Котрансляционная вставка мембранных белков в предварительно сформированные нанодиски

Котрансляционная вставка в предварительно сформированные нанодиски позволяет изучать бесклеточные синтезированные мембранные белки в определенных липидных средах без контакта с моющими средствами. Этот протокол описывает подготовку основных компонентов системы и критических параметров для повышения эффективности экспрессии и качества выборки.

Бесклеточные экспрессионные системы позволяют адаптировать реакционные среды для поддержки функционального сворачивания даже сложных белков, таких как мембранные белки. Показаны экспериментальные процедуры котрансляционной вставки и сворачивания мембранных белков в преформированные и определенные мембраны, поставляемые в виде нанодисков. Протокол полностью не содержит моющих средств и может генерировать миллиграммы очищенных образцов в течение одного дня. Полученные образцы мембранного белка / нанодисков могут быть использованы для различных функциональных исследований и структурных применений, таких как кристаллизация, ядерный магнитный резонанс или электронная микроскопия. Описано получение основных ключевых компонентов, таких как бесклеточные лизаты, нанодиски с конструированными мембранами, критические стоковые растворы, а также сборка двухкамерных бесклеточных реакций экспрессии. Поскольку требования к сворачиванию мембранных белков могут быть весьма разнообразными, основным направлением этого протокола является модуляция параметров и стадий реакции, важных для качества образца, таких как критические основные реакционные соединения, мембранный состав нанодисков, окислительно-восстановительная и шаперонная среда или дизайн шаблона ДНК. Весь процесс демонстрируется синтезом протеорходопсина и рецептора, связанного с G-белком.

Мембранные белки (МП) являются сложными мишенями в исследованиях производства белка из-за их нерастворимости в водных средах. Традиционные платформы производства МП включают клеточные системы, такие как E. coli, дрожжи или эукариотические клетки. Синтезированные рекомбинантные МП либо извлекаются из клеточных мембран, либо переворачиваются из тел включения¹. После солюбилизации моющих средств МП могут быть переведены в подходящие мембранные среды с помощью установленных протоколов восстановления in vitro. Помимо везикул и липосом, восстановление MP в плоские мембраны в виде частиц нанодисков² или salipro³ стало обычным методом в последнее время. Однако все эти стратегии подразумевают контакт детергентов с депутатами, что может привести к дестабилизации, диссоциации олигомеров и даже потере структуры и активности белка⁴. Поэтому скрининг на оптимальные условия солюбилизации и восстановления моющих средств может быть утомительным и трудоемким⁵.

Открытая природа бесклеточных (CF) систем позволяет напрямую снабжать реакцию экспрессии предварительно сформированными мембранами с определенным липидным составом. В этом липидном режиме экспрессии (L-CF) синтезированные МП имеют возможность совместного трансляционного введения в предоставленные бислои ^6,7 (рисунок 1). Нанодиски, состоящие из мембранного каркасного белка (MSP), окружающего плоский липидный двухслойный диск⁸, по-видимому, особенно подходят для этой стратегии ^9,10. Нанодиски могут быть обычно собраны in vitro с различными липидами, они очень стабильны, а запасы могут быть сконцентрированы до 1 мМ. Однако экспрессия МПП в кишечной палочке и ее очистка необходимы. В качестве альтернативной стратегии MSP может быть совместно экспрессирован вместе с целевым MP в реакциях CF, поставляемых липосомами 11,12,13. Шаблоны ДНК как для MSP, так и для MP добавляются в реакцию, и MP / нанодиски могут формироваться при экспрессии. В то время как производство МПП избегается, стратегия совместной экспрессии требует тщательной тонкой настройки конечных концентраций шаблона ДНК, и можно ожидать более высоких вариаций эффективности производства образцов.

Котрансляционная вставка МП в мембраны преформированных нанодисков является нефизиологическим и до сих пор в значительной степени неизвестным механизмом, независимым от транслоконных механизмов и сигнальных последовательностей 13,14,15,16. Основными детерминантами эффективности введения являются тип мембранного белка, а также липидный состав предоставленной мембраны, с частым предпочтением отрицательно заряженных липидов^15,17. Поскольку мембраны нанодисков относительно ограничены по размеру, значительное количество липидов высвобождается при вставке^{MP 18}. Изменение размера нанодисков позволяет вставлять и настраивать более высокие олигомерные МП комплексы ^15,18. Среди прочего показана правильная сборка гомолигомерных комплексов для ионного канала KcsA, для ионного насоса протеорходопсина (PR) и для мультилекарственного транспортера EmrE^15,18. Депутаты, скорее всего, войдут в симметричную нанодисковую мембрану с обеих сторон на относительно равной частоте. Поэтому следует учитывать, что различные мономеры или олигомеры, вставленные в один нанодиск, могут иметь противоположные ориентации. Однако смещение в ориентации может быть вызвано механизмами совместной вставки, о которых сообщалось для образования гексамеров PR и тетрамеров KcsA¹⁸. Дальнейшее смещение в ориентации MP может быть результатом переключения ориентации вставленных депутатов, вероятно, на краю мембран нанодисков.

Производство лизатов CF из штаммов E. coli является надежным рутинным методом и может быть выполнено практически в любой биохимической лаборатории ^19,20. Следует учитывать, что помимо образования дисульфидных мостов, большинство других посттрансляционных модификаций отсутствуют, если МП синтезируется с использованием лизатов E. coli. Хотя это может привести к образованию более однородных образцов для структурных исследований, может потребоваться исключить потенциальное воздействие на функцию отдельных мишеней МП. Однако эффективное производство высококачественных образцов рецепторов, связанных с G-белком (GPCR)14,21,22, эукариотических транспортеров ²³ или крупных гетеромерных сборок²⁴ в лизатах E. coli CF, указывает на их пригодность даже для сложных мишеней. Объемы в подготовительной шкале (≈ 1 мг/мл) образца могут быть получены с двухкамерной конфигурацией без ячеек непрерывного обмена (CECF), состоящей из реакционной смеси (RM) и отсека питательной смеси (FM). Объем FM превышает объем RM в 15-20 раз и обеспечивает резервуар низкомолекулярных энергетических соединений и прекурсоров¹⁹. Таким образом, реакция экспрессии растягивается на несколько часов, а конечный выход мишени MP увеличивается. Отсеки RM и FM разделены диализной мембраной с отсечкой 10-14 кДа. Эти два отсека требуют специальной конструкции реакционного контейнера CECF (рисунок 1). Коммерческие диализные кассеты в качестве контейнеров RM в сочетании с индивидуальными контейнерами из плексигласа, содержащими FM, являются подходящими примерами. Доходностью MP можно дополнительно манипулировать, изменяя соотношение RM:FM или обменивая FM после определенного периода инкубации.

Выход и качество МП часто требуют интенсивной оптимизации параметров реакции. Важным преимуществом выражения CF является возможность модификации и тонкой настройки практически любого соединения в соответствии с индивидуальными требованиями MP. Простая стратегия заключается в том, чтобы сначала сосредоточиться на повышении производительности MP путем создания базового производственного протокола, а затем оптимизировать качество MP путем тонкой настройки реакции и условий складывания. Отсутствие физиологических процессов в лизатах муковисцидоза и снижение их сложности приводят к высоким показателям успешности эффективного производства MPs²⁵. Рутинные соображения по проектированию шаблона ДНК и оптимизации концентрации ионов Mg²⁺ в большинстве случаев достаточны для получения удовлетворительных выходов²⁶. В зависимости от режима экспрессии, оптимизация качества MP может занять много времени, так как большее разнообразие параметров необходимо экранировать 14,17,22.

Для создания описанной платформы экспрессии CF необходимы протоколы для производства лизата CF (i), РНК-полимеразы T7 (ii), нанодисков (iii) и основных реакционных соединений CECF (iv) (рисунок 1). Производные штамма E. coli K12 A19²⁷ или BL21 часто используются для получения эффективных лизатов S30 (центрифугирование при 30 000 х г). Помимо лизатов S30, могут использоваться соответствующие лизаты, центрифугированные при других g-силах (например, S12). Лизаты различаются по эффективности экспрессии и сложности протеома. Протеом лизата S30, полученный по описанному протоколу, был детально изучен²⁸. Протеом S30 по-прежнему содержит некоторые остаточные белки наружной мембраны, которые могут создать фоновые проблемы при экспрессии и анализе ионных каналов. Для таких целей рекомендуется использование лизатов S80-S100. Ценной модификацией во время приготовления лизата является индукция реакции SOS комбинированным тепловым шоком и подачей этанола в средней фазе роста клеток. Полученные лизаты HS30 обогащены шаперонами и могут быть использованы в смесях с лизатами S30 для улучшения складывания MP²². Экспрессия CF в лизатах E. coli управляется как связанный процесс транскрипции/трансляции с шаблонами ДНК, содержащими промоторы, контролируемые РНК-полимеразой T7 (T7RNAP). Фермент может быть эффективно продуцирован в звездных клетках BL21(DE3), несущих плазмиду pAR1219²⁹.

Две копии MSP1E3D1 собираются в один нанодиск диаметром 10-12 нм, но протокол, описанный ниже, может работать и для других производных MSP. Тем не менее, нанодиски, большие, чем те, которые сформированы с помощью MSP1E3D1, как правило, менее стабильны, в то время как меньшие нанодиски, сформированные с производными MSP, такими как MSP1, могут не вмещать более крупные MPS или MP-комплексы. Нанодиски MSP1E3D1 могут быть собраны in vitro с большим разнообразием различных липидов или липидных смесей. Предварительно сформированные нанодиски обычно стабильны в течение > 1 года при -80 °C, в то время как стабильность может варьироваться для различных липидных компонентов. Для скрининга липидного воздействия на складчатость и стабильность МП необходимо подготовить комплексный набор нанодисков, собранных с репрезентативным разнообразием липидно-липидных смесей. Следующие липиды могут дать хороший стартовый выбор: 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рак-глицерин) (DMPG), 1,2-димиристоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DMPC), 1,2 диолеоил-sn-глицеро-3-фосфо-рак-(1-глицерин) (DOPG), 1,2-диолеоил-sn-глицерон-3-фосфохолин (DOPC), 1-пальмитоил-2-олеоил-sn-глицеро-3-фосфо-(1'-рак-глицерол) (POPG) и 1-пальмитоил-2-олеоил-глицеро-3-фосфохолин (POPC).

Описан протокол приготовления реакции 3 мл CECF. Возможно дальнейшее масштабирование вверх или вниз в соотношении 1:1. Для конфигурации CECF с двумя отсеками необходимо подготовить RM, содержащий все соединения, и FM, содержащий только низкомолекулярные соединения. Коммерческие диализные устройства 3 мл с MWCO 10-14 кДа могут использоваться в качестве контейнеров RM, которые затем помещаются в изготовленные на заказ контейнеры из плексигласа, содержащие FM (рисунок 1D)³⁰. Соотношение RM:FM составляет 1:20, поэтому 60 мл FM должны быть подготовлены для 3 мл RM. Качество, концентрация или тип нескольких компонентов могут иметь решающее значение для конечного выхода и/или качества синтезированного MP (таблица 1). Шаблоны ДНК должны быть подготовлены в соответствии с опубликованными руководящими принципами, и кодонная оптимизация рамки считывания мишени может дополнительно значительно улучшить выход продукта²⁶. Для реакции препаративного масштаба CECF описан установленный протокол получения PR. Для создания протоколов экспрессии для новых депутатов обычно необходимо выполнить оптимизационные экраны определенных соединений (табл. 1) для повышения урожайности и качества. Для ионов Mg²⁺ существует хорошо сфокусированный оптимум концентрации, который часто показывает значительные различия для различных шаблонов ДНК. Другие реакционные соединения CF, такие как новые партии лизатов T7RNAP или S30, могут дополнительно сместить оптимальную концентрацию Mg²⁺ . В качестве примера описан типичный экран Mg²⁺ в диапазоне концентраций 14-24 мМ и с шагом 2 мМ. Каждая концентрация просеивается в дубликатах и в аналитической шкале реакций CECF. В качестве реакционного контейнера CECF используются изготовленные на заказ контейнеры Mini-CECF из оргстекла³⁰ , содержащие RM, в сочетании со стандартными 24-луночными микропластинками, содержащими FM (рисунок 1B). Альтернативно, могут использоваться коммерческие диализные картриджи в сочетании с 96-глубинными микропластинами скважин или другими коммерческими диализаторными устройствами в соответствующих установках (фиг.1С).

1. Приготовление лизата S30

1. День 1: Удалите клетки из запасов глицерина на агаровой пластине LB и инкубируйте при 37 °C в течение ночи.
2. День 2: Инокулируют 200 мл LB-среды клетками из агаровой пластины и инкубируют при 37 °C в течение 12-14 ч.
3. День 3: Инокулируют 10 л стерильной среды YPTG (10 г/л дрожжевого экстракта, 16 г/л триптона, 5 г/л NaCl, 19,8 г/л глюкозы, 4,4 мМ KH₂PO₄, 8 мМ K₂HPO₄), закаленной до 37 °C в реакторе с перемешиванием 15 л с 100 мл прекультуры (1:100). Культивируйте при 37 °C, 500 об/мин и высокой аэрации (~ 3 объема воздуха в минуту). Чтобы предотвратить чрезмерное вспенивание, добавьте стерильный пенопласт.
4. Измеряйте оптическую плотность (OD) при 600 нм через равные промежутки времени. Примерно через 2 ч культура перейдет в логарифмическую фазу.
5. Модификация для лизата HS30: Когда клетки находятся в средней фазе (OD600 ≈ 3,6-4,2), добавляют 300 мл этанола в культуральную среду и продолжают культивирование при 42 °C, 500 об/мин и высокой аэрации (приблизительно 3 объема воздуха в минуту) в течение еще 45 мин. Затем приступают к охлаждению и сбору клеточной культуры, как описано на этапе 1.6. Для производства стандартного лизата S30 пропустите этот шаг и перейдите к шагу 1.6.
6. Когда клетки находятся в средней фазе (OD600 ≈ 3,6-4,2), охладите ферментер ниже 20 °C в течение < 30 мин. Итоговый OD600 должен быть около 4,5-5,5. Соберите ячейки при 4 500 х г в течение 20 мин при 4 °C и выбросьте супернатант. Держите ячейки при температуре 4 °C на протяжении следующих шагов.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Во время охлаждения может произойти чрезмерное вспенивание. В этом случае либо добавляют антипену, либо уменьшают скорость перемешивания и/или уменьшают воздушный поток в биореакторе.
7. Суспендировать ячейки полностью в 300 мл буфера S30-A (10 мМ Tris-HCl, рН 8,2, 14 мМ Mg(OAc)₂, 60 мМ KCl, 6 мМ 2-меркаптоэтанола) с использованием шпателя с последующим пипеткой суспензии вверх и вниз до однородности. Центрифуга при 8 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Повторите этот шаг дважды.
   ВНИМАНИЕ: 2-меркаптоэтанол токсичен. Избегайте контакта с кожей или дыхательными путями. По возможности работайте под капотом. Взвесьте пустой стакан центрифуги перед последним этапом стирки. После центрифугирования взвесьте влажную ячейку гранулы и либо перейдите к этапу 1,8, либо сохраните гранулу до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Масса влажной клеточной гранулы составляет 5-7 г на 1 л культуры биореактора. На этом этапе протокол может быть приостановлен, и гранулы могут быть заморожены в жидком азоте и храниться при -80 °C в течение 4-8 недель.
8. Тщательно суспендировать клетки в 1,1 объеме (1 г = 1 мл) буфера S30-B (10 мМ Tris-HCl, рН 8,2, 14 мМ Mg(OAc)₂, 60 мМ KOAc, 1 мМ DTT, 1 таблетка ингибитора протеазы cOmplete). Заполните суспензию в предварительно охлажденную ячейку давления френч-пресса и разрушайте ячейки при 1000 фунтов на квадратный дюйм. Пропустите ячейки через французский пресс один раз.
9. Центрифугировать лизат при 30 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Перенесите супернатант в свежую трубку и повторите этап центрифугирования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поверх гранулы после первой центрифугирования может присутствовать рыхлый и слизистый слой, который не следует переносить с супернатантом.
10. Применяют высокий уровень соли и тепла для удаления нестабильных компонентов лизата и высвобождения мРНК из рибосом. Отрегулируйте лизат до 0,4 М NaCl и инкубируйте при 42 °C в течение 45 минут на водяной бане.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Этот этап вызовет значительное образование осадков. Время от времени переворачивайте или переворачивайте трубку во время инкубации.
11. Переложить мутную суспензию (обычно 50-80 мл) в диализные трубки с отсечкой 10-14 кДа и диализом против буфера S30-C 5 л (10 мМ Tris-HCl, рН 8,2, 14 мМ Mg(OAc)₂, 60 мМ KOAc, 0,5 мМ DTT). Замените буфер диализа S30-C через 2-3 ч и диализуйте еще 12-14 ч.
12. День 4: Переложите диализированную суспензию в центрифужные трубки и центрифугу при 30 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Переложите супернатант (лизат S30) в свежие пробирки по 50 мл и аккуратно перемешайте. Белковая концентрация лизата должна составлять примерно 30-40 мг/мл. Аликвоты при шоке замораживают (например, 0,5 мл, 1 мл) в жидком азоте и хранят при -80 °C. Аликвоты стабильны в течение > 1 года.

2. Экспрессия и очистка Т7 РНК-полимеразы

1. День 1: Инокулируют 200 мл LB-среды, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, свежепокрытыми клетками BL21(DE3) Star x pAR1219 и инкубируют при 37 °C и 180 об/мин в течение 12-16 ч.
2. День 2: Привить 1 л потрясающего бульона (12 г/л триптона, 24 г/л дрожжевого экстракта, 4 мл/л глицерина) в 2 л перегородчатой колбы с 10 мл предварительной культуры и инкубировать при 37 °C и перемешивании 180 об/мин. Начальный OD600 должен быть около 0,1.
3. Когда OD600 достигнет 0,6-0,9, добавьте IPTG к конечной концентрации 1 мМ, чтобы индуцировать экспрессию T7RNAP и продолжайте культивирование еще в течение 5 ч.
4. Заготавливайте ячейки центрифугированием при 4 500 х г в течение 20 мин при 4 °C. Заморозить клетки в жидком азоте и хранить при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол может быть приостановлен.
5. День 3: Добавьте 30 мл буфера ледяной суспензии (30 мМ Tris-HCl, рН 8,0 с одной таблеткой ингибитора протеазы cOmplete) к замороженной клеточной грануле и разморозьте гранулу на водяной бане при комнатной температуре. Затем приостановите гранулу путем пипетки вверх и вниз до однородности.
6. Выполняйте разрушение клеток с помощью френч-пресса, как описано в предыдущем разделе, или используйте устройство обработки ультразвуком в соответствии с рекомендациями производителя. Впоследствии центрифугируют при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °С и переносят супернатант в свежую пробирку.
7. Чтобы вывести в осадок геномную ДНК, добавляйте сульфат стрептомицина медленно и при мягком перемешивании к надосадочному веществу до достижения конечной концентрации 3% (мас./об.). Инкубировать при 4 °С в течение 5-10 мин при тщательном перемешивании. Центрифуга при 20 000 х г в течение 30 мин при 4 °C.
8. Отфильтруйте супернатант фильтром 0,45 мкм и загрузите его на колонну Q-Sepharose с объемом колонки (CV) 40 мл, уравновешенную 2 буфером равновесия CV (30 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 10 мМ ЭДТА, 50 мМ NaCl, 5% глицерина и 10 мМ 2-меркаптоэтанола) с помощью перистальтического насоса со скоростью потока 4 мл / мин. Затем подключите колонну к УФ-детектору и продолжайте элюирование с буфером равновесия до тех пор, пока УФ-сигнал при 280 нм не достигнет стабильного базового уровня.
9. Elute T7RNAP с градиентом от 50 мМ до 500 мМ NaCl на CV при скорости потока 3 мл/мин. Соберите фракции 1 мл и подготовьте образцы для анализа SDS-PAGE, смешивая 10 мкл каждой фракции с буфером образцов 2 x SDS. Запустите SDS-PAGE и окрасьте гель Coomassie Blue R. T7RNAP должен выглядеть как заметная полоса примерно на 90 кДа вместе с многочисленными дополнительными полосами примесей.
10. Пул фракций, содержащих T7RNAP и диализ с использованием мембран с 12-14 кДа MWCO в течение 12-16 ч в диализном буфере (10 мМ K₂HPO₄/KH₂PO₄, рН 8,0, 10 мМ NaCl, 0,5 мМ ЭДТА, 1 мМ DTT, 5% (мас./об.) глицерин).
11. День 4: Собирают раствор T7RNAP и концентрируют с помощью фильтровальных установок с 12-14 MWCO до конечной концентрации 3-10 мг/мл. T7RNAP может начать выпадать в осадок во время концентрации. Немедленно прекращайте концентрацию, как только возникает помутнение в образце. Добавьте глицерин до конечной концентрации 50% (мас./об.) и осторожно перемешайте. Шок-заморозка 0,5-1 мл аликвот и хранение при -80 °C. Рабочие аликвоты T7RNAP могут храниться при -20 °C.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 20-40 мл 5 мг/мл частично очищенного T7RNAP с 20 000-40 000 единиц должны быть получены из ферментации 1 л. Для проверки оптимального количества каждой партии T7RNAP следует проводить реакции экспрессии CF зеленого флуоресцентного белка (GFP), содержащего 0,02 мг/мл-0,1 мг/мл подготовленного образца T7RNAP.

3. Экспрессия и очистка MSP1E3D1

1. День 1: Преобразование звездных ячеек E. coli BL21 (DE3) с вектором pET28(a)-MSP1E3D1³¹ с использованием стандартных протоколов преобразования теплового шока или электропорации. Выводит наружу или пластинчато трансформированные клетки на Агаре LB, содержащие 30 мкг/мл канамицина, и инкубируют при 37 °C в течение 12-16 ч.
2. День 2: Инокулируют 200 мл среды LB, дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы и 30 мкг/мл канамицина одной колонией, собранной из агаровой пластины, и инкубируют при 37°C при 180 об/мин в течение 12-16 ч.
3. День 3: Инокулируют 10 л LB-среды, дополненной 0,5% (мас./об.) глюкозы и 30 мкг/мл канамицина 100 мл прекультуры в биореакторе с перемешиваемым резервуаром. Проводят ферментацию при 37 °C, 500 об/мин и аэрацию приблизительно 3 объема биореактора в минуту. В случае чрезмерного вспенивания добавьте пену.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Вместо ферментера можно использовать сбитые с толку колбы.
4. При OD600, составляющем 6,5-7,5, добавляют IPTG к конечной концентрации 1 мМ и продолжают инкубацию при 37°C в течение 1 ч. Заготавливайте ячейки центрифугированием при 4 500 х г в течение 20 мин при 4 °C. Вымойте гранулы с 200 мл 0,9% (мас./об.) NaCl и центрифугу снова при 8 000 х г в течение 10 мин при 4 °C. Выбрасывайте супернатант и переносите ячейки в пробирки объемом 50 мл с помощью шпателя. Ожидаемая масса влажных гранул составляет 8-12 г на л культуры биореактора. Гранулы с ударно-замороженными ячейками в жидком азоте и хранят при -80 °C до дальнейшего использования.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь протокол можно приостановить.
5. День 4: Для очистки оттаивайте клеточные гранулы на водяной бане в RT. Суспендируйте клетки в буфере MSP-A (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 1% (мас./об.) Triton X-100, 1 таблетка коктейля ингибитора протеазы c0mplete на 50 мл клеточной суспензии), чтобы получить 30-40% (мас./об.) клеточную суспензию.
6. Разрушают клетки ультразвуком или с помощью френч-пресса и центрифуги при 30 000 х г в течение 30 мин при 4 °C. Переложите супернатант в свежую трубку и процедите через фильтр 0,45 мкм. Нанесите фильтрат на колонку нитрилотриаценовой кислоты, нагруженную Ni²⁺ (CV > 15 мл), уравновешенную 5 CV буфера MSP-B (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl, 1% (мас./об.) Triton X-100) с помощью перистальтического насоса.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы облегчить фильтрацию, супернатант может быть обработан ультразвуком в течение еще одной минуты, чтобы разрушить большие фрагменты ДНК.
7. После загрузки образца промыть колонну 5 CV MSP-B, 5 CV MSP-C (40 мМ Tris-HCl, pH 8,9, 300 мМ NaCl, 50 мМ холевой кислоты), 5 CV MSP-D (40 мМ Tris-HCl, pH 8,9, 300 мМ NaCl), 5 CV MSP-E (40 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 300 мМ NaCl) и 5 CV MSP-F (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 50 мМ имидазола).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Холевая кислота в буфере MSP-C важна для удаления липидов, прикрепленных к MSP. Холевая кислота не полностью растворима при низких значениях рН. Поэтому значение pH должно быть скорректировано до 8,9 в MSP-C и MSP-D. Важно промыть колонну буфером MSP-D, так как более низкий рН может привести к осаждению остаточной холевой кислоты и блокированию или повреждению колонны.
8. Elute MSP с MSP-G (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 300 мМ имидазола). Собирайте фракции по 1 мл и контролируйте поглощение УФ-излучения при 280 нм. Соберите и объедините фракции пика элюирования.
9. Переведите объединенные фракции MSP в мембранные трубки диализа MWCO 12-14 кДа и диализуйте против 5 л MSP-H (40 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 300 мМ NaCl, 10% (мас./об.) глицерина) в течение 2-3 ч при 4 °C. Переводят на свежий буфер 5 л MSP-H и диализ еще 12-16 ч при 4 °C.
10. День 5: Переложите раствор МСП в центрифужные трубки и центрифугу при 18 000 х г в течение 30 мин при 4 °C для удаления осадка. Переложите супернатант в свежую трубку и концентрат до 200-800 мкМ с помощью ультрафильтрационных устройств с 12-14 кДа MWCO при 4 °C. Измерьте концентрацию с помощью измерительного прибора UV/VIS. Для расчета концентрации используют коэффициент вымирания 27,31 ^{М-1 см-1} и молекулярную массу 31,96 кДа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Экспрессия в биореакторе обычно дает 15-30 мг MSP1E3D1 на культуру L.
11. Шок-замораживание аликвот концентрированного раствора МСП в жидком азоте и хранение при -80 °С.

4. Сборка нанодисков MSP1E3D1

1. День1: Приготовьте 1-2 мл 50 мМ липидных запасов (DMPG, DOPG, POPG DMPC, DOPC или POPC) в 100 мМ холата натрия. Хранить при температуре -20 °C, если не используется в тот же день.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор липидов должен быть прозрачным. Если раствор не прозрачный, концентрация холата натрия может быть увеличена до 150 мМ.
2. Смешайте раствор MSP1E3D1 с раствором липидов. Добавляют додецилфосфохолин (DPC) в конечной концентрации 0,1% (мас./об.). Реакции сборки могут быть скорректированы до конечных объемов 3 мл (таблица 2) или 12 мл, соответствующих типичным объемам диализных кассет (10 кДа MWCO). Инкубировать реакции сборки в течение 1 ч при 21 °C при мягком перемешивании.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для каждого липида необходимо использовать конкретное соотношение MSP1E3D1:липидов для обеспечения однородной нанодисковой подготовки (таблица 2). Для новых липидов или липидных смесей оптимальное соотношение следует определить с помощью экспериментального эксперимента и анализа¹⁴ эксклюзионной хроматографии.
3. Предварительно смочите мембрану диализной кассеты с буфером дискообразования (DF) (10 мМ Tris-HCl, рН 8,0, 100 мМ NaCl). Переложите сборочную смесь в диализную кассету со шприцем. Потенциальные пузырьки воздуха могут быть удалены путем аспирации с помощью шприца.
4. Дни 1-4: Диализ против буфера 3 х 5 л DF в течение 10-20 ч при РТ при перемешивании с использованием перемешивающего стержня. Затем перенесите сборочную смесь из диализной кассеты в центробежные фильтрующие блоки с 10 кДа MWCO, уравновешенными буфером DF. Концентрат при 4 000 х г при 4 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Мутная диализная смесь может указывать на неправильное стехиометрическое соотношение MSP:липид. Осадок должен быть удален при 18 000 х г в течение 20 мин при 4 °C до концентрации образца. Чтобы избежать выпадения осадков во время концентрации пробы, используйте ультрафильтрационные блоки с большим мертвым упором.
5. Сконцентрируйте собранные нанодиски до концентрации не менее 300 мкМ. Измерьте концентрацию с помощью УФ/ВИС-считывателя. Учтите, что один нанодиск образован двумя молекулами MSP1E3D1 и, таким образом, концентрация MSP должна быть разделена на 2, чтобы определить правильное количество нанодисков.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Описанная установка (таблица 2) даст 0,6-1 мл раствора нанодисков 300 мкМ.
6. Центрифугируют концентрированный препарат нанодисков при 18 000 х г в течение 20 мин при 4 °C для удаления осадка. Затем аспирируют супернатант и шок-замораживают 50 мкл аликвот в жидком азоте и хранят при -80 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Целесообразно оценить успешность формирования нанодисков с помощью размерно-эксклюзионной хроматографии. Образец должен быть монодисперсным и содержать только небольшое количество агрегатов. Агрегаты указывают на то, что количество липидов в установке слишком велико. В качестве ориентира можно использовать очищенный MSP1E3D1. Если подготовка нанодиска показывает пик на высоте эталонного пика MSP1E3D1, выбранное отношение липидов к MSP1E3D1 было слишком низким.

5. Подготовительная шкала 3 мл CECF реакционная установка

1. День 1: Подготовьте все необходимые складские растворы, как указано в таблице 3). Запасы хранят при -20 °C и размораживают при комнатной температуре. Обязательно тщательно перемешайте все запасы после размораживания и перед пипеткой. Рассчитайте необходимые объемы для всех запасов и составьте схему пипетки (табл. 4). Высокомолекулярные соединения будут добавляться только в РМ. Для низкомолекулярных соединений может быть приготовлен комбинированный 3 х мастермикс для RM и FM.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Конечные объемы составных смесей могут быть меньше расчетных из-за потерь объема во время перемешивания. Этого можно избежать, добавив избыточный объем в 2-5%, чтобы компенсировать потерю объема.
2. Уравновешивают мембрану диализной кассеты объемом 3 мл в трисацетате 100 мМ, рН 8,0. Обязательно удалите лишний буфер.
3. Использование шприца для переноса РМ в диализную кассету. Удалите лишний воздух в отсеке RM путем аспирации с помощью шприца. Поместите диализную кассету в диализную камеру.
4. Заполните диализную камеру 60 мл FM. Поместите крышку на камеру и затяните винты, чтобы зафиксировать ее. Инкубировать камеру в течение 12-16 ч при 30 °C при 200 об/мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что камера остается в вертикальном положении во время перемешивания, иначе обмен низкомолекулярными соединениями будет затруднен.
5. День 2: Используя шприц, аспирируйте РМ из диализной камеры. Переложите РМ в свежие пробирки и центрифугу при 16 000 х г при 4 °C в течение 10 мин для удаления осадка. Перенесите супернатант в свежие пробирки. Белок в супернатанте теперь может быть дополнительно проанализирован.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях гранула будет присутствовать после центрифугирования. Это может предоставить важную информацию о пригодности анализируемых нанодисков или реакционных соединений для поддержания синтезированного РАСТВОРИМОГО МП. Поэтому целесообразно проанализировать количество мишени, потенциально присутствующей в осадке, с помощью SDS-PAGE, Western Blot или путем визуальной оценки размера гранул.

6. Аналитическая шкала 60 мкл CECF реакционная установка для скрининга ионов Mg²⁺

1. День 1: Смешайте все компоненты соответствующего 3-кратного мастер-микса и распределите 60 мкл на RM и 825 мкл на FM. Заполните FM H₂O и смешайте FM путем вихря. Перенос FM в 3 скважины из 24 скважин микропластин (табл. 5).
   ПРИМЕЧАНИЕ: Поскольку индивидуальный контейнер Mini-CECF может быть недоступен, объемы в таблице 5 рассчитаны для реакции, проводимой в диализных картриджах (10-14 кДа MWCO, RM: 100 мкл) с FM-объемом 1,7 мл в 96 пластинах глубокой скважины (2 мл) (рисунок 1).
2. Регенерированные целлюлозные диализные трубки с MWCO 10-14 кДа на куски размером примерно 25 x 20 мм и хранить в H_2Oс 0,05% (мас./об.) азида натрия.
   ВНИМАНИЕ: Азид натрия очень токсичен. Избегайте любого контакта с кожей или слизистой оболочкой. Не используйте металлические контейнеры, так как азид натрия может вступать в реакцию с металлами с образованием взрывоопасных азидов металлов.
3. Перед сборкой контейнера Mini-CECF удалите избыточный_H2Oиз мембран диализа с помощью ткани. Поместите по одному фрагменту мембраны на каждый контейнер и закрепите мембраны политетрафторэтиленовым кольцом.
4. Перенесите контейнер Mini-CECF в колодцы 24-луночной плиты с 825 мкл FM. Избегайте пузырьков воздуха ниже диализной мембраны контейнера Mini-CECF.
5. Добавьте высокомолекулярные компоненты в RM, как описано (таблица 5), и перемешайте путем пипетки вверх и вниз. Добавьте 60 мкл в реакционный контейнер. Избегайте пузырьков воздуха во время переноса вязкого раствора.
6. Вырежьте 2 листа уплотнительной термопластичной пленки размером 8 х 10 см и оберните их вокруг 24-луночной пластины с реакционными контейнерами внутри. Это уменьшит испарение из реакционной смеси. Теперь поместите крышку пластины для культивирования клеток на пластину и закрепите ее скотчем. Инкубируют пластину при 30 °C и перемешивании 200 об/мин в течение 12-16 ч.
7. День 2: Собирают реакционную смесь путем прокалывания через мембрану диализа с наконечником пипетки в контейнере Mini-CECF и аспирируют RM. Переложите RM в свежие трубки и центрифугу при 16 000 x g при 4 °C в течение 10 мин для удаления осадков. Перенесите супернатант в свежие пробирки. Белок в супернатанте теперь может быть дополнительно проанализирован.
   ПРИМЕЧАНИЕ: В некоторых случаях после центрифугирования будет присутствовать гранула. Это может предоставить важную информацию о пригодности анализируемых нанодисков или других реакционных соединений для поддержания синтезированного МП растворимым. Поэтому целесообразно анализировать количество мишени, потенциально присутствующей в осадке, с помощью SDS-PAGE, Western Blot или визуальной оценки размера гранул.

Иллюстрируется влияние тонко настраиваемых реакционных соединений на конечный выход или качество синтезированных МП. Частым рутинным подходом является корректировка оптимальной концентрации Mg²⁺ в реакциях CF путем экспрессии зеленого флуоресцентного белка (GFP) в качестве удобного монитора эффективности системы. В качестве примера GFP синтезировали из вектора pET-21a(+) при концентрациях Mg²⁺ между 14 и 24 мМ (рисунок 2). Анализ SDS-PAGE выявил оптимальную концентрацию Mg²⁺ при 20 мМ (рисунок 2A), что хорошо согласуется с дополнительными измерениями флуоресценции (возбуждение при 485 нм, измерение излучения при 535 нм) супернатанта реакции CF (рисунок 2B). Для экспрессии CF бактериального PR, экспрессируемого из вектора pIVEX 2.3, и адренергического рецептора индейки β₁ (Tβ₁AR), экспрессированного из вектора pET-21a(+), оптимальная концентрация Mg²⁺ была идентифицирована при 20-22 мМ.

В качестве дополнительного примера показана качественная доработка синтезированных депутатов с описанной стратегией. Настраиваемыми параметрами для совместной трансляционной вставки МП в предварительно сформированные нанодиски являются (i) липидный состав нанодисковой мембраны и (ii) конечная концентрация нанодиска в реакции. Хорошо известно, что гидрофобная среда является важным параметром для правильного складывания, олигомерной сборки и стабильности депутатов. Поскольку липидный состав в нанодисках может модулироваться, описанный подход позволяет проводить прямой систематический скрининг липидных эффектов на структуру и функцию МП. В первоначальных экспериментах рекомендуется проводить скрининг липидов с помощью головных групп фосфатидилхолина (ПК) и фосфатидилглицерина (ПГ) и тестировать различные длины цепей и насыщения. Показано влияние мембранного состава и концентрации нанодисков на эффективность и качество солюбилизации двух разных МП. PR представляет собой легко активированный протонный насос и очень стабильный и высоко синтезированный МП, достигающий конечных концентраций > 100 мкМ в RM. Таким образом, рекомендуется использовать его в качестве положительного контроля для обеспечения правильной настройки реакции, поскольку концентрацию PR можно легко оценить путем измерения поглощения при 530 нм в супернатанте RM. Напротив, Tβ₁AR является примером большого семейства эукариотических рецепторов, связанных с G-белком (GPCR), и является сложным и нестабильным MP. Для удобного мониторинга синтезировали конструкцию синтеза Tβ₁AR-GFP и определяли общую концентрацию солюбилизированного нанодискового рецептора в реакциях CF с помощью флуоресценции GFP (рисунок 3A). Фракцию функционально свернутого и лигандсвязывающего активного рецептора дополнительно определяли с помощью фильтрующего связывающего анализа и меченого лиганда [³H]-дигидроальпренолола (фиг.3В). Анализ связывания фильтра выполняли, как описано ранее¹⁴. Вкратце, концентрацию_Tβ1AR-GFP в RM определяли с помощью его флуоресценции. GPCR инкубировали с радиомеченным лигандом в течение 1 часа при 20 °C, наносили на фильтр, а несвязанный лиганд смывали. Для определения неспецифического связывания [³H]-дигидроальпренолола рецептор насыщали немаркированным альпренололом в контрольной реакции. Количество радиоактивного лиганда в фильтрах измеряли в сцинтилляционном счетчике, а количество связанного лиганда определяли по его специфической активности на этикетке. Процент активности связывания GPCR затем рассчитывали из количества связанного лиганда, концентрации Tβ₁AR-GFP и объема анализа. Общий синтез и нанодисковая солюбилизация Tβ₁AR-GFP аналогичны всем анализируемым мембранным композициям и находятся в диапазоне 8-13 мкМ (рисунок 3А). Напротив, гораздо более высокая вариация обнаруживается в качестве синтезированного GPCR. Наименьшая активность при менее чем 10% активной фракции получается с липидами DMPC и POPC. С помощью DOPG и POPG активная фракция Tβ₁AR-GFP может быть увеличена примерно до 30% (рисунок 3B). Результаты показывают, что заряд липидной головной группы, а также гибкость цепи жирных кислот являются важными модуляторами для сворачивания и активности этого GPCR.

Помимо нанодискового состава, их конечная концентрация в реакции CF может быть важным фактором качества MP. После того, как подходящий мембранный состав нанодиска был идентифицирован, его концентрация во время синтеза МП должна быть проверена. Очевидно, что концентрация нанодисков должна быть скорректирована в соответствии с эффективностью экспрессии MP. Синтез CF рецептора Tβ₁AR-GFP и PR приводит к конечным концентрациям приблизительно 10 мкМ и 100 мкМ в RM, соответственно. Если концентрацию нанодиска экранируют в диапазоне 3,75-60 мкМ, то получается полная солюбилизация GPCR примерно на 30 мкМ нанодисков, что дает соотношение Tβ₁AR:нанодиск 1:3 (рисунок 4A). Напротив, полная солюбилизация PR уже достигается с помощью нанодисков приблизительно 10 мкМ и дает соотношение PR:нанодиск 10:1 (рисунок 4B). Поэтому избыток нанодисков необходим для достижения почти полной солюбилизации Tβ₁AR-GFP, в то время как перевернутое соотношение в случае PR указывает на вставку нескольких копий PR в один нанодиск. Последующие исследования очищенных pr/нанодисковых комплексов с нативной масс-спектрометрией подтвердили это наблюдение и обнаружили распространенность более высоких олигомерных форм PR при синтезе при более низких концентрациях нанодисков^15,18. Поэтому титрование синтезированных CF МП с нанодисками может быть использовано в качестве инструмента для запуска олигомерных сборок и изучения их влияния на функцию MP.

Рисунок 1: Стратегия экспрессии CECF для вставки мембранных белков в нанодиски. (A) Базовый рабочий процесс, иллюстрирующий основные этапы этого процесса. (B) Специализированные реакционные сосуды аналитической шкалы для экспрессии CECF. (C) Коммерчески доступные диализные картриджи для установки аналитической шкалы CECF. (D) Установка подготовительной шкалы (3 мл RM), включая диализную кассету 3 мл и индивидуальный контейнер FM из плексигласа. (E) Совместная трансляционная вставка МП в предварительно сформированные нанодиски и липидный скрининг в конфигурации CECF. RM содержит необходимые механизмы транскрипции/трансляции и нанодиски, в то время как низкомолекулярные соединения присутствуют в обоих отсеках. Биохимическое и структурное применение полученных образцов MP/нанодисков дополнительно проиллюстрировано. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Влияние различных концентраций Mg²⁺ на синтез CF GFP. GFP синтезировали в реакциях CF с концентрациями Mg²⁺ в диапазоне 14-24 мМ. (A) Анализ SDS-PAGE показывает самую сильную полосу GFP при 20 мМ Mg²⁺. М: Маркер. (B) Флуоресценция GFP после экспрессии CF с различными концентрациями Mg²⁺ . Максимальная флуоресценция GFP при 20 мМ Mg²⁺ соответствует 4,6 мг/мл. Полосы погрешностей представляют собой стандартное отклонение повторяющегося измерения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Влияние состава мембраны нанодиска на солюбилизацию и качество синтезированного CF GPCR. Выход и активность_Tβ1AR-GFP синтезируются в присутствии 30 мкМ нанодисков, содержащих различные мембранные композиции. Общий синтезированный белок (А) и фракция лигандсвязывающего активного рецептора (В) приведены в мкМ. Общую концентрацию определяли путем флуоресцентного измерения синтеза GFP. Активность измеряли с помощью фильтрующего связывающего анализа с радиомеченным лигандом [³H]-дигидроальпренололом. Полосы погрешностей представляют стандартные отклонения независимых трипликатов. Данные взяты из ранее опубликованной рукописи¹⁴. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Солюбилизационный экран синтезированных МФ МП с увеличением концентраций нанодисков. МП синтезировали в присутствии поставляемых нанодисков в диапазоне 3,75-60 мкМ. (A) Экспрессия_Tβ1AR-GFP с нанодисками (DMPC) в реакции CF. Общую концентрацию определяли с помощью флуоресцентного измерения синтеза GFP. Данные взяты из ранее опубликованной рукописи¹⁴. Очищенные образцы с аффинной меткой были проанализированы методом SDS-PAGE, и окрашивание Coomassie-Blue показывает две заметные полосы, соответствующие Tβ₁AR-GFP при приблизительно 50 кДа и MSP1E3D1 выше 25 кДа (B) Экспрессия PR с нанодисками (DOPG) в реакции CF. Общую концентрацию PR определяли путем измерения поглощения при 530 нм. Данные взяты из ранее опубликованной рукописи^10,18. На фотографиях показан красный цвет окончательных реакций из-за наличия сложенного пиара. Пиктограммы иллюстрируют модулированную сборку PR в сторону более низких олигомерных конформаций при повышенных концентрациях нанодисков, как это было выявлено последующей собственной масс-спектрометрией¹⁸. Очищенные образцы с аффинной меткой были проанализированы с помощью SDS-PAGE и окрашивания Coomassie-Blue показывают две заметные полосы, соответствующие PR примерно на 20 кДа и MSP1E3D1 выше 25 кДа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Критические скрининговые компоненты реакций МВ.

Таблица 2: Соотношение липидов к MSP1E3D1 для монтажных установок in vitro объемом 3 мл.

Таблица 3: Приготовление стоковых растворов CF.

Таблица 4: Схема пипетирования для реакции CECF с 3 мл RM и 60 мл FM

Таблица 5: Схема пипетирования для экрана концентрации Mg²⁺ со 100 мкл RM и 1,7 мл FM.

Описана установка и стратегии оптимизации экспрессии CF и котрансляционной вставки функциональных МП в нанодиски. Требуемое оборудование включает в себя биореактор, френч-прессовое устройство или аналогичное, УФ/ВИС и флуоресцентный считыватель, реакционные сосуды CF, подходящие для двухкамерной конфигурации, и инкубатор с контролируемой температурой. Другим стандартным оборудованием являются центрифуги для сбора клеток E. coli, а также настольные центрифуги, достигающие не менее 30 000 х г для получения лизатов S30. Если необходимо приготовить лизаты S80-S100, необходимы ультрацентрифуги. Указанное оборудование регулярно доступно в биохимических лабораториях, и для начала работы с муковисцидозом не требуется больших первоначальных инвестиций. Кроме того, ферментация и обработка клеток E. coli для препаратов CF лизата и T7RNAP являются распространенными и надежными методами. Самыми дорогими соединениями являются CF лизат, T7RNAP и нанодиски. Они могут быть подготовлены по надежным и эффективным протоколам, а аликвоты стабильны в течение многих лет при -80 °C. Протоколы требуют три дня каждый для приготовления CF лизата и T7RNAP и приблизительно одну неделю для экспрессии и очистки MSP и подготовки нанодисков. Целевая шаблонная ДНК может быть предоставлена с использованием pET-21, pIVEX или аналогичных векторных систем. Для настройки и оптимизации систем экспрессии CF в качестве монитора^20,32 может быть использовано производство вариантов GFP, таких как shifted GFP (GFP+) или superfolderGFP. Для условий производства MP выражение PR является хорошей модельной системой или положительным контролем, поскольку она складывается во многих различных условиях и может легко контролироваться поглощением при 530 нм 10,15,18. Для создания эффективного протокола выражения CF для нового MP рекомендуется оптимизация кодона целевого кадра считывания и использование слияний с C-концевым присоединением GFP^25,26. Другие необходимые материалы включают химические вещества и ферменты, которые являются коммерчески доступными. Эти компоненты должны быть получены в высоком качестве, и общий расчет стоимости для описанной реакции CF с 3 мл RM и 60 мл FM составит примерно 150-200 €. Поэтому основным применением систем экспрессии муковисцидоза является производство белков, которые трудно получить в классических клеточных системах экспрессии, таких как многие МП или токсины. Кроме того, системы CF являются основными платформами в синтетической биологии, и постоянно растущие области применения делают их все более незаменимыми в качестве инструмента в молекулярных исследованиях. Среди прочего, рутинными приложениями являются маркировка белков, высокопроизводительные процессы или синтетический дизайн клеток.

Продемонстрированная стратегия позволяет производить без моющих средств чистые МП, уже вставленные в желаемые липидные среды высокорастворимых нанодисков. После того, как протокол экспрессии CF для MP установлен и оптимизирован, производство происходит очень быстро, и чистые образцы могут быть получены менее чем за 24 часа даже в подготовительном масштабе. Комплексы MP/nanodisc очищают непосредственно от реакции CF с помощью меток стрептавидина II или полигистидина, прикрепленных к MP. Этот процесс позволяет проводить параллельный функциональный и структурный анализ идентичных образцов МП массивом различных методик³³. Таким образом, оперативность и эффективность стратегии конкурентоспособны по сравнению с традиционными подходами, использующими клеточные системы экспрессии и детергентную экстракцию МП из клеточных мембран с последующим рутинным восстановлением in vitro ^5,34. Открытая доступность реакций МВ дополнительно облегчает многочисленные уникальные механистические исследования складывания МП и мембранной вставки 15,16,18, комплексной сборки МП 15,18,24 или функциональной регуляции²³.

Важным отличием экспрессии МУКовисцидоза от клеточной экспрессии является отсутствие систем контроля качества синтезированного белкового продукта. Любой переведенный полипептид, независимо от его функционального складывания, в конечном итоге попадет в образец конечного продукта. Кроме того, процесс вставки в нанодисковые мембраны является искусственным и транслоконнезависимым и может привести либо к неполной интеграции, либо может вообще не работать с рядом мишеней MP. Таким образом, фракция солюбилизированного продукта в реакции CF может быть довольно неоднородной, содержащей полностью вставленные, но также только частично интегрированные или связанные с мембраной МП. Следовательно, только небольшая часть очищенного образца комплексов MP/nanodisc может быть функционально свернута. Модификация состава мембраны и тщательная тонкая настройка соотношения MP к нанодискам путем модуляции концентраций нанодисков и шаблонов ДНК являются подходящими инструментами для оптимизации. Тем не менее, последующие подходы к контролю качества, такие как профилирование исключения размеров и целевые количественные функциональные анализы, всегда необходимы для оптимизации протоколов экспрессии CF. Таким образом, доступность таких анализов может ограничить применение, особенно в проектах, включая депутатов, которым требуются липосомные среды для таких функций, как транспортеры, каналы или насосы. Кроме того, ограничения по размеру нанодисков могут ограничивать вставку больших сборок MP.

В документированных примерах вариация функционально свернутой фракции GPCR Tβ₁AR-GFP находится в пределах нескольких процентов, примерно до 30%. Функциональное складывание требует тщательной настройки ряда параметров¹⁴ , и аналогичный индивидуальный и утомительный процесс оптимизации может потребоваться и для других GPCR, а также²². Тем не менее, окончательно достигнутый выход функционально свернутого GPCR конкурентоспособен с другими производственными системами и позволяет установить > 1000 радиоанализов для исследований связывания лигандов из одной реакции 60 мкл в аналитической шкале реактора Mini-CECF. Стоит отметить, что исследования связывания лигандов конструкций слияния GPCR-GFP не требуют каких-либо этапов очистки. При необходимости очистка может быть достигнута путем использования аффинных меток, прикрепленных к синтезированному MP, таких как His-метки или Strep-tag II. Затем РМ разбавляют в желаемом буфере и загружают на соответствующую графу аффинной хроматографии, которая была предварительно уравновешена соответствующим образом. Структурная оценка PR и других синтезированных МВ МП с помощью ЯМР-спектроскопии или кристаллизации уже помогла создать системы экспрессии МВ в качестве основных платформ в исследованиях МП. Описанная стратегия производства MP/нанодисковых комплексов может стать особенно интересной для будущих структурных исследований с помощью электронной микроскопии.

Авторам нечего раскрывать.

Мы хотели бы поблагодарить грант Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG) BE1911/8-1, проект LOEWE GLUE и совместный исследовательский центр Transport and Communication across Membranes (SFB807) за финансовую поддержку.