Visualisierung von SARS-CoV-2 mit Immuno-RNA-Fluoreszenz in situ Hybridisierung

Hier beschreiben wir eine einfache Methode, die RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierung (RNA-FISH) mit Immunfluoreszenz kombiniert, um schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA zu visualisieren. Dieses Protokoll kann das Verständnis der molekularen Eigenschaften von SARS-CoV-2 RNA-Host-Wechselwirkungen auf einzelliger Ebene erhöhen.

Dieses Manuskript enthält ein Protokoll für die In-situ-Hybridisierungs-Kettenreaktion (HCR) in Verbindung mit Immunfluoreszenz zur Visualisierung des schweren akuten Atemwegssyndroms Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) RNA in Zelllinie und dreidimensionalen (3D) Kulturen des menschlichen Atemwegsepithels. Die Methode ermöglicht eine hochspezifische und sensible Visualisierung viraler RNA, indem sie sich auf HCR stützt, die durch Diesonlokalisierung initiiert werden. Split-Initiator-Sonden helfen, das Signal durch fluoreszierend markierte Verstärker zu verstärken, was zu einer vernachlässigbaren Hintergrundfluoreszenz in der konfokalen Mikroskopie führt. Etikettierverstärker mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen erleichtern die gleichzeitige Erkennung verschiedener Targets. Dies wiederum ermöglicht die Kartierung der Infektion in Geweben, um die virale Pathogenese und Replikation auf einzelzellarer Ebene besser zu verstehen. Die Kopplung dieser Methode mit der Immunfluoreszenz kann ein besseres Verständnis der Wirts-Virus-Wechselwirkungen erleichtern, einschließlich einer Abwechslung des Wirtsepigenoms und der Immunantwortwege. Dank der sensiblen und spezifischen HCR-Technologie kann dieses Protokoll auch als Diagnosetool verwendet werden. Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Technik leicht modifiziert werden kann, um den Nachweis von RNA zu ermöglichen, einschließlich nicht-kodierender RNAs und RNA-Viren, die in der Zukunft entstehen könnten.

SARS-CoV-2 ist ein neuartiges humanes Betacoronavirus, das Ende 2019 auftauchte und wenige Monate später eine beispiellose Pandemie verursachte. Da das Virus neu in der Wissenschaft ist, bleibt ein Großteil seiner Biologie und seiner Auswirkungen auf Wirtszellen unbekannt. Daher ist die Kartierung der Virus-Zell- und -Gewebetropismus während der Infektion wichtig, wenn ihre grundlegenden biologischen Eigenschaften und ihre Auswirkungen auf den Wirt zu verstehen sind. Mehrere Techniken werden verwendet, um das Zusammenspiel von Virus-Host zu untersuchen, einschließlich biochemischer, biologischer und physikalischer Assays. In-situ-Hybridisierung ist eine gängige Methode, die markierte komplementäre DNA,RNA oder modifizierte Nukleinsäuresonden verwendet, die sich auf bestimmte DNA- oder RNA-Sequenzen in einer Zelle oder einem Gewebe lokalisieren.

Es wurde eine neue RNA-Fluoreszenz-In-situ-Hybridisierungsmethode (RNA-FISH) entwickelt, die Modifikationen zur Erhöhung der Empfindlichkeit durch Verstärkung des Signal-Rausch-Verhältnisses über ein HCR¹enthält. HCR ermöglicht die Untersuchung der RNA-Lokalisierung auf einzelliger Ebene. Aufgrund ihrer hohen Spezifität, Empfindlichkeit und Auflösung ist diese Methode nicht nur für wissenschaftliche Grundlagenstudien nützlich, sondern auch für Applikationsprojekte, z. B. Diagnostik. Kürzlich wurde die Machbarkeit dieser Methode für den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA demonstriert, die lokalisiert ist, um Ciliated-Zellen in vollständig differenzierten 3D-Human-Atemwegsepithel-Kulturen (HAE)-Kulturen². HAE-Kulturen stellen eines der fortschrittlichsten Werkzeuge zur Untersuchung von Virusinfektionen im Kontext der Mikroumgebung "natürliche Infektion"^3,4dar.

Mehrere Berichte über humane Coronaviren (HCoV), einschließlich SARS-CoV-2, unterstreichen die Bedeutung epigenetischer Modifikationen in Bezug auf HCoV-Infektion und Pathophysiologie [überprüft in ⁵], z. B. das Methylierungsmuster des Gens, das das Angiotensin-convertierende Enzym 2 (ACE-2)-Rezeptor^6,7kodiert. Interessanterweise identifizierte das massenspektrometrische Screening mehrere epigenetische Faktoren, die mit dem SARS-CoV-2-Proteom⁸interagieren. Genauer gesagt bindet das nichtstrukturelle Protein 5 (NSP5) an den epigenetischen Regulator, Histondeacetylase 2, und das katalytisch inaktive NSP5 (C145A) interagiert mit tRNA-Methyltransferase 1 (24). Zusätzlich wird die NSP16-Methyltransferase-Aktivität durch den Methyltransferase-Inhibitor Sinefungin⁹blockiert. Die genaue Rolle dieser epigenetischen Faktoren bei COVID-19 bleibt jedoch unklar. Die Replikation von HCoV erfolgt im Zytoplasma der infizierten Zelle und löst Entzündungsreaktionen aus, die durch epigenetische Modifikationen reguliert werden¹⁰.

Zum Beispiel verfeinert HCoV-229E die Atomfaktor-Kappa B-Signalisierung und programmiert die hostzelluläre Chromatinlandschaft tiefgreifend um, indem die Acetylierung von H3K36 und H4K5 in bestimmten Regionen erhöht wird¹¹. Die mit dem Middle East respiratorische Syndrom zusammenhängende Coronavirus-Infektion erhöht den Gehalt an H3K27me3 und erschöpft H3K4me3 in den Promotorregionen von Teilmengen spezifischer interferonempfindlicher Gene¹². Zusätzlich löst virale RNA Immunreaktionen aus, wie bei den Flaviviren¹³, Retroviren^14,15und Coronaviren¹⁶nachgewiesen. Die epigenetischen Marker auf viraler RNA können eine Rolle bei der Erkennung durch zelluläre Sensoren spielen, wie für die m7A-Methylierung des humanen Immundefizienzvirus-1-RNA¹⁷gezeigt. Es bleiben jedoch Fragen: Welche Auswirkungen hat SARS-CoV-2 RNA auf die Immunantwort, und sind epigenetische Markierungen beteiligt?

Hier wurde eine optimierte RNA-FISH-Methode in Verbindung mit der Immunfluoreszenzanalyse von Zelllinien und 3D-Geweben (voll differenzierte se) beschrieben. Obwohl zytologische Methoden wie FISH und Immunfluoreszenz weit verbreitet sind, wurde diese auf HCR basierende In-situ-Hybridisierungsmethode der neuen Generation nie für den Virennachweis verwendet (außer in einer kürzlich veröffentlichten Publikation)². Im Allgemeinen erfordern Immunfärbung und FISH die folgenden Schritte: Permeabilisierung, um das Eindringen von Sonden oder Antikörpern zu ermöglichen; Fixierung, bei der zelluläres Material fixiert und konserviert wird; Nachweis, bei dem Antikörper oder Nukleinsäuresonden aufgetragen werden; und schließlich Montage der Proben zur Visualisierung.

Obwohl bestehende Protokolle diese allgemeinen Funktionen gemeinsam nutzen, unterscheiden sie sich in Bezug auf die beteiligten Parameter deutlich. Hier wurde ein optimiertes, einfaches Immun-RNA-FISH-Protokoll zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA in HAE-Kulturen und Vero-Zellen beschrieben. Die Technik umfasst die folgenden Schritte: (1) Fixierung von Zellen mit Paraformaldehyd; (2) Permeabilisation mit Waschmittel oder Methanol (MeOH); (3) Rehydratation durch eine abgestufte Reihe von MeOH-Lösungen (nur HAE-Kulturen); (4) Erkennung; (5) Amplifikation mit HCR-Technologie zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA; (6) Immunfärbung; und (7) Bildgebung unter einem konfokalen Mikroskop.

1. Puffervorbereitung

1. Für 500 ml 2x PHEM-Puffer 18,14 g Piperazin-N,N-Bis(2-Ethansulfonsäure) (PIPES), 6,5 g 4-(2-hydroxyethyl)-1-Piperazin-Ethansulfonsäure (HEPES), 3,8 g Ethylenglykoltetraessigsäure (EGTA) und 0,99 g Magnesiumsulfat (MgSO₄) kombinieren Machen Sie das Volumen bis zu 400 ml mit destilliertem Wasser (dH₂O), rühren sie und stellen Sie den pH-Wert mit 10 M Kaliumhydroxid (KOH) oder Natriumhydroxid (NaOH) auf 7,0 ein. Machen Sie das Endvolumen bis zu 500 ml, und dann in 50 ml Aliquots aufgeteilt. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich.
   HINWEIS: Der Puffer ist erst klar, wenn der pH-Wert 7,0 erreicht.
2. Bereiten Sie eine Lagerlösung von 37% w/v Paraformaldehyd (PFA) vor. Für 50 ml 18,5 g PFA und 35 ml dH₂O in einer Glasflasche mischen. Legen Sie die Flasche auf einen Magnetischen Rührer mit Heizung. Fügen Sie 900 L von 1 M KOH oder NaOH hinzu und rühren Sie, bis die Lösung klar wird. Abkühlen lassen und in ein 50 ml kegelförmiges Zentrifugenrohr geben; aufladen bis zu 50 ml mit dH₂O. Die Lösung kann bei -20 °C gelagert werden, bis erforderlich.
   HINWEIS: Formaldehyd sollte in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, während Schutzhandschuhe und ein Labormantel getragen werden.
3. Vorbereiten des Fixationspuffers (3,7 % PFA gepuffert mit PHEM). Für 50 ml 5 ml 5 ml 37% PFA-Lösung, 25 ml 2x PHEM-Puffer und 20 ml dH₂O in einem 50 ml konischen Zentrifugenrohr kombinieren. Bei -20 °C lagern, bis erforderlich.
   HINWEIS: Nach dem Auftauen kann der Puffer bis zu 3 Monate bei 4 °C gelagert werden.
4. PBST vorbereiten (0,1% Tween-20 in 1x Phosphat-gepufferter Saline [PBS]). Für 50 ml 50 l von 100 % Tween-20 bis 50 ml 1x PBS hinzufügen und gut mischen.
   HINWEIS: Die Lösung kann bei Raumtemperatur (RT) gelagert werden.
5. Bereiten Sie Rehydrierungspuffer vor, indem Sie MeOH/PBST in Verhältnissen von 3:1, 1:1 und 1:3 kombinieren (Endvolumen von jeweils 100 ml; siehe Tabelle 1).
   HINWEIS: MeOH ist sehr giftig und brennbar. Da es den Sehnerv beschädigen kann, sollte es in einer Dunstabzugshaube behandelt werden, um offene Flammen zu vermeiden. Da das Mischen von MeOH und PBST eine exotherme Reaktion erzeugt, kombinieren Sie die Lösungen auf Eis.
6. Für 1000 ml 20x SSC 175,3 g Natriumchlorid (NaCl) und 88,2 g Natriumcitrat in einem Becher glasieren und mit 800 ml dH₂O. rühren, bis es gelöst ist, und den pH-Wert mit NaOH auf 7,2 einstellen. Fügen Sie dH₂O zu einem Gesamtvolumen von 1000 ml hinzu und autoklavieren oder filtern Sie durch einen 0,22 m Filter in eine autoklavierte Flasche.
7. Für 50 ml 5x SSCT 12,5 ml 20x SSC-Puffer mit 37,5 ml dH₂O kombinieren und 50 l von 100% Tween-20 hinzufügen. Gut mischen.
8. Für 50 ml 50% 5x SSCT/50% PBST, kombinieren 25 ml 5x SSCT mit 25 ml PBST.
9. Für 50 ml 2x SSC 5 ml 10x SSC Puffer mit 45 ml dH₂O mischen gut kombinieren.
   HINWEIS: Alle SSC-Puffer sollten bei RT im Dunkeln gespeichert werden.

2. Zieldefinition, Sonden und Verstärker

1. Verwenden Sie die auf der Website des Herstellers verfügbaren Tools, um Verstärker und Sonden zu entwerfen. Stellen Sie sicher, dass die Sonden den umgekehrten DNA-Strang des SARS-CoV-2 N-Gens ergänzen (Ergänzende Abbildung 1).
2. Bestimmen Sie die beste Sondensatzgröße (ein Satz von 20 Prüfstons ist für die Visualisierung ausreichend).
3. Stellen Sie die Verstärker ein, die für die Ziel-RNA-Erkennung verwendet werden.
   1. Verwenden Sie den HCR-Verstärker B1 mit Alexa Fluor 647 beschriftet.
      HINWEIS: Ein HCR-Verstärker besteht aus metastabilen HCR-Haarnadeln h1 und h2. Multiplex-Experimente können mit diesem Protokoll entwickelt werden. Wenn dies geplant ist, wählen Sie einen anderen HCR-Verstärker (B1, B2, ...) für jede Ziel-RNA, die innerhalb derselben Probe abgebildet werden soll (z. B. Verstärker B1 für Ziel 1, Verstärker B2 für Ziel 2, ...).

3. Zellkultur und Infektion mit SARS-CoV-2

1. Kultur Vero (Affennierenepithelzellen) Zellen in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium, das 5% fetales Rinderserum enthält.
   1. Säen Sie 50.000 Zellen auf Deckscheiben (Nr. 1, 15 × 15 mm) in einer 12-Well-Platte.
2. Bereiten Sie vollständig differenzierte HAE-Kulturen wie beschrieben¹⁸ auf durchlässigen Transwell-Insert-Stützen mit einer Membran (Durchmesser = 6,5 mm) und Kultur in bronchialen epithelialen Wachstumsmedium bis vollständig konfluent.
3. Virusinfektion
   1. Impfzellen mit SARS-CoV-2 bei 1000x mittlerer Gewebekultur-Infektiöse Dosis (TCID₅₀) pro ml
   2. Inkubieren Sie Zellen für 2 h bei 37 °C.
   3. Waschen Sie Zellen zweimal mit PBS, um ungebundene Viren zu entfernen.
   4. Kulturzellen für 48 h.

4. SARS-CoV-2 RNA-FISH in Vero-Zellen auf Deckellips kultiviert

TAG 1

1. Fixierung und Permeabilisierung von Zellen
   1. Fix infizierte Zellen mit 3.7% w/v PFA-Lösung für 1 h bei RT.
   2. Saugen Sie die 3,7% PFA-Lösung an und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
   3. Permeabilisieren Sie die Zellen mit PBST-Lösung für 10 min bei RT mit Agitation.
   4. Aspirieren Sie die PBST, und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
2. Erkennung
   1. Die 1x PBS-Lösung aspirieren und die Zellen zweimal mit 2x SSC bei RT waschen.
   2. Aspirieren Sie die 2x SSC-Lösung, und prähybridisieren Sie die Samples, indem Sie mindestens 300 L Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen. Bedecken Sie die Brunnen, die die Zellen enthalten, und inkubieren Sie bei 37 °C für 30 min.
   3. Bereiten Sie die Sondenlösung vor, indem Sie dem Sondenhybridisierungspuffer 1,2 pmol Sondenmischung hinzufügen.
      1. Verwenden Sie 1,2 l des 1-M-Sondenbestands, um 300 L Arbeitsbestand vorzubereiten.
   4. Entfernen Sie die Vorhybridisierungslösung, und übertragen Sie die Abdeckungen in eine befeuchtete Kammer.
      1. Pipette 30-50 l der Sondenlösung auf Parafilm, um einzelne Tröpfchen zu bilden.
   5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei 37 °C.
      
      TAG 2
   6. Die Abdeckungen wieder in eine 12-Well-Platte geben und überschüssige Sondenlösung entfernen, indem Sie 4 x 5 min mit 400 l Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
      ANMERKUNG: Als Alternative zur Platzierung von 30-50 l Aliquots auf Parafilm und unter Deckscheiben für die Inkubation, fügen Sie 300 l Sondenlösung direkt zu Denlips in einer 12-Well-Platte hinzu. Dieses Verfahren ist einfacher, erfordert aber erhebliche Mengen an Reagenzien. Den Sondenwaschpuffer vor Gebrauch auf 37 °C erhitzen. Berechnen Sie die benötigte Puffermenge, und übertragen Sie sie in ein 15 ml konisches Zentrifugenrohr.
   7. Proben für 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT waschen.
   8. Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS, und lagern Sie die Proben bei 4 °C bis zur Verstärkung.
3. Verstärkung
   1. Entfernen Sie die 1x PBS-Lösung aus den Brunnen, und fügen Sie jedem Bohrspeicher mindestens 300 L Verstärkungspuffer hinzu. Inkubieren Sie die Proben für 30 min bei RT.
   2. Bereiten Sie jede HCR-Haarnadel (h1 und h2) vor, indem Sie das gewünschte Volumen in separaten Rohren abkühlen.
      1. Um 300 l Amplifikationslösung vorzubereiten, verwenden Sie 18 pmol jeder Haarnadel (z. B. für 300 l, verwenden Sie 6 l einer 3-M-Stammhaarnadellösung).
      2. Übertragen Sie die Haarnadellösung in Tuben.
      3. Bei 95 °C für 90 s inkubieren.
      4. Abkühlen auf RT für 30 min im Dunkeln.
   3. Bereiten Sie eine Haarnadelmischung vor, indem Sie dem Amplifikationspuffer die snap-gekühlten Haarnadeln "h1" und "h2" hinzufügen.
   4. Tropfen von 30-50 l Haarnadelmischung auf Parafilm legen.
   5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) im Dunkeln bei RT.
      
      TAG 3
   6. Übertragen Sie die Abdeckungen zurück in die 12 Well Platte, und entfernen Sie überschüssige Haarnadeln durch Waschen für 5 x 5 min mit 5x SSCT bei RT mit Rührung.
   7. Aspirieren Sie den 5x SSCT-Puffer und ersetzen Sie ihn durch 1x PBS.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenztest, gefolgt von der Färbung von Kernen (siehe Abschnitt 5).
4. Nukleare Färbung und Gleitmontage
   1. Die 1x PBS-Lösung aspirieren und in 1x PBS-Lösung durch 4x,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI, 0,2 g/ml) ersetzen.
   2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
   3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
   4. Legen Sie zwei Tropfen von je 10 L DesMontagemedium; Stellen Sie sicher, dass die Tropfen so weit voneinander getrennt sind, dass zwei Abdeckungen auf einem einzigen Dia platziert werden können.
   5. Entfernen Sie überschüssige Flüssigkeit, indem Sie die Abdeckungen auf ein sauberes Handtuch tippen, und legen Sie sie dann in Antifade-Montagemedium mit den Zellen nach unten.
   6. Die montierten Proben auf eine trockene, flache Oberfläche im Dunkeln stellen und aushärten lassen.
   7. Nach der Aushärtung die Kanten der Abdeckungen mit VALAP-Dichtstoff oder Nagellack versiegeln, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.

5. SARS-CoV-2 RNA-FISH in HAE-Kulturen

TAG 1

1. Fixierung und Durchlässigkeit der HAE-Kultur
   1. Aspirieren Sie das Medium, und fixieren Sie die infizierten Zellen mit 3,7% PFA-Lösung für 1 h bei RT.
   2. Die 3,7%-PFA-Lösung ansaugen und die Zellen zweimal mit 1x PBS waschen.
      1. Ersetzen Sie die 3,7% PFA-Lösung durch 1x PBS unter einem Transwell-Einsatz.
   3. Entsorgen Sie die PBS, und dehydrieren Sie die Proben mit 2 x 5 min Wähwürn mit 100% MeOH vorgekühlt auf -20 °C.
   4. Nach der zweiten Wäsche den Puffer durch frisches, gekühltes MeOH zur Permeabilisierung unter dem Transwell-Einsatz ersetzen. Über Nacht bei -20 °C lagern.

TAG 2

2. Rehydration
   Rehydratisieren Sie die Proben durch eine abgestufte Reihe von MeOH/PBST-Lösungen (jeweils für 5 min) auf Eis: 75% MeOH/25% PBST, 50% MeOH/50% PBST, 25% MeOH/75% PBTS und 100% PBST (zweimal).
   1. Waschen Sie die Zellen für 5 min auf Eis mit 50% 5x SSCT/50% PBST.
   2. Waschen Sie Zellen für 5 min auf Eis mit 5x SSCT.
   3. Ersetzen Sie den 5x SSCT-Puffer durch 1x PBS.
3. Erkennung
   1. Inkubieren Sie die Zellen (innerhalb des Transwell-Einsatzes) für 5 min auf Eis mit 100 l Sondenhybridisierungspuffer. Als nächstes übertragen Sie die Platte für 30 min bei 37 °C (Vorhybridisierung) in den Inkubator.
      HINWEIS: Der Sondenhybridisierungspuffer muss vor Gebrauch auf 37 °C vorgeheizt werden. Berechnen Sie das benötigte Volumen: Für einen einzelnen Transwell-Einsatz werden 100 l benötigt.
   2. Bereiten Sie die Prüfpunktlösung vor. Da 1 ml Sondenlösung 4 pmol Sonde benötigt, 4 L von 1 'M Sondenlagerlösung zu 1 ml Sondenhybridisierungspuffer hinzufügen und gut mischen.
      HINWEIS: Für die RNA-Erkennung verwenden Sie 100 L Sondenlösung pro Transwell-Einsatz. Lassen Sie die Sondenlösung bis zum Ende des Vorhybridisierungsschritts auf Eis.
   3. Entfernen Sie die Prähybridisierungslösung, und fügen Sie die Prüfpunktlösung hinzu.
   4. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht (12-18 h) bei 37 °C.
      
      TAG 3
   5. Überschüssige Sonde entfernen, indem Sie 4 x 15 min mit 100 l Sondenwaschpuffer bei 37 °C waschen.
   6. Waschen Sie die Proben für 2 x 5 min mit 5x SSCT bei RT.
   7. Ersetzen Sie den 5x SSCT durch 1x PBS, und lagern Sie die Proben bei 4 °C bis zur Verstärkung.
4. Verstärkung
   1. Präamplify die Proben durch Inkubation mit Verstärkungspuffer für 30 min bei RT.
   2. Bereiten Sie jede Haarnadel vor, indem Sie die gewünschten Volumina in separaten Rohren abkühlen.
      1. Um eine Amplifikationslösung von 500 l zu erstellen, verwenden Sie 30 pmol jeder Haarnadel (z. B. für 500 l, 10 l von 3 'M Stammhaarnadellösung).
      2. Übertragen Sie die Haarnadellösung in die Schläuche.
      3. Bei 95 °C für 90 s inkubieren.
      4. Abkühlen auf RT für 30 min im Dunkeln.
   3. Bereiten Sie die Haarnadellösung vor, indem Sie alle snap-cooled Haarnadeln zu 500 l Verstärkungspuffer bei RT hinzufügen.
   4. Entfernen Sie die Vorverstärkungslösung, und fügen Sie die komplette Haarnadellösung hinzu.
   5. Inkubieren Sie die Proben über Nacht (12-18 h) bei RT im Dunkeln.
   6. Entfernen Sie überschüssige Haarnadeln, indem Sie mit 5x SSCT bei RT wie folgt waschen: 2 x 5 min, 2 x 15 min und 1 x 5 min.
   7. Ersetzen Sie die 5x SSCT-Lösung durch 1x PBS, und lagern Sie sie bei 4 °C für nicht mehr als 2-3 Tage oder gehen Sie direkt zur nuklearen Färbung über.
      HINWEIS: Verwenden Sie bei Bedarf die RNA-FISH-Proben in einem Standard-Immunfluoreszenztest, gefolgt von nuklearer Färbung (siehe Abschnitt 6).
5. Nukleare Färbung und Gleitmontage
   1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung und ersetzen Sie sie durch eine DAPI-Lösung (0,2 g/ml) in 1x PBS.
   2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
   3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
   4. Legen Sie die Ausgeschnittenmembran der Transwell-Einsätze auf 10 l Antifade-Montagemedium mit nach oben gerichteten Zellen und fügen Sie der Membran zusätzliches Montagemedium (5 l) hinzu.
   5. Bedecken Sie die Membranen mit Abdeckungen.
   6. Härten Sie die montierten Proben auf einer trockenen, flachen Oberfläche im Dunkeln.
   7. Nach der Aushärtung die Kanten der Abdeckungen mit VALAP-Dichtstoff oder Nagellack versiegeln, um ein Austrocknen der Proben zu verhindern.

6. Immunfluoreszenzanalyse von Vero-Zellen und HAE-Kulturen

HINWEIS: Führen Sie den Immunfluoreszenztest am 3. Tag für Zelllinien oder Tag 4 für HAE-Kulturen durch. Verwenden Sie für jedes Modell einen anderen Ansatz. Alle Unterschiede sind deutlich gekennzeichnet.

1. Aspirieren Sie die 1x PBS-Lösung aus den Brunnen.
2. Blockieren Sie die Proben durch Inkubation mit 1% w/v Rinderserumalbumin in PBST-Lösung für 30 min bei 37 °C.
3. Bereiten Sie primäre Antikörper vor, indem Sie geeignete Verdünnungen in der Blockierlösung vorbereiten und inkubieren.
   1. Für Vero-Zellen auf Abdeckungen:
      1. Tropfen (30-50 l) der Antikörperlösung auf Parafilm in eine Feuchtigkeitskammer geben.
      2. Legen Sie Coverlips auf die Antikörpertropfen mit nach unten gerichteten Zellen.
   2. Ersetzen Sie bei HAE das Blockiermittel in den Einsätzen durch eine Antikörperlösung (100 l), und inkubieren Sie die Proben in einer befeuchteten Kammer.
      HINWEIS: Passen Sie die Zeit und Temperatur für jede Inkubation mit primärem Antikörper an. Typische Parameter sind 2 h bei RT oder über Nacht bei 4 °C.
4. Waschen Sie die Proben 3 x 5 min mit PBST.
   1. Für Zellen auf Deckellipse auf eine 12-Well-Platte übertragen und PBST-Lösung hinzufügen.
   2. Ersetzen Sie bei HAE-Kulturen die Antikörperlösung durch eine PBST-Lösung.
5. Überprüfen Sie die Lichtquellen und Filter, die für das konfokale Mikroskop verfügbar sind.
6. Wählen Sie sekundäre Antikörper nach der Wirtsart. Wählen Sie die Fluorophorparameter (Erregungs- und Emissionswellenlängen, Spektrumbreite und Anregungseffizienz entsprechend der verfügbaren Lichtquelle).
   HINWEIS: Spektralparameter können mit Online-Tools modelliert werden (siehe Materialtabelle).
7. Bereiten Sie geeignete Sekundärantikörperlösungen vor, indem Sie sie mit einer BlockierenderLösung verdünnen.
8. Mit sekundären Antikörpern inkubieren (wie in 6.3), aber 1 h bei 37 °C inkubieren.
9. Waschen Sie die Proben wie in Schritt 6.4.
10. Nukleare Färbung und Gleitmontage
    1. Für Zellen auf Deckellips
       1. Aspirieren Sie den PBST, und ersetzen Sie ihn durch DAPI (0,2 g/ml) in 1x PBS-Lösung.
       2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
       3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
       4. Legen Sie die Abdeckungen auf Tropfen von 10 L Montagemedium mit nach unten gerichteten Zellen.
       5. Versiegeln Sie die Coverlips mit Nagellack.
    2. Für HAE-Kulturen
       1. Aspirieren Sie den 1x PBST, und ersetzen Sie ihn durch DAPI (0,2 g/ml) in 1x PBS-Lösung.
       2. Inkubieren Sie die Proben für 10 min bei RT im Dunkeln.
       3. Aspirieren Sie die DAPI-Lösung und waschen Sie die Zellen zweimal mit 1x PBS.
       4. Legen Sie die ausgeschnittenen Membranen auf Tropfen von 10 l Montagemedium mit nach oben gerichteten Zellen und fügen Sie der Membran zusätzliches (5 l) Montagemedium hinzu.
       5. Bedecken Sie die Membranen mit Abdeckungen.
       6. Versiegeln Sie die Coverlips mit Nagellack.

7. Konfokale Mikroskopie

1. Definieren Sie die Spuren, indem Sie die verwendeten Fluorophore angeben.
2. Wählen Sie den Scanmodus und die Geschwindigkeit aus.
3. Passen Sie die Laserleistung, Verstärkung und Offset-Werte für jedes Fluorophor an, indem Sie sie mit den jeweiligen Negativkontrollen vergleichen: für Virus-, Mock-infizierte Zellen; für zelluläre Proteine, Proben, die mit Isotypkontrollantikörpern von einem geeigneten Wirt gefärbt sind.
4. Um ein 3D-Bild zu erfassen, aktivieren Sie den Z-Stack-Modus, und legen Sie die oberen und unteren Grenzwerte fest. Legen Sie die Schrittgröße/-zahl fest.
   HINWEIS: Weitere Informationen zur Coronavirus-Bildgebung finden Sie unter¹⁹.

Das in diesem Manuskript beschriebene Immun-RNA-FISH-Protokoll wurde mit zwei zellulären Systemen durchgeführt: einer Vero-Zelllinie und einer 3D-HAE-Kultur. Die wichtigsten Schritte für beide Zellmodelle sind in Tabelle 2dargestellt. Das RNA-FISH-Protokoll zur Visualisierung von SARS-CoV-2 in HAE-Kulturen umfasst Schritte, die typisch für Gewebeproben sind, d.h. Permeabilisation mit 100% MeOH und Rehydrierung durch eine abgestufte Reihe von MeOH-PBS- und 0,1% Tween-Lösungen. Die Immunfluoreszenz wurde nach Vollständigkeit von RNA-FISH durchgeführt. Zstack-Bilder wurden aufgenommen und verarbeitet.

Abbildung 1 zeigt Immun-RNA-FISH in mock-inokierten Kontroll-Vero-Zellen oder zellen, die mit SARS-CoV-2 infiziert sind. Abbildung 2 zeigt Immun-RNA-FISH in mock-inokierten Kontroll-HAE-Kulturen oder Mit SARS-CoV-2 infizierten Kulturen. Abbildung 3 zeigt die Optimierung des Permeabilisationsprotokolls in Vero-Zellen: 70% Ethanol über Nacht bei -20 °C oder 0,1% Tween-20 in PBS für 5 min bei RT. Permeabilisierung mit Waschmittel ergibt ein klares, spezifisches Signal für SARS-CoV-2 subgenomische RNA, während die Verwendung von Ethanol zu einem unscharfen Bild führt.

Abbildung 1: Immuno-RNA-FISH zum Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und β-Tubulin in Vero-Zellen. Lokalisation der SARS-CoV-2 subgenomischen RNA in (A) infizierten und (B) verspotteten Vero-Zellen. Virale RNA wurde von FISH (rot) visualisiert. β-Tubulin wird mit Antikörpern gegen Maus 5tubulin (1:100, Nachtinkubation bei 4 °C) und mit Alexa Fluorophor 488-konjugierten Sekundärantikörpern (1:400, 1 h Inkubation bei RT) gefärbt. Nuclei wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Jedes Bild ist eine einzelne konfokale Ebene. Skalenbalken = 20 m. Abkürzungen: SARS-CoV-2 = schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2; FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; DAPI = 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 2:Mit SARS-CoV-2 infizierte Epithelzellen der menschlichen Atemwege. Lokalisation der SARS-CoV-2 subgenomischen RNA in (A) infizierten und (B) verspotteten HAE-Kulturen. Virale RNA wurde von FISH (rot) visualisiert. Ciliated-Zellen werden mit Antikörpern gegen Maus 5-Tubulin (1:100, Nachtinkubation bei 4 °C) und mit Alexa Fluorophor 488-konjugierten Sekundärantikörpern (1:400, 1 h Inkubation bei RT) visualisiert. Nuclei wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Jedes Bild stellt eine maximale Projektion dar, die aus konfokalen Bildstapeln rekonstruiert wird (Dicke = 3 m). Skalenbalken = 10 m. Abkürzungen: SARS-CoV-2 = schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2; FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; HAE = Epithel der menschlichen Atemwege; DAPI = 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Abbildung 3:Optimierung der Permeabilisierungsbedingungen für Vero-Zellen. Permeabilisierung von Vero-Zellen mit (A) 70% Ethanol und (B) mit 0,1% Tween-20 in PBS. Die Permeabilisierung mit Waschmittel ergibt ein klares spezifisches Signal für die subgenomische RNA SARS-CoV-2, während Ethanol zu einem verschwommenen Bild führt. Virale RNA ist rot dargestellt. Nuclei wurden mit DAPI (blau) gefärbt. Jedes Bild stellt eine maximale Projektion dar, die aus konfokalen Bildstapeln rekonstruiert wird (Dicke = 3 m). Skalenbalken = 10 m. Abkürzungen: SARS-CoV-2 = schweres akutes Atemwegssyndrom Coronavirus 2; PBS = phosphatgepufferte Saline; DAPI = 4,6-Diamidino-2-Phenylindole. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Ergänzende Abbildung 1: SARS-CoV-2 N Gensequenz (5'-3')   Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.

Tabelle 1: Herstellung von Gradienten-Methanol/PBST-Lösungen zur Rehydratation. Um menschliche Atemwegsepithelproben nach nächtlicher Inkubation in absolutem Methanol (MeOH) zu rehydrieren, ist ein langsamer Austausch der Umwelt notwendig. Dazu muss ein langsamer Austausch erfolgen, indem Puffer mit Puffern inkubiert werden, in denen sich die Anteile von MeOH und PBST (0,1% Tween-20 in 1x phosphatgepufferter Saline) allmählich ändern. Reagenzvolumina, die ausreichen, um 100 ml jeder Lösung vorzubereiten, genug, um mehrere Experimente durchzuführen, sind aufgeführt.

Tabelle 2: Workflow des Immuno-RNA-FISH-Protokolls in Zelllinien und HAE-Kulturen. Immuno-RNA-FISH ist in beiden Zellmodellen realisierbar, erfordert aber unterschiedliche Ansätze. Die Hauptschritte werden zusammen mit den verwendeten Puffern (in Klammern) gefolgt von Dauer und Temperatur der Inkubation angezeigt. In mehreren Schritten werden kritische Unterschiede im Volumen des Inkubationsreagenzes pro Probe gegeben, um die Berechnungen zu vereinfachen. Wenn das Volumen nicht angegeben ist, wird es willkürlich ausgewählt, so dass es die Probe vollständig (in der Regel 200 L) mit Rührung bedeckt. Abkürzungen: FISH = Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung; HAE = Epithel der menschlichen Atemwege; PFA = Paraformaldehyd; DAPI = 4,6-Diamidino-2-Phenylindole; BSA = Rinderserumalbumin; PBS = phosphatgepufferte Saline; MeOH = Methanol.

Immuno-RNA-FISH ist eine zuverlässige Methode zur Doppelfärbung von RNA und zellulären Proteinen. Hier wurde ein modifiziertes Immun-RNA-FISH-Protokoll beschrieben, das den Nachweis von SARS-CoV-2-RNA und zellulären Proteinen in Zelllinien und HAE-Kulturen ermöglicht. Dieses Protokoll kann für den Einsatz in verschiedenen Zellmodellen angepasst werden, einschließlich Zellmonolayern oder spezifischen Geweben. Die Methode basiert auf dem Konzept eines HCR, das durch entsprechende Sondenlokalisierung initiiert wird. Als nächstes führt die Verwendung von Split-Initiator-Sonden, um mit der Verstärkung des Signals durch fluoreszierend markierte Verstärker zu beginnen, zu einer minimalen bis keinen Hintergrundfluoreszenz, wenn sie mit einem konfokalen Mikroskop beobachtet werden. Verstärker können mit verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen beschriftet werden und sind mit verschiedenen Sonden kompatibel, die verschiedene Ziele erkennen; daher können sie gleichzeitig verwendet werden. Die in diesem Protokoll beschriebenen Verfahren sind einfach, aber zeitaufwändig (3-4 Tage). Dennoch zeichnen sich die Ergebnisse durch ein geringes Geräusch-Signal-Verhältnis aus, im Gegensatz zu anderen Protokollen, die direkt markierte Fluoreszenzsonden verwenden.

Hier wurden Vero-Zellen und HAE-Kulturen verwendet. Für Zellen auf einem Deckzettel und Zellen in der Gewebekultur sind unterschiedliche Protokolle erforderlich. Die meisten Unterschiede treten bei der Handhabung der Zellen (ob auf Deckschein oder einer Membran) und der Menge des verwendeten Materials auf. Allgemeine RNA-FISH-Protokolle erfordern eine Permeabilisierung mit Ethanol- oder Methanollösungen sowie eine nächtliche Inkubation bei -20 °C. Wichtig ist, dass die Verwendung von Reinigungsmitteln zur Permeabilisation für die Immunfluoreszenz vorteilhafter ist, das Verfahren um 1 Tag verkürzt und eine effizientere Planung des Experiments ermöglicht. Der primäre Ansatz bestand darin, allgemeine Protokolle mit Permeabilisation mit Alkohol oder Reinigungsmittel zu befolgen, um zu sehen, ob unerwünschte Wirkungen erkennbar waren. Wichtig ist, dass die nächtliche Permeabilisierung von Vero-Zellen mit 70% Ethanollösung zu einem unspezifischen, verschwommenen Signal führte; Im Gegensatz dazu ermöglichte die Permeabilisierung mit Tween20 eine klare und spezifische Visualisierung der SARS-CoV-2-RNA und verkürzte das Protokoll um 1 Tag (Abbildung 3).

Derselbe Ansatz wurde nach einer nächtlichen Inkubation mit absolutem Methanol bei -20 °C (nach allgemeinen RNA-FISH-Protokollen für Gewebeproben) und 0,1% Tween20 für 5 min bei RT an HAE-Kulturen getestet. Inkubation mit Tween20 führte zu einem unspezifischen Signal, das dieses Reagenz disqualifiziert (Daten nicht gezeigt). Die nächtliche Inkubation mit Methanol führte zu einem hochspezifischen Signal ohne Artefakte. Wichtig ist, dass die Ablösung der Transwell-Membran beobachtet wurde, da Methanol den Kleber auflöste. Dieses Problem wurde durch Das Lösen der Membran und das Fortfahren mit dem Coverslip-Protokoll behoben. Klassische RNA-FISH-Verfahren verwenden Proteinase K, um die Empfindlichkeit zu verbessern, da diese Proteine entfernt und RNA-Protein-Komplexe löscht, wodurch Zellen durch Chemikalien und Farbstoffe durchdrungen werden können. Das vorliegende Protokoll verzichtete auf diesen Schritt, da Proteinase K Proteinfärbung verhindert. Es wurden keine Unterschiede in der Empfindlichkeit von RNA-FISH beobachtet, wenn die Proteinase K fehlte (Daten nicht dargestellt).

Die Durchführung von Immunfluoreszenz-Assays nach RNA-FISH hatte keinen Einfluss auf das RNA-Signal und führte zu einer erfolgreichen Kombination beider Methoden. Daher stellt das vollständige Protokoll eine bequeme Möglichkeit dar, RNA und ihre Wechselwirkungen mit Proteinen auf einzelliger Ebene zu visualisieren. Bemerkenswert ist, dass die Fixierung von Zellen (erforderlich für Immun-RNA-FISH) keine Zeitrafferexperimente zur Untersuchung dynamischer Ereignisse auf einzelzelliger Ebene zulässt. Die Visualisierung von SARS-CoV-2 RNA ermöglicht die Analyse der SARS-CoV-2-Replikation innerhalb einer Zelle und ermöglicht in Verbindung mit der Immunfluoreszenz die Untersuchung intrazellulärer SARS-CoV-2 RNA/Host-Protein-Wechselwirkungen einschließlich des Zusammenspiels mit dem Epigenom. Schließlich verfügt dieses Protokoll über eine Vielzahl von Anwendungen, einschließlich der Detektion von SARS-CoV-2 und anderen neu auftretenden Viren mit Einzelzellauflösung. Dank sensibler und spezifischer HCR-Technologie kann es auch als Diagnosewerkzeug eingesetzt werden.

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Diese Arbeit wurde vom Ministerium für Wissenschaft und Hochschulbildung für die Forschung zu SARS-CoV-2 und durch Stipendien des National Science Center (Stipendien UMO2017/27/B/NZ6/02488 an K.P. und UMO-2018/30/E/NZ1/00874 an A.K.-P.) unterstützt.