузионные модели из-за существования различных мобильных компонентов в живой клетке. Но даже с помощью модели для трехкомпонентной 3D диффузии, компоненты диффузии, как правило, не разделены по сравнению с использованием модели для двухкомпонентов.

Мы провели измерение FCS GFP-TDP25 в лизаторе клеток и SOD1-G85R-GFP в живых клетках. В обоих случаях удалось приобрести положительную амплитуду и гладкие ACF. Мы показали, что часть GFP-TDP25, выраженная в клетках Neuro2a, была восстановлена в растворимой фракции при указанном состоянии^6. В растворимой фракции лизата клетки, чрезвычайно яркие молекулы флуоресценции были обнаружены в записи скорости подсчета фотона с помощью FCS(рисунок 2A, сверху, стрелка). Такие "шипы (также называемые всплеск)" не наблюдались в мономерах GFP и растворе флуоресцентного красителя монодисперса, что свидетельствует о том, что шипы указывают на олигомерные^{белки 9.} Анализ кривой установки с использованием модели, предполагающей двухкомпонентную 3D диффузию с тройным состоянием, показал, что быстро диффузионные молекулы (DT_Fast и 186 мс) были 90%, а остальные 10% составили 2,3 мс(рисунок 2A, дно; и таблица 2).

Во время измерения SOD1-G85R-GFP в живых клетках, запись скорости количества фотона показала постепенное снижение, предполагая его фотоотверга в объеме обнаружения(рисунок 2B, верхняя часть). Несмотря на то, что вклад фотоблейинга был показан в диапазоне более 1 с в ACF, наблюдалась положительная амплитуда и плавный распад ACF(рисунок 2B, дно). Анализ кривой установки с использованием модели, предполагающей двухкомпонентную 3D диффузию с тройным состоянием, показал, что быстро диффузионные молекулы (DT_Fast и 397 мс) составили 93,4%, а остальные 6,6% - 12,3 мс(таблица 2). Мутация, связанная с ALS, G85R, в SOD1 не позволила резкой разницы в свойстве диффузии по сравнению с диким типом. Однако протеасомная ингибирование снизила скорость диффузии только у мутанта G85R SOD1 в цитоплазме^7.

Рисунок 1: Конфокальные флуоресцентные изображения клеток Neuro2a, выражают SOD1-G85R-GFP.  Конфокальные флуоресцентные изображения клеток Neuro2a, выражают SOD1-G85R-GFP. Перекрестие указывает на положение измерения FCS в цитоплазме. Бар 10 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Типичные результаты FCS и установленные кривые для функций автокорреляции. (A и B) Топ: Записанная скорость подсчета фотона в диапазоне времени измерения FCS (Зеленая линия). Внизу: Рассчитанные функции автокорреляции (ACFs; Сырые, серые линии) и установленные кривые ACF с использованием модели для двухкомпонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием (Fit, пурпурные линии). G(к) для Y-оси указывает на амплитуду ACFs во время й сек. для X-оси. Точечные линии показывают подходящие точки начала и конца времени. Темно-синие стрелки показывают шип с чрезвычайно яркими белками, проходящими через объем обнаружения (т.е. растворимые олигомеры/агрегаты). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Композиции решений

Таблица 2: Типичные установленные значения для функций автокорреляции
Установленные значения для функций автокорреляции представлены на рисунке 2 с использованием модели для двухкомпонентной трехмерной диффузии с тройным состоянием. Представлены подсчеты на молекулу (CPM), быстрое и медленное время диффузии (DT_Fast и DT_Slow,соответственно), и их компоненты (быстрый и медленный компонент).

Что касается калибровки системы до измерений, то следует использовать те же стеклянные изделия, что и для измерения образца (например, 8-колодцы покрывают стеклянную камеру для ликата клеток и 35-мм стеклянное базовое блюдо для живых клеток). Из-за adorption Rh6G на стекле, его эффективная концентрация иногда может уменьшиться. Если это так, то высококонцентрированный раствор Rh6G, такой как 1 МКМ, следует использовать только для регулировки скважины. Для защиты детектора необходимо избегать чрезвычайно высоких скоростей подсчета фотона (например, более 1000 кГц). Кроме того, концентрированное решение не подходит для приобретения функции автокорреляции (поддержание менее 100 кГц). Важное значение имеет калибровка положения пинхол. Если оптическая система используется часто, это редко для драматического вывиха пинхол; таким образом, использование "Fine" в начале часто не проблема найти соответствующую позицию. Если пиковое положение ставок подсчета с использованием "Fine" не найдено, используйте "Coarse" для перемещения пинхол с одного конца диапазона движения на другой до нахождения позиции с помощью "Fine". Если амплитуда ACF была плоской, проверьте, подходит ли фокус и положение.

После измерения Rh6G и его установки, если DT и/или SP находится вне указанного диапазона, повторно попробуйте пинхол и коррекцию кольца регулировки. При все еще показе из диапазона, мы рекомендуем связаться с поддержкой производителя, как это, вероятно, из-за подозрений в дефекте оптической системы. Используя измеренные DT и SP в дополнение к известному коэффициенту диффузии Rh6G (414^{мкм 2/с)}в воде, эффективная талия пучка может быть рассчитана, потому что DT зависит от талии^{луча 10}. Кроме того, поскольку СП является соотношением талии пучка и высоты эффективного объема обнаружения, объем обнаружения может быть рассчитан. Расчет объема необходим для определения абсолютной концентрации. Более подробное описание принципа и устранения неполадок во время калибровки также доступно в протоколах, как^{сообщалось ранее 11,12,13}.

Некоторые всплески наблюдались в измерении FCS GFP-TDP25 в лизате клеток(рисунок 2A, верхняя часть). Мы показываем, что такие всплески наблюдались в измерении FCS агрегированного охотничьего тина, включая расширенные повторы полиглутамина, помеченные GFP или желтым флуоресцентным белком (YFP) (Htt-78 и Htt'143)^9; таким образом, он предлагает растворимые олигомеры/агрегаты GFP-TDP25 в растворимой фракции лисата клетки. Но такой всплеск популяции был редким; таким образом, ACF и его кривой облегающий результат не может включать в себя значительный вклад таких скачков. Возможная причина лишь небольшого количества агрегатов, включенных в растворимую фракцию, скорее всего, потому, что TDP25 очень подвержен агрегации и его агрегаты фракционные в нерастворимой фракции, как показано с помощью фракционной лисата клетки следуют западные blotting^{обнаружения 6}. Явления склонности к восстановлению нерастворимой доли белка, подверженного агрегации, часто наблюдаются^6,9. Такие растворимые олигомеры/агрегаты не могут быть легко обнаружены с помощью обычных биохимических методов, таких как SDS-PAGE, за которыми следуют западные пятна; таким образом, FCS имеет преимущество. Однако проанализировать многокомпоненты с использованием обычных FCS сложно, так как он измеряет среднюю численность населения. Дополнительные процедуры развития в сочетании с байесовским непараметрическим анализом определят многокомпоненты в выборке без каких-либо предположений по компонентам^14.

Время диффузии в живых клетках было относительно медленным по сравнению с ликатом клетки. Поскольку вязкость в клетке, как известно, выше, чем в таких решениях, как PBS и моющих средств,^{содержащих буфер 15}, время диффузии в живых клетках теоретически получает 2,5-3 раза дольше. Из-за этой медленной диффузии в живых клетках, сравнивая в растворе, часто может быть вызвано фотоотбелом флуоресцентных тегов. Для коррекции эффекта фотоотливания на ACFs, некоторые процедуры, такие как экспоненциальное предположение^{распада 16 и} шум фильтрации с помощью функции волны^{были предложены 17}. Хотя считается, что такие исправления являются эффективными, они по-прежнему не столь просты для пользователей в целом, поскольку они требуют навыков программирования. Кроме того, при измерениях живых клеток диапазон установки должен определяться более тщательно, с тем чтобы значение чи-квадрата установленной кривой стало небольшим. Как показано на рисунке 2B, диапазон, где G (Я) был меньше 1 был исключен из диапазона установки. Кроме того, для анализа медленно диффузивных/движущихся молекул требуется больше фотостейблютных флуоресцентных тегов. GFP прост в использовании в качестве метки маркировки, и его стабильность хорошо, но это часто фотоотчет во время измерений FCS. Чтобы преодолеть это фотосборное свойство, HaloTag с тетраметилродамином (ПМР) в качестве химического флуоресцентного красителя^{было доступно 18}. Тем не менее, неполная маркировка флуоресцентными лигандами (например, ПМР-лиганд) и захваченными бассейнами красителей является проблематичными вопросами для конкретной маркировки белков, представляющих^{интерес 19;} таким образом, экзогенное выражение белка интереса, помеченного флуоресцентными белками, было бы первым выбором для флуоресцентной маркировки в живых клетках.

Есть много видов флуоресцентных белков, а также химических флуоресцентных красителей; однако, как показано в этой статье, мономерный расширенный GFP (meGFP) является простым в использовании тегом для FCS, а также другой флуоресцентной микроскопии, потому что его биохимические и флуоресцентные свойства хорошо известны. Таким образом, в наших исследованиях, MEGFP является первым выбором и обычно используется для обозначения агрегации подверженных белкам для измерений FCS^6,7,9.

У этих авторов нет конфликта интересов.

А.К. был поддержан Японского общества содействия науке (JSPS) Грант-в-помощи для научных исследований (C) (#18K06201), грант в помощь от Фонда Накатани по борьбе с новыми коронавирусных инфекций, грант от Университета Хоккайдо Управление по развитию будущих лидеров исследований (L-Station), а также грант в помощь от Hoansha Фонда. М.К. была частично поддержана грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Химия для многомолекулярных краудинговых биосистем" (#20H04686) и грантом JSPS по научным исследованиям инновационных областей "Информационная физика живых дел" (#20H05522).