Detecção de Agregação de Proteínas usando Espectroscopia de Correlação de Fluorescência

Aqui introduzimos um procedimento para medir oligômeros proteicos e agregação em células lisato celular e células vivas usando espectroscopia de correlação de fluorescência.

A agregação de proteínas é uma marca registrada de distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer (DA), Doença de Parkinson (DP), doença de Huntington (HD), e assim por diante. Para detectar e analisar oligômeros ou agregados de proteínas solúveis ou difusas, foi utilizada espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que pode detectar a velocidade de difusão e o brilho de uma única partícula com uma única sensibilidade de molécula. No entanto, o procedimento adequado e o know-how para a detecção de agregação de proteínas não foram amplamente compartilhados. Aqui, mostramos um procedimento padrão de medição de FCS para propriedades de difusão de proteínas propensas à agregação em células de lise celular e vivas: fragmento terminal de carboxíl de 25 kDa associado à ALS de tar DNA/RNA-binding protein 43 kDa (TDP25) e superóxido dismutase 1 (SOD1). Os resultados representativos mostram que uma parte dos agregados de TDP25 com proteína fluorescente verde (GFP) foi ligeiramente incluída na fração solúvel do neuroblastoma neuroblastoma neuroblastoma neuro2a lysate celular. Além disso, o SOD1 com marca GFP que carrega mutação associada à ELA mostra uma difusão mais lenta em células vivas. Assim, introduzimos aqui o procedimento para detectar a agregação de proteínas através de sua propriedade de difusão usando FCS.

Agregações proteicas envolvendo distúrbios neurodegenerativas como esclerose lateral amiotrófica (ELA), doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington, e assim por^{diante 1} são conhecidas por serem tóxicas e perturbariam a homeostase proteico (proteostase) nas células e órgãos, que poderiam então levar ao envelhecimento². Espera-se o desembaraço da agregação de proteínas como estratégia terapêutica; no entanto, produtos químicos que previnem a formação de agregação de proteínas e degradam agregados proteicos (por exemplo, pequenas moléculas ou drogas) ainda não foram estabelecidos. Além disso, como a agregação de proteínas exerce toxicidade permanece indescritível. Portanto, para promover projetos de pesquisa relacionados à agregação de proteínas, é importante introduzir procedimentos de alto rendimento para simplesmente detectar a agregação de proteínas. A detecção de agregação de proteínas usando anticorpos que reconhecem a conformação da agregação de proteínas e do corante fluorescente específico para agregação tem sido amplamente utilizada³. No entanto, é difícil detectar a agregação, especialmente em células vivas usando tais procedimentos clássicos.

A transferência de energia de ressonância förster (FRET) é um procedimento para detectar agregação de proteínas e mudanças estruturais. No entanto, o FRET é incapaz de analisar a dinâmica proteica (por exemplo, difusão e oligomerização da proteína em células vivas)³. Por isso, introduzimos aqui um protocolo simples para detectar a agregação de proteínas em solução (por exemplo, lisato celular) e células vivas utilizando espectroscopia de correlação de fluorescência (FCS), que mede a propriedade de difusão e brilho de moléculas fluorescentes com sensibilidade de molécula única⁴. FCS é um método de contagem de fótons usando um microscópio confocal de varredura a laser (LSM). Utilizando um detector de fótons altamente sensível e o cálculo da função de autocorrelação (ACF) do tempo de chegada do fóton, a passagem pelo tempo e brilho das moléculas fluorescentes no volume de detecção é medida. A difusão diminui com o aumento do peso molecular; assim, a interação intermolecular pode ser estimada usando FCS. Ainda mais fortemente, um aumento no brilho da molécula fluorescente indica homo-oligomerização das moléculas. Portanto, a FCS é uma ferramenta poderosa para detectar tal agregação de proteínas.

1. Materiais e reagentes

1. Use soluções livres pirogênicas e médias para cultura celular(Tabela 1).
2. Prepare soluções para o experimento bioquímico usando água ultrauso e use como DNase/RNase livre.
3. Selecione um FBS apropriado para a cultura celular com um processo de verificação de lotes. Uma vez que o lote selecionado da FBS muda regularmente, o catálogo e o número do lote para FBS não podem ser representados aqui.
4. DNA plasmídeo
   1. Prepare pmeGFP-N1⁵ para expressão monômero eGFP; pmeGFP-C1-TDP25⁶ para expressão GFP-TDP25; pmeGFP-N1-SOD1-G85R⁷ para expressão SOD1-G85R-GFP; e pCAGGS⁸ como portador.
      NOTA: meGFP é uma variante monomérica que carrega mutação A206K de GFP aprimorado (eGFP). TDP25 é um fragmento terminal C associado à ALS do TDP-43. SOD1-G85R é um mutante associado à ALS do SOD1.
5. Tensão celular
   1. Use células de neuroblastoma de murina Neuro2a.
      NOTA: As células Neuro2a têm alta eficiência de transfecção e proteínas exógenas altamente expressas. Para a expressão TDP25, são necessárias cepas de células com alta eficiência de expressão, como células Neuro2a ou HEK293. Nas células HeLa, o TDP25 não foi capaz de ser expresso eficientemente.

2. Cultura celular e transfecção

1. Prepare um prato plástico de 100 mm cultivando células Neuro2a semi-confluentemente em meio de crescimento normal.
   NOTA: É necessário incubar a 37 °C por aproximadamente 48-72 horas após a semeadura anterior até que a semi-confluência seja atingida.
2. Remova o meio.
3. Adicione 0,5 mL de solução trypsin-EDTA no prato de cultura celular e incuba-os a 37 °C por 1 min.
4. Adicione 9,5 mL de meio de crescimento normal no prato e suspenda as células separadas.
5. Usando o azul Trypan para manchar as células mortas, conte o número de células usando um contador de células ou manualmente. Em seguida, diluir as células em meio de cultura (1,0 × 10⁵/mL).
6. Adicione 2 mL de suspensão celular em uma antena plástica de 35 mm para lise celular ou uma antena de base de vidro para medição de células vivas.
7. Incubar o prato a 37 °C durante 1 dia.
8. Comece os preparativos a seguir 15 minutos antes do dia da transfecção.
9. Prepare dois tubos de 1,5 mL e adicione 100 μL de Opti-MEM I a cada tubo.
10. No primeiro tubo, misture 1,0 μg de DNA plasmídeo (Solução A). No segundo tubo, misture 2,5 μL de Lipofectamina 2000 (Solução B).
    NOTA: Para manter a eficiência da transfecção, mantenha a quantidade total de DNA a mesma. Para reduzir o nível de expressão para medição de FCS em células vivas, a quantidade fracionária de DNA plasmídeo para expressão proteica deve diminuir (por exemplo, 0,2 μg de pmeGFP-N1-SOD1-G85R e 0,8 μg de mistura pCAGGS). Além disso, mantenha a mesma razão entre o volume de Lipofectamina 2000 e a quantidade de DNA plasmídeo.
11. Misture suavemente a Solução A e a B adicionando um em cada tubo e, em seguida, incuba-o por 1 min à temperatura ambiente (Solução C).
12. Adicione a solução C ao meio de cultura; e incubar as células por 24 h a 37 °C.

3. Lise celular e troca média

1. Verifique a expressão GFP usando um microscópio de rotina.
2. Retire o meio no prato.
3. Adicione 2 mL de PBS a 25 °C para lavar o meio. Remova o PBS.
4. Coloque o prato em uma placa de alumínio em cima do gelo esmagado.
   NOTA: Usamos uma placa de alumínio de 1 mm de espessura cortada em uma loja de ferramentas de domingo ou comercialmente disponível como equipamento de laboratório.
5. Adicione 200 μL de tampão de lise a 4 °C. Agite o prato levemente para que o tampão seja distribuído uniformemente na parte inferior do prato.
6. Raspe o prato usando um raspador de células e recupere o lysate com detritos celulares não resolvidos em um novo tubo de 1,5 mL.
7. Centrifugar a solução a 20.400 x g por 5 minutos a 4 °C.
8. Recupere o supernante em um novo tubo de 1,5 mL e mantenha-o a 4 °C ou no gelo.
   NOTA: Não congele o lise.
9. Para medições de células vivas, substitua o meio antes da medição. Verifique o acessório da célula usando um microscópio de contraste de fase. Confirme a expressão usando um microscópio de fluorescência.

4. Calibração da espectroscopia de correlação da fluorescência (FCS)

1. Inicie o sistema e execute o software de operação. Ligue o Argon⁺ laser (458/477/488/514 nm). Estabilize o sistema pelo menos por 30 minutos.
2. Configurar o caminho óptico: Divisor de feixe principal: HFT488; Espelho dicroico: NFT600; Filtro de barreira de fluorescência: um filtro de passagem de banda 505-540 (BP505-540); Detector: fotodiodo de avalanche (APD)).
3. Defina o tamanho do orifício digitando diretamente o valor (66 μm; 1 unidade arejada).
4. Adicione a solução Rhodamine 6G (Rh6G) em um poço da câmara de vidro de cobertura no palco.
5. Adicione a água ultrauso de imersão no objetivo. Não use o óleo de imersão.
6. Coloque a câmara no palco do microscópio. Mova o palco para a posição apropriada.
7. Concentre-se na superfície superior do vidro medindo a luz dispersa da superfície do vidro. Depois de baixar a lente objetiva para a parte inferior, gire o botão de foco no sentido horário para ajustar.
   NOTA: Verifique a direção de giro do botão de foco porque é oposta entre as feitas no Japão e na Alemanha.
8. Levante o ponto focal 200 μm acima da superfície superior do vidro para observar o interior da solução.
9. Clique na taxa De contagem e monitore a taxa de contagem de fótons.
10. Aumente gradualmente o valor do tunable tunable acousto-óptico (AOTF) (por exemplo, transmissão a laser de excitação) de modo que o valor da taxa de contagem seja superior a 10 kHz.
11. Clique no Ajuste pinhole e abra o assistente de ajuste do orifício. Encontre a posição do orifício com o maior (pico) de fótons tanto no eixo x quanto no eixo y.
12. Gire o anel de correção da lente objetiva para que o valor de contagem por molécula (CPM) seja o mais alto.
    NOTA: Uma vez que a espessura do vidro de cobertura da câmara especificada aqui é de 0,12-0,17 mm, o anel de correção está em torno de seu mínimo ou apenas algumas voltas a partir dele, onde o CPM está no seu máximo.
13. Diminua gradualmente o valor aoTF para que o valor do CPM se torne de 2-3 kHz.
14. Adquira a função de correção automática (ACF) do Rh6G por 90 s.
15. Uma vez concluída a medição, clique em Encaixar para realizar a análise de encaixe da curva.
16. Selecione um modelo para difusão tridimensional (3D) de um componente com um estado trigêmeo.
    NOTA: O Rh6G é monodisperse e difuso de um componente com um estado trigêmeo.
17. Ajuste o tempo de início de montagem movendo a linha vermelha. Clique em encaixar tudo e verifique o desvio de ajuste. Após a realização do encaixe da curva, certifique-se de que o tempo de difusão (DT) e o parâmetro da estrutura (SP) estejam aproximadamente na faixa de 20-30 μs e 4-8, respectivamente.
18. Lembre-se do valor do parâmetro estrutural. Use o valor de SP para análise de encaixe de curva de todos os ACFs medidos no mesmo dia, sob as mesmas condições ópticas, e usando o mesmo tipo de prato de base de vidro ou conjunto de vidro de cobertura no estágio do microscópio.

5. Medição de FCS em lise celular

1. Prepare os lises celulares (veja acima).
2. Coloque o lise na câmara de vidro da tampa. Coloque uma tampa para evitar a secagem e a tampa do palco para sombreamento leve.
3. Defina a condição de aquisição, potência laser, tempo de medição e repetições.
4. Clique na taxa de contagem e ajuste o valor AOTF do laser para que o valor do CPM se torne superior a 1 kHz.
5. Realize uma medição de ensaio por 1 min. Verifique se o ACF calculado mostra uma amplitude positiva e uma decadência suave.
6. Realize a medição principal por 5 minutos.
   NOTA: O tempo total de medição é gradualmente aumentado até que a forma do ACF não mude mesmo que o tempo de medição seja aumentado.
7. Clique em Fit para realizar a análise de encaixe da curva.
8. Selecione um modelo para difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo. Lembre-se de digitar o valor de SP e alterar sua configuração para "Fixo" e não "Livre" antes de clicar em Encaixar tudo.
9. Exporte a tabela equipada como um arquivo de texto delimitado por guias.
10. Se necessário, exporte o registro de taxa ACF e Contagem como um arquivo de texto delimitado por guias.

6. Medição de FCS em células vivas

1. Substitua o meio por um novo antes da medição.
2. Use uma incubadora de estágio de calor. Coloque o prato de cultura celular no estágio do microscópio.
3. Confirme o foco e a posição usando o micrope confocal. Selecione a célula de medição. Amplie e ajuste a posição do celular. Adquira imagens de fluorescência de uma célula expressante por GFP usando o modo de velocidade de varredura lenta.
4. Selecione uma posição de medição fcs usando posição na seção "FCS".
5. Selecione pelo menos um ponto de medição FCS usando uma mira(Figura 1).
6. Meça o ACF por 1 min.
   NOTA: Como as proteínas fluorescentes tendem a ser fotobleachadas em células vivas devido ao movimento lento em comparação com a solução, o tempo de medição deve ser mínimo. É geralmente difícil obter ACF na célula tão suavemente quanto as medidas de solução, porque a medição prolongada levará à fotoblemação de proteínas fluorescentes.
7. Clique em Fit para realizar a análise de encaixe de curva usando um modelo para difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo.
   NOTA: Para medições de células vivas, um modelo de difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo seria melhor porque é empiricamente difícil diminuir o valor qui-quadrado com um modelo de difusão 3D de um componente devido à existência de vários componentes móveis na célula viva. Mas mesmo usando um modelo para difusão 3D de três componentes, os componentes de difusão geralmente não são separados em comparação com o uso do modelo para dois componentes.

Realizamos a medição fcs de GFP-TDP25 em lisesto celular e SOD1-G85R-GFP em células vivas. Em ambos os casos, foram capazes de ser adquiridas uma amplitude positiva e acfs suaves. Mostramos que uma parte do GFP-TDP25 expressa em células Neuro2a foi recuperada na fração solúvel sob a condição indicada⁶. Na fração solúvel do liseto celular, foram detectadas moléculas de fluorescência extremamente brilhantes no registro da taxa de contagem de fótons usando FCS (Figura 2A, topo, seta). Tais "picos (também chamados de estouro)" não foram observados em monômeros GFP e solução de corante fluorescente químico monodisperse, sugerindo que os picos indicam proteínas oligomericas⁹. A análise de montagem de curvas utilizando um modelo assumindo a difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo mostrou que as moléculas de difusão rápida (DT_Fast = 186 μs) eram ~90% e os 10% restantes eram de 2,3 ms(Figura 2A, inferior; e Tabela 2).

Durante a medição SOD1-G85R-GFP em células vivas, o registro da taxa de contagem de fótons mostrou uma diminuição gradual, sugerindo sua fotobleaching no volume de detecção (Figura 2B, topo). Embora a contribuição do fotobleaching tenha sido demonstrada em faixa superior a 1 s no ACF, observou-se amplitude positiva e decadência suave do ACF(Figura 2B, inferior). A análise de montagem de curvas utilizando um modelo assumindo a difusão 3D de dois componentes com um estado trigêmeo mostrou que as moléculas de difusão rápida (DT_Fast = 397 μs) foram ~93,4% e os 6,6% restantes foram de 12,3 ms(Tabela 2). A mutação ligada à ALS, G85R, no SOD1 não permitiu uma diferença dramática na propriedade de difusão em comparação com o tipo selvagem. No entanto, a inibição proteasome diminuiu a taxa de difusão apenas no mutante G85R de SOD1 no citoplasma⁷.

Figura 1: Imagem fluorescente confocal de células Neuro2a expressando SOD1-G85R-GFP.  Imagem fluorescente confocal de células Neuro2a expressando SOD1-G85R-GFP. A mira indica a posição de medição fcs no citoplasma. Barra = 10 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: Resultados típicos de FCS e curvas instaladas para as funções de correção automática. (A e B) Topo: Taxa de contagem de fótons registrada na faixa de tempo de medição FCS (linha Verde). Inferior: Funções de autocorrelação calculadas (ACFs; Linhas brutas e cinzentas) e curvas ACF equipadas usando um modelo para difusão tridimensional de dois componentes com um estado trigêmeo (Linhas Fit, magenta). G(τ) para eixo Y indica a amplitude de ACFs no momento τ sec. para eixo X. As linhas de pontos mostram pontos de início e fim de tempo adequados. Setas azuis escuras mostram o pico com proteínas extremamente brilhantes passando pelo volume de detecção (ou seja, oligômeros solúveis/agregados). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Tabela 1: Composições de soluções

Tabela 2: Valores típicos ajustados para as funções de autocorrelação
Os valores ajustados para as funções de autocorrelação são representados na Figura 2 usando um modelo para difusão tridimensional de dois componentes com um estado trigêmeo. As contagens por molécula (CPM), o tempo de difusão rápida e lenta (DT_Fast e DT_Slow, respectivamente) e seus componentes (componente Rápido e Lento) são representados.

Quanto à calibração do sistema antes das medições, devem ser utilizados os mesmos vidros utilizados para medir a amostra (por exemplo, a câmara de vidro de 8 poços para lise celular e a antena de base de vidro de 35 mm para células vivas). Devido à adsorção de Rh6G no vidro, sua concentração efetiva pode às vezes diminuir. Nesse caso, uma solução Rh6G altamente concentrada, como 1 μM, deve ser usada apenas para o ajuste do pinhole. Taxas de contagem de fótons extremamente altas devem ser evitadas para proteger o detector (por exemplo, mais de 1000 kHz). Além disso, a solução concentrada não é adequada para a aquisição da função de correção automática (manter menos de 100 kHz). A calibração da posição do orifício é importante. Se o sistema óptico é usado com frequência, é raro a luxação dramática do orifício; assim, usar "Fine" no início muitas vezes não é problema para encontrar a posição apropriada. Se não for encontrada uma posição máxima das taxas de contagem usando "Fine", use o "Grossarse" para mover o orifício de uma extremidade do intervalo de movimento para a outra antes da localização da posição usando "Fine". Se a amplitude do ACF foi plana, verifique se o foco e a posição são apropriados.

Após a medição do Rh6G e sua montagem, se o DT e/ou SP estiver fora da faixa indicada, tente re-tente o orifício e o ajuste do anel de correção. Quando ainda estiver fora do alcance, recomendamos entrar em contato com o suporte do fabricante, pois é provável devido à suspeita de deserção do sistema óptico. Utilizando o DT e SP medidos, além do conhecido coeficiente de difusão de Rh6G (414 μm^2/s)na água, a cintura efetiva do feixe pode ser calculada porque o DT depende da cintura do feixe¹⁰. Além disso, como o SP é a razão da cintura do feixe e a altura do volume de detecção efetivo, o volume de detecção pode ser calculado. O cálculo do volume é necessário para determinar a concentração absoluta. Mais descrição do princípio e solução de problemas durante a calibração também está disponível em protocolos como relatado anteriormente^11,12,13.

Alguns picos foram observados na medição fcs de GFP-TDP25 em lysate celular (Figura 2A, topo). Mostramos que tais picos foram observados na medição fcs de huntingtin propensa a agregados, incluindo repetições expandidas de poliglutamina rotuladas com GFP ou proteína fluorescente amarela (YFP) (HttQ78 e HttQ143)⁹; sugere assim oligômeros solúveis/agregados de GFP-TDP25 na fração solúvel do lysato celular. Mas tal população de pico era raro; assim, o ACF e seu resultado de ajuste de curvas podem não incluir uma contribuição importante de tais picos. Uma possível razão para apenas uma pequena quantidade de agregados sendo incluídos na fração solúvel é provável porque o TDP25 é altamente propenso à agregação e seus agregados são fracionados na fração insolúvel, como mostrado usando um fracionamento do lysato celular seguido pela detecção de manchas ocidentais⁶. Os fenômenos da tendência de recuperação à fração insolúvel da proteína propensa à agregação têm sido frequentemente observados^6,9. Tais oligômeros/agregados solúveis não podem ser facilmente detectados usando métodos bioquímicos convencionais, como o SDS-PAGE seguido de manchas ocidentais; assim, a FCS tem uma vantagem. No entanto, analisar multicomponidores usando FCS convencionais é difícil porque mede a população média. Mais procedimentos de desenvolvimento combinados com a análise não paramétrica bayesiana determinariam os multicomponimentos na amostra sem quaisquer suposições para os componentes¹⁴.

O tempo de difusão em células vivas foi relativamente lento em comparação com o lisecelular. Uma vez que a viscosidade na célula é conhecida por ser maior do que em soluções como PBS e tampão contendo detergente^15,o tempo de difusão em células vivas teoricamente fica 2,5-3 vezes maior. Devido a essa difusão lenta em células vivas comparando em solução, o fotobleaching de tags fluorescentes pode muitas vezes ser causado. Para corrigir o efeito fotobleaching nos ACFs, alguns procedimentos como a suposição de decadência exponencial¹⁶ e a filtragem de ruído usando a função wavelet foram propostos¹⁷. Embora tais correções sejam consideradas eficazes, ainda não tem sido tão simples para os usuários em geral porque requer habilidades de programação. Além disso, nas medições de células vivas, a faixa de montagem deve ser determinada com mais cuidado para que o valor qui-quadrado da curva montada se torne pequeno. Como mostrado na Figura 2B,a faixa em que G(τ) foi inferior a 1 foi excluída da faixa de montagem. Alternativamente, tags fluorescentes mais fotostíveis são necessárias para analisar moléculas de difusão/movimento lentas. O GFP é fácil de usar como etiqueta de rotulagem, e sua estabilidade é boa, mas muitas vezes é fotobleached durante as medições fcs. Para superar esta propriedade fototável, halotag com tetrametilrhodamina (TMR) como um corante fluorescente químico foi disponível¹⁸. No entanto, a rotulagem incompleta pelos ligantes fluorescentes (por exemplo, TMR-ligand) e piscinas de corantes presas são questões problemáticas para rotulagem específica de proteínas de interesse¹⁹; assim, a expressão exógena da proteína de interesse marcada com proteínas fluorescentes seria a primeira escolha para rotulagem fluorescente em células vivas.

Existem muitos tipos de proteínas fluorescentes, bem como corantes fluorescentes químicos; no entanto, como mostrado neste artigo, o GFP monomédico aprimorado (meGFP) é uma tag fácil de usar para FCS, bem como outras microscopia de fluorescência porque suas propriedades bioquímicas e fluorescência são bem conhecidas. Portanto, em nossos estudos, o meGFP é a primeira escolha e geralmente usado para rotular as proteínas propensas à agregação para as medidas de FCS^6,7,9.

Esses autores não têm conflitos de interesse.

A.K. foi apoiada por uma Sociedade Japonesa de Promoção da Ciência (JSPS) Grant-in-Aid for Scientific Research (C) (#18K06201), por uma subvenção da Fundação Nakatani para Contramedidas contra novas infecções por coronavírus, por uma bolsa do Escritório da Universidade de Hokkaido para o Desenvolvimento de Futuros Líderes de Pesquisa (L-Station), e uma subvenção da Fundação Hoansha. M. K. foi parcialmente apoiado por um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Chemistry for Multimolecular Crowding Biosystems" (#20H04686), e um JSPS Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas "Information physics of living matters" (#20H05522).