Визуализация ТОРС-КоВ-2 с использованием иммуноРНК-флуоресценции в гибридизации Ситус

Здесь мы описываем простой метод, который сочетает в себе РНК флуоресценции на месте гибридизации (РНК-ФИШ) с иммунофторесценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК. Этот протокол может повысить понимание молекулярных характеристик взаимодействий РНК-хозяина SARS-CoV-2 на одноклеточном уровне.

Эта рукопись содержит протокол для на месте гибридизации цепной реакции (HCR) в сочетании с иммунофлюоресценцией для визуализации тяжелой острой коронавируса респираторного синдрома 2 (SARS-CoV-2) РНК в клеточной линии и трехмерных (3D) культур эпителия дыхательных путей человека. Метод позволяет высокоспецифическую и чувствительную визуализацию вирусной РНК, опираясь на HCR, инициированный локализацией зонда. Сплит-инициатор зонды помогают усилить сигнал флуоресцентно помечены усилители, в результате чего незначительные фоновые флуоресценции в конфокальной микроскопии. Маркировка усилителей различными флуоресцентными красителями облегчает одновременное распознавание различных целей. Это, в свою очередь, позволяет картировать инфекцию в тканях, чтобы лучше понять вирусный патогенез и репликацию на одноклеточном уровне. Соединение этого метода с иммунофлуоресценцией может способствовать лучшему пониманию взаимодействий между принимающей вирусом, включая чередование эпигенома хозяина и путей иммунного ответа. Благодаря чувствительной и специфической технологии УВКБ этот протокол также может использоваться в качестве диагностического инструмента. Важно также помнить, что метод может быть легко изменен, чтобы позволить обнаружение любой РНК, в том числе некодирующих РНК и РНК вирусов, которые могут возникнуть в будущем.

ТОРС-КоВ-2 — новый бетакоронавирус человека, возникший в конце 2019 года, вызвав беспрецедентную пандемию несколько месяцев спустя. Поскольку вирус является новым для науки, большая часть его биологии и его влияние на клетки-хозяина остаются неизвестными. Таким образом, картирование вирус-клеток и ткани тропизма во время инфекции имеет важное значение, если его основные биологические характеристики и его влияние на хозяина должны быть поняты. Для изучения взаимодействия вирусов и принимающих вирусов используется несколько методов, включая биохимические, биологические и физические анализы. На месте гибридизации является распространенным методом, который использует помечены дополнительные ДНК, РНК, или модифицированные зонды нуклеиновой кислоты, которые локализуются в конкретных последовательностей ДНК или РНК в клетке или ткани.

Разработан новый метод гибридизации РНК на месте (RNA-FISH), который включает в себя модификации для повышения чувствительности путем усиления соотношения сигнала к шуму через^{HCR 1}. HCR позволяет изучать локализацию РНК на уровне одноклеточных. Благодаря высокой специфичности, чувствительности и разрешению этот метод полезен не только для фундаментальных научных исследований, но и для аппликативных проектов, например, диагностики. Недавно была продемонстрирована осуществимость этого метода для обнаружения РНК SARS-CoV-2, локализованной на цилиированных клетках в полностью дифференцированных 3D эпителия дыхательных путей человека (HAE)^{культур 2}. HaE культуры представляют собой один из самых передовых инструментов, используемых для изучения вирусной инфекции в контексте "естественной инфекции"^{микроокниронии 3,4}.

В нескольких докладах о коронавирусах человека (HCoV), в том числе ОРВИ-КоВ-2, подчеркивается важность эпигенетических модификаций в отношении инфекции HCoV и ^{патофизиологии (рассмотрена в 5,}например, метилирование модели гена, кодирующей ангиотензин-конвертирующий фермент 2 (ACE-2)^{рецептор 6,7}. Интересно, что масс-спектрометрический скрининг выявил несколько эпигенетических факторов, которые взаимодействуют с протеомом ТОРС-КоВ-2^8. В частности, неструктурный белок 5 (NSP5) связывается с эпигенетическим регулятором, дицетилазой 2 гистона 2, а каталитически неактивный NSP5 (C145A) взаимодействует с тРНК метилтрансферазой 1 (24). Кроме того, активность метилтрансферазы NSP16 блокируется ингибитором метилтрансферазы, синефунгином^9. Однако точная роль этих эпигенетических факторов в COVID-19 остается неясной. Репликация HCoV происходит в цитоплазме инфицированной клетки, и вызывает воспалительные реакции, которые регулируются эпигенетических модификаций¹⁰.

Например, HCoV-229E тонко настраивает ядерный фактор-каппа B сигнализации и глубоко перепрограммирует ландшафт хозяина клеточного хроматина за счет увеличения ацетилирования H3K36 и H4K5 в некоторых^{регионах 11}. Коронавирусная инфекция, связанная с ближневосточным респираторным синдромом, повышает уровень H3K27me3 и истощает H3K4me3 в промоутерской области подмножественно конкретных чувствительных к интерферону^{генов 12}. Кроме того, вирусная РНК вызывает иммунные реакции клеток, как попродемонстрировано^{для флавивирусов 13,ретровирусов 14,15}и^{коронавирусов 16.} Эпигенетические маркеры вирусной РНК могут играть определенную роль в распознавании клеточными датчиками, как показано на m7A метилировании вируса иммунодефицита человека-1^{РНК 17}. Тем не менее, остаются вопросы: Каково влияние SARS-CoV-2 РНК на иммунный ответ, и эпигенетические знаки участие?

Здесь описан оптимизированный метод РНК-ФИШ в сочетании с иммунофлуоресценцией клеточной линии и 3D тканей (полностью дифференцированный HAE). Хотя цитологические методы, такие как FISH и иммунофлуоресценция, широко используются, этот метод гибридизации на месте нового поколения, основанный на HCR, никогда не использовался для обнаружения вирусов (за исключением недавней^{публикации) 2}. В целом, иммуностай и FISH требуют следующих шагов: проницаемка для обеспечения проникновения зондов или антител; фиксация, при которой клеточный материал фиксируется и сохраняется; обнаружение, при котором применяются антитела или зонды нуклеиновой кислоты; и, наконец, монтаж образцов для визуализации.

Хотя существующие протоколы имеют общие характеристики, они заметно различаются по отношению к задействованным параметрам. Здесь был описан оптимизированный, простой, иммуно-РНК-FISH протокол для обнаружения SARS-CoV-2 РНК в культурах HAE и клетках Веро. Техника включает в себя следующие шаги: (1) фиксация клеток с параформальдегидом; (2) проницаемая с моющим средством или метанолом (MeOH); (3) регидратация через градуированные серии растворов MeOH (только культур HAE); (4) обнаружение; 5) усиление с использованием технологии УВК для обнаружения РНК ТОРС-КоВ-2; (6) иммуностимулятор; и (7) изображения под конфокальцентом.

1. Буферная подготовка

1. Для 500 мл 2x буфера PHEM, комбинат 18,14 гпиперазина-N,НО-бис(2-этанесульфоновая кислота) (PIPES), 6,5 г 4-(2-гидроксиэтил)-1 пиперазин этанесульфоновая кислота (HEPES), 3,8 г тетраакетической кислоты этиленгликоль (EGTA) и 0,99 г сульфата магния (MgSO_4). Сделайте объем до 400 мл с дистиллированной водой (dH₂O), перемешать, и настроить рН до 7,0 с помощью 10 М гидроксида калия (KOH) или гидроксида натрия (NaOH). Сделайте окончательный объем до 500 мл, а затем разделите на 50 мл aliquots. Хранить при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока требуется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер не будет ясен, пока рН не достигнет 7,0.
2. Подготовье опционное решение 37% w/v paraformaldehyde (PFA). Для 50 мл смешайте 18,5 г ПФА и 35 мл dH₂O в стеклянной бутылке. Поместите бутылку на магнитный мешалка с подогревом. Добавьте 900 МКЛ из 1 M KOH или NaOH и перемешайте, пока раствор не станет ясным. Дайте остыть и перенесите в коническую центрифугу 50 мл; до 50 мл с dH₂O. Решение может храниться при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока не потребуется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Формальдегид должен быть обработан в дымовой капот во время ношения защитных перчаток и лабораторного пальто.
3. Подготовьте буфер фиксации (3,7% PFA буфер с PHEM). Для 50 мл, объединить 5 мл 37% раствора PFA, 25 мл 2x буфера PHEM, и 20 мл dH₂O в 50 мл конической центрифуги трубки. Хранить при -20 градусов по Цельсию до тех пор, пока требуется.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После оттаивания буфер может храниться при 4 градусах Цельсия в течение 3 месяцев.
4. Подготовка PBST (0,1% Tween-20 в 1x фосфат-буферный солевой раствор (PBS). Для 50 мл добавьте 50 МКЛ 100% Tween-20 до 50 мл 1x PBS и хорошо перемешайте.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор может храниться при комнатной температуре (RT).
5. Подготовка регидратационных буферов путем объединения MeOH/PBST в соотношении 3:1, 1:1 и 1:3 (окончательный объем 100 мл каждого; см. таблицу 1).
   ПРИМЕЧАНИЕ: MeOH очень токсичны и легковоспламеняющиеся. Как это может повредить зрительный нерв, он должен быть обработан в дым капот избегая каких-либо открытого пламени. Поскольку смешивание MeOH и PBST генерирует экзотермическую реакцию, объединить растворы на льду.
6. Для 1000 мл 20x SSC, объединить 175,3 г хлорида натрия (NaCl) и 88,2 г цитрата натрия в стакане, и заполнить с 800 мл dH₂O. Перемешать до растворения, и настроить рН до 7,2 с помощью NaOH. Добавьте dH₂O к общей громкости 1000 мл, а также автоклав или фильтр через фильтр 0,22 мкм в автоклавную бутылку.
7. Для 50 мл 5x SSCT, объединить 12,5 мл 20x SSC буфера с 37,5 мл dH₂O, и добавить 50 йл 100% Tween-20. Хорошо перемешать.
8. Для 50 мл 50% 5x SSCT/50% PBST, объединить 25 мл 5x SSCT с 25 мл PBST.
9. Для 50 мл 2x SSC, объединить 5 мл 10x SSC буфера с 45 мл dH₂O. Mix хорошо.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Все буферы SSC должны храниться на RT в темноте.

2. Целевое определение, зонды и усилители

1. Используйте инструменты, доступные на веб-сайте производителя для разработки усилителей и зондов. Убедитесь, что зонды дополняют обратную нить ДНК гена SARS-CoV-2 N(дополнительная цифра 1).
2. Определите наилучший размер набора зонда (для визуализации достаточно набора из 20 зондов).
3. Установите усилители, используемые для обнаружения РНК цели.
   1. Используйте усилитель HCR B1 с маркировкой Alexa Fluor 647.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Усилитель HCR включает метастабийные шпильки HCR h1 и h2. Мультиплексные эксперименты могут быть разработаны с помощью этого протокола. Если это планируется, выберите другой усилитель HCR (B1, B2, ...) для каждой целевой РНК, которая будет изображена в пределах одного и того же образца (например, усилитель B1 для цели 1, усилитель B2 для цели 2, ...).

3. Клеточная культура и инфекция ТОРС-КоВ-2

1. Культура Веро (обезьяньи клетки эпителиальной почки) в модифицированной среде орла Дулбекко, содержащей 5% сыворотки крупного рогатого скота плода.
   1. Семя 50000 клеток на крышки (No 1, 15 × 15 мм) в 12-хорошо пластины.
2. Подготовка полностью дифференцированных культур^{HAE, как описано 18} на проницаемых Transwell вставки поддерживает с мембраной (диаметр 6,5 мм) и культуры в бронхиальной эпителиальной среды роста до полного слияния.
3. Вирусная инфекция
   1. Прививки клеток с ТОРС-CoV-2 при 1000x медианной культуре тканей инфекционной дозы (TCID₅₀) на мл
   2. Инкубационые клетки в течение 2 ч при 37 градусах Цельсия.
   3. Вымойте клетки дважды с PBS для удаления несвего вируса.
   4. Культурные клетки на 48 ч.

4. SARS-CoV-2 РНК-FISH в клетках Веро, обучигаемых на обложках

День 1

1. Фиксация и проницаемая ячейка
   1. Исправить инфицированные клетки с 3,7% ж / В PFA решение для 1 ч на RT.
   2. Аспирировать 3,7% раствор PFA, и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
   3. Перезагнировать клетки с раствором PBST в течение 10 минут на RT с агитацией.
   4. Аспирировать PBST, и мыть клетки дважды с 1x PBS.
2. обнаружение
   1. Аспирировать 1x PBS раствор, и мыть клетки дважды с 2x SSC на RT.
   2. Аспирировать 2x SSC решение, и предустановить образцы, добавив по крайней мере 300 йл буфера гибридизации зонда. Обложка скважин, содержащих клетки, и инкубировать при 37 градусов по Цельсию в течение 30 минут.
   3. Подготовьте решение зонда, добавив 1,2 пмоль смеси зонда в буфер гибридизации зонда.
      1. Используйте 1,2 МКЛ из запаса зонда 1 МКМ для подготовки 300 МКЛ рабочего запаса.
   4. Удалите раствор предгибридизации и перенесите крышки во увлажняемую камеру.
      1. Pipette 30-50 йл раствора зонда на парафильме для формирования отдельных капель.
   5. Инкубировать образцы на ночь (12-18 ч) при 37 градусах Цельсия.
      
      День 2
   6. Передача coverslips обратно в 12-хорошо пластины, и удалить избыток раствора зонда путем мытья в течение 4 х 5 мин с 400 йл буфера промывки зонда при 37 градусов по Цельсию.
      ПРИМЕЧАНИЕ: В качестве альтернативы размещению 30-50 мкл aliquots на парафильм и под крышками для инкубации, добавить 300 йл зонда решение непосредственно coverslips в 12-хорошо пластины. Эта процедура проще, но требует значительного количества реагентов. Нагрейте буфер промывки зонда до 37 градусов по Цельсию перед использованием. Рассчитайте необходимое количество буфера и перенесите его в коническую центрифугу 15 мл.
   7. Вымойте образцы в течение 2 х 5 мин с 5x SSCT на RT.
   8. Замените решение 5x SSCT на 1x PBS и храните образцы при 4 градусах Цельсия до усиления.
3. усиление
   1. Удалите раствор 1x PBS из скважин и добавьте по крайней мере 300 МЛ буфера усиления к каждой скважине. Инкубировать образцы в течение 30 мин на RT.
   2. Подготовь каждую ХБ волосяную вардину (h1 и h2) путем прихлопытить-охлаждение нужного объема в отдельных трубках.
      1. Для подготовки 300 МКЛ раствора усиления используйте 18 млн т каждого шпильки (например, для 300 йл, используйте 6 МКЛ из 3 мкм раствора шпильки запас).
      2. Перенесите раствор шпильки в трубки.
      3. Инкубационный при 95 градусов по Цельсию на 90 с.
      4. Охладить до RT в течение 30 минут в темноте.
   3. Подготовьте парикмахерскую смесь, добавив в буфер усиления шпильки с помощью шпильки "h1" и "h2".
   4. Поместите капли 30-50 л шпильки смеси на парафильм.
   5. Инкубировать образцы на ночь (12-18 ч) в темноте на RT.
      
      День 3
   6. Передача coverslips обратно в 12 хорошо пластины, и удалить избыток шпильки путем мытья в течение 5 х 5 мин с 5x SSCT на RT с волнением.
   7. Оспирировать 5x SSCT буфер, и заменить его на 1x PBS.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте образцы РНК-ФИШ в стандартном анализе иммунофлуоресценции, за которым следует окрашивание ядер (см. раздел 5).
4. Ядерное окрашивание и монтаж слайдов
   1. Аспирировать 1x PBS решение, и заменить его на 4 ',6-diamidino-2-фенилиндол (DAPI, 0,2 мкг / мл) в 1x PBS решение.
   2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
   3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
   4. Поместите две капли по 10 КЛ каждая из монтажной среды; обеспечить, чтобы капли были разделены достаточно, чтобы позволить разместить две крышки на одном слайде.
   5. Удалите избыток жидкости, нажав крышки на чистое полотенце, а затем поместить их в антифад монтажа среды с клетками лицом вниз.
   6. Поместите установленные образцы на сухую, плоскую поверхность в темноте и дайте им вылечиться.
   7. После лечения, печать края крышки с ГЕРК герметик или лак для ногтей, чтобы предотвратить образцы от высыхания.

5. ТОРС-КОВ-2 РНК-ФИШ в культурах HAE

День 1

1. Фиксация и пермеабилизация культуры HAE
   1. Аспирировать среду, и исправить инфицированных клеток с помощью 3,7% PFA решение для 1 ч на RT.
   2. Аспирировать 3,7% раствор PFA, и мыть клетки дважды с 1x PBS.
      1. Замените 3,7% решение PFA на 1x PBS под вставкой Transwell.
   3. Отбросьте PBS, и обезвоживать образцы с помощью 2 х 5 мин моет с 100% MeOH prechilled до -20 градусов по Цельсию.
   4. После второй стирки замените буфер свежим охлажденным MeOH для протеабилизации под вставкой Transwell. Хранить на ночь при -20 градусов по Цельсию.

День 2

2. Регидратации
   Регидратировать образцы через градуированную серию решений MeOH/PBST (каждый в течение 5 мин) на льду: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS и 100% PBST (дважды).
   1. Вымойте клетки в течение 5 мин на льду с 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Вымойте клетки в течение 5 минут на льду с 5x SSCT.
   3. Замените 5x буфер SSCT на 1x PBS.
3. обнаружение
   1. Инкубировать клетки (внутри вставки Transwell) в течение 5 минут на льду с 100 йл буфера гибридизации зонда. Затем перенесите пластину в инкубатор на 30 мин при 37 градусов по Цельсию (прегибридизация).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Буфер гибридизации зонда должен быть предварительно разогрет до 37 градусов по Цельсию перед использованием. Рассчитайте необходимый объем: для одной вставки Transwell необходимо 100 йл.
   2. Подготовь решение зонда. Как 1 мл зонда решение требует 4 pmol зонда, добавить 4 МКл 1 МК зонда фондового решения 1 мл буфера гибридизации зонда, и хорошо перемешать.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для обнаружения РНК используйте 100 МКЛ раствора зонда на вставку Transwell. Оставьте раствор зонда на льду до конца шага предгибридизации.
   3. Удалите решение для предохрибровки и добавьте решение зонда.
   4. Инкубировать клетки на ночь (12-18 ч) при 37 градусов по Цельсию.
      
      День 3
   5. Удалите избыточный зонд, стирая в течение 4 х 15 мин с 100 йл буфера промывки зонда при 37 градусов по Цельсию.
   6. Вымойте образцы в течение 2 х 5 мин с 5x SSCT на RT.
   7. Замените 5x SSCT на 1x PBS и храните образцы при 4 градусах Цельсия до усиления.
4. усиление
   1. Предварительно разочастить образцы, инкубируя их буфером усиления в течение 30 минут на RT.
   2. Подготовь каждую шпильки, захлопав нужные объемы в отдельных трубках.
      1. Для подготовки 500 МКЛ раствора усиления используйте 30 млн т каждого шпильки (например, для 500 йл, используйте 10 йл из 3 мкм раствора шпильки).
      2. Перенесите раствор шпильки в трубки.
      3. Инкубационный при 95 градусов по Цельсию на 90 с.
      4. Охладить до RT в течение 30 минут в темноте.
   3. Подготовьте решение шпильки, добавив все шпильки с оснастки до 500 йл буфера усиления на RT.
   4. Удалите предварительное решение для упрощения и добавьте полное решение для шпильки.
   5. Инкубировать образцы на ночь (12-18 ч) на RT в темноте.
   6. Удалите лишние шпильки при стирке с 5x SSCT на RT следующим образом: 2 х 5 мин, 2 х 15 мин, и 1 х 5 мин.
   7. Замените 5x SSCT раствор с 1x PBS, и хранить при 4 кк в течение не более 2-3 дней или перейти непосредственно к ядерному окрашивания.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При необходимости используйте образцы РНК-ФИШ в стандартном анализе иммунофлуоресценции с последующим ядерным окрашиванием (см. раздел 6).
5. Ядерное окрашивание и монтаж слайдов
   1. Аспирировать решение 1x PBS и заменить его раствором DAPI (0,2 мкг/мл) в 1x PBS.
   2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
   3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
   4. Поместите вырезанную мембрану из трансвелла на 10 МКЛ антифадной крепления среды с обращением клеток вверх и добавьте к мембране дополнительную монтажную среду (5 МЛ).
   5. Обложка мембраны с coverslips.
   6. Лечить установленные образцы на сухой, плоской поверхности в темноте.
   7. После лечения, печать края крышки с ГЕРК герметик или лак для ногтей, чтобы предотвратить образцы от высыхания.

6. Иммунофлуоресценция анализ клеток Веро и HAE культур

ПРИМЕЧАНИЕ: Выполните иммунофлуоресценции анализ на 3 день для клеточных линий или день 4 для культур HAE. Используйте другой подход для каждой модели. Все различия четко обозначены.

1. Аспирировать 1x PBS решение из скважин.
2. Блокируйте образцы путем инкубации с 1% w/v бычьего альбумин сыворотки в растворе PBST в течение 30 мин при 37 градусах Цельсия.
3. Подготовка первичных антител путем подготовки соответствующих разбавлений в блокирующий раствор, и инкубировать.
   1. Для клеток Vero на обложках:
      1. Поместите капли (30-50 л) раствора антитела на парафильм в камере влажности.
      2. Место coverslips на антитела капель с клетками лицом вниз.
   2. Для HAE замените блокирующий агент в вставке раствором антитела (100 МКЛ) и инкубировать образцы в увлажненной камере.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Отрегулируйте время и температуру для каждой инкубации с помощью первичного антитела. Типичные параметры 2 ч на RT или на ночь при 4 градусов по Цельсию.
4. Вымойте образцы в течение 3 х 5 мин с PBST.
   1. Для ячеек на крышках перенесите на пластину из 12 колодец и добавьте раствор PBST.
   2. Для культур HAE замените раствор антител раствором PBST.
5. Проверьте источники света и фильтры, доступные для конфокального микроскопа.
6. Выберите вторичные антитела в соответствии с видом хозяина. Выберите параметры фторфора (возбуждение и выброс длин волн, ширина спектра и эффективность возбуждения в зависимости от доступного источника света).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Спектральные параметры можно моделировать с помощью онлайн-инструментов (см. таблицу материалов).
7. Подготовьте соответствующие вторичные антитела, разбавляя их блокирующим раствором.
8. Инкубировать вторичными антителами (как в 6.3), но инкубировать в течение 1 ч при 37 градусов по Цельсию.
9. Вымойте образцы, как в шаге 6.4.
10. Ядерное окрашивание и монтаж слайдов
    1. Для ячеек на обложках
       1. Аспирировать PBST, и заменить его на DAPI (0,2 мкг / мл) в 1x PBS решение.
       2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
       3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
       4. Поместите крышки на капли 10 МКЛ монтажной среды с клетками лицом вниз.
       5. Печать крышки с лаком для ногтей.
    2. Для культур HAE
       1. Аспирировать 1x PBST, и заменить его на DAPI (0,2 мкг / мл) в 1x PBS решение.
       2. Инкубировать образцы в течение 10 минут на RT в темноте.
       3. Аспирировать раствор DAPI и мыть клетки дважды с помощью 1x PBS.
       4. Поместите вырез мембраны на капли 10 МКЛ монтажной среды с клетками, обращенные вверх, и добавить дополнительные (5 йл) монтаж среды к мембране.
       5. Обложка мембраны с coverslips.
       6. Печать крышки с лаком для ногтей.

7. Конфокальцавная микроскопия

1. Определите треки, указав используемые фторфоры.
2. Выберите режим сканирования и скорость.
3. Отрегулируйте мощность лазера, увеличение и компенсационые значения для каждого флюорофора, сравнивая их с соответствующими отрицательными контролями: для вирусов, макет-инфицированных клеток; для клеточных белков, образцы, окрашенные антителами контроля изотипа от соответствующего хозяина.
4. Чтобы получить 3D-изображение, активируйте режим z-stack и установите верхние и нижние пределы. Установите размер шага/число.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения более подробной информации о коронавирусной визуализации,^см.

Протокол иммуно-РНК-ФИШ, описанный в этой рукописи, был выполнен с использованием двух клеточных систем: клеточной линии Веро и 3D-культуры HAE. Основные шаги для обеих клеточных моделей показаны в таблице 2. Протокол РНК-ФИШ для визуализации SARS-CoV-2 в культурах HAE включает в себя шаги, которые характерны для образцов тканей, т.е. проницаемые со 100% MeOH и регидратации через градуированные серии MeOH-PBS и 0,1% Tween решений. Иммунофлюоресценция была выполнена после завершения РНК-ФИШ. Изображения в цтаке были приобретены и обработаны.

На рисунке 1 показан иммуноРНК FISH в макет-прививки контроля Vero клеток или клеток, инфицированных ТОРС-CoV-2. На рисунке 2 показан иммуноРНК FISH в макет-прививки контроля КУЛЬТУР HAE или культур, инфицированных ТОРС-CoV-2. Рисунок 3 показывает оптимизацию протокола протеабилизации в клетках Веро: 70% этанола в одночасье при -20 градусов по Цельсию или 0,1% Tween-20 в PBS в течение 5 мин в RT. Permeabilization с моющим средством приводит к четкому, конкретному сигналу для субгеномной РНК SARS-CoV-2, в то время как использование этанола приводит к размытому нецеленаправленному изображению.

Рисунок 1: Иммуно-РНК-ФИШ для обнаружения SARS-CoV-2 РНК β-тубулина в клетках Веро. Локализация подгеномной РНК ТОРС-КоВ-2 в(А)инфицированных и(В)инсценированных клетках Веро. Вирусная РНК была визуализирована FISH (красный). β-тубулин окрашивается антителами против мыши No5тубулин (1:100, ночная инкубация при 4 градусов по Цельсию) и с флюорофором Alexa 488-конъюгированных вторичных антител (1:400, 1 h инкубации на RT). Ядра были окрашены в DAPI (синий). Каждое изображение является единым конфокальные плоскости. Шкала бар 20 мкм. Аббревиатуры: ТОРС-КоВ-2 - тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2; FISH - флуоресценция в гибридизации на месте; ДАПИ 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Эпителиальные клетки дыхательных путей человека, инфицированные ТОРС-КоВ-2. Локализация субгеномной РНК ТОРС-КоВ-2 в(A)инфицированных и(B)макет-инкулированных культур HAE. Вирусная РНК была визуализирована FISH (красный). Цилиированные клетки визуализируются с помощью антител против мыши No5-тубулин (1:100, ночная инкубация при 4 градусов по Цельсию) и с помощью флюорофора Alexa 488-конъюгированных вторичных антител (1:400, 1 h инкубации на RT). Ядра были окрашены в DAPI (синий). Каждое изображение представляет собой максимальную проекцию, реконструированную из конфокальных стеков изображений (толщина 3 мкм). Шкала бар 10 мкм. Аббревиатуры: ТОРС-КоВ-2 - тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2; FISH - флуоресценция в гибридизации на месте; HAE - эпителий дыхательных путей человека; ДАПИ 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Оптимизация условий пермяки для клеток Веро. Пермеабилизация клеток Веро с (A) 70% этанола и (B) с 0,1% Tween-20 в PBS. Пермеабилизация с помощью моющего средства приводит к четкому конкретному сигналу для субгеномной РНК ТОРС-КоВ-2, в то время как этанол приводит к размытому изображению. Вирусная РНК показана красным цветом. Ядра были окрашены в DAPI (синий). Каждое изображение представляет собой максимальную проекцию, реконструированную из конфокальных стеков изображений (толщина 3 мкм). Шкала бар 10 мкм. Аббревиатуры: ТОРС-КоВ-2 - тяжелый острый респираторный синдром коронавирус 2; PBS - фосфатный буферный солевой раствор; ДАПИ 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Дополнительная цифра 1: SARS-CoV-2 N генная последовательность (5'-3')   Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.

Таблица 1: Подготовка градиентных метанолов/ПБСТ для регидратации. Для регидратации образцов эпителия дыхательных путей человека после ночной инкубации абсолютного метанола (MeOH) необходим медленный обмен окружающей средой. Для этого медленный обмен должен происходить путем инкубации с буферами, в которых пропорции MeOH и PBST (0,1% Tween-20 в 1x фосфат-буферный солевой раствор) меняются постепенно. Перечислены объемы реагентов, достаточные для подготовки 100 мл каждого раствора, достаточного для проведения нескольких экспериментов.

Таблица 2: Рабочий процесс протокола Immuno-RNA-FISH в клеточных линиях и культурах HAE. Иммуно-РНК-ФИШ осуществим в обеих клеточных моделях, но требует разных подходов. Показаны основные шаги, а также используемые буферы (в скобках), а затем продолжительность и температура инкубации. В несколько этапов для упрощения расчетов даются критические различия в объеме инкубационный реагент на выборку. Если объем не указан, он выбирается произвольно, так что он полностью покрывает образец (обычно 200 йл) с агитацией. Аббревиатуры: FISH - флуоресценция на месте гибридизации; HAE - эпителий дыхательных путей человека; ПФА и параформальдегид; ДАПИ 4,6-диамидино-2-фенилиндол; BSA - бычий альбумин сыворотки; PBS - фосфатный буферный солевой раствор; МеОХ и метанол.

Immuno-RNA-FISH является надежным методом двойного окрашивания РНК и клеточных белков. Здесь описан модифицированный иммуно-РНК-ФИШ протокол, который позволяет обнаруживать РНК ТОРС-КоВ-2 и клеточные белки в клеточных линиях и культурах HAE. Этот протокол может быть адаптирован для использования в различных моделях клеток, включая монослой клеток или конкретных тканей. Этот метод опирается на концепцию УВКБ, инициированную соответствующей локализацией зондов. Далее, использование сплит-инициатор зондов, чтобы начать усиление сигнала флуоресцентно помечены усилители приводит к минимальным до нет фоновой флуоресценции при наблюдении с помощью конфокального микроскопа. Усилители могут быть помечены различными флуоресцентными красителями и совместимы с различными зондами, предназначенными для распознавания различных целей; поэтому они могут использоваться одновременно. Процедуры, описанные в этом протоколе, просты, но ото дня (3-4 дня). Тем не менее, результаты характеризуются низким соотношением шума к сигналу, в отличие от других протоколов, которые используют непосредственно помеченные флуоресцентные зонды.

Здесь использовались веро-клетки и культуры HAE. Различные протоколы необходимы для клеток на крышке и клеток в культуре тканей. Большинство различий встречаются при обработке клеток (будь то на крышке или мембране) и количество используемого материала. Общие протоколы РНК-ФИШ требуют пермеабилизации с использованием растворов этанола или метанола, а также ночной инкубации при -20 градусов по Цельсию. Важно отметить, что использование моющего средства для протеабилизации более полезно для иммунофлуоресценции, сокращает процедуру на 1 день и позволяет более эффективно планировать эксперимент. Основной подход заключается в том, чтобы следовать общим протоколам, связанным с проницаемой с алкоголем или моющим средством, чтобы увидеть, если какие-либо нежелательные последствия были заметны. Важно отметить, что ночная проницаемка клеток Веро с 70% этаноловым раствором привела к неспецифическому, размытому сигналу; напротив, протеабилизация с Tween20 позволила четко и специфическо визуализировать РНК SARS-CoV-2 и сократила протокол на 1 день(рисунок 3).

Тот же подход был опробован на культурах HAE после ночной инкубации с абсолютным метанолом при -20 градусов по Цельсию (согласно общим протоколам РНК-ФИШ для образцов тканей) и 0,1% Tween20 в течение 5 минут на RT. Инкубация с Tween20 привела к неспецифическому сигналу, который дисквалифицирует этот реагент (данные не показаны). Ночная инкубация метанолом привела к весьма специфическому сигналу без артефактов. Важно отметить, что отслоение мембраны Трансвелл наблюдалось из-за того, что метанол растворил клей. Эта проблема была решена путем отсоединения мембраны и продолжения протокола coverslip. Классические процедуры РНК-ФИШ используют протеиназу K для повышения чувствительности, так как это удаляет белки и очищает РНК-белковые комплексы, делая клетки проворными для химических веществ и красителей. Настоящий протокол опустил этот шаг, как протеиназа K предотвращает окрашивание белка. Никаких различий в чувствительности РНК-ФИС при отсутствии протеиназы K (данные не показаны) не наблюдалось.

Выполнение иммунофлуоресценции анализов после РНК-FISH не влияет на сигнал РНК и привело к успешному сочетанию обоих методов. Таким образом, полный протокол представляет собой удобный способ визуализации РНК и ее взаимодействия с белками на одноклеточном уровне. Следует отметить, что фиксация клеток (необходимая для иммуно-РНК-ФИШ) не позволяет покадровых экспериментам изучать динамические события на одноклеточном уровне. Визуализация РНК ТОРС-КоВ-2 позволяет проводить анализ репликации ТОРС-КоВ-2 в клетке и, в сочетании с иммунофлюоресценцией, позволяет изучать внутриклеточные взаимодействия РНК/хозяина ТОРС-2, включая взаимодействие с эпигеномом. Наконец, этот протокол имеет широкий спектр применений, включая обнаружение ТОРС-КоВ-2 и других возникающих вирусов в одноклеточном разрешении. Благодаря чувствительной и специфической технологии HCR, он также может быть использован в качестве диагностического инструмента.

У авторов нет конфликта интересов, чтобы заявить.

Эта работа была поддержана Министерством науки и высшего образования для исследований ПО ТОРС-КоВ-2, а также грантами Национального научного центра (гранты UMO2017/27/B/N'6/02488 К.П. и УМО-2018/30/E/N'1/00874 К.К.-П.).