膜蛋白共翻译插入预成型纳米盘

共翻译插入到预先形成的纳米盘中，使得在定义的脂质环境中研究无细胞合成的膜蛋白成为可能，而无需与去垢剂接触。该协议描述了基本系统组分的制备以及提高表达效率和样品质量的关键参数。

无细胞表达系统允许对反应环境进行定制设计，以支持即使是复杂蛋白质（如膜蛋白）的功能折叠。演示了将膜蛋白共翻译插入和折叠到作为纳米盘提供的预成型和定义的膜中的实验程序。该方案完全不含洗涤剂，可在一天内产生毫克纯化样品。所得的膜蛋白/纳米盘样品可用于各种功能研究和结构应用，如结晶、核磁共振或电子显微镜。描述了基本关键组分的制备，例如无细胞裂解物、具有设计膜的纳米盘、关键储备溶液以及双室无细胞表达反应的组装。由于膜蛋白的折叠要求可能高度多样化，因此该协议的主要重点是调节对样品质量很重要的参数和反应步骤，例如关键碱性反应化合物，纳米盘的膜组成，氧化还原和伴侣环境或DNA模板设计。整个过程通过蛋白视紫红质和G蛋白偶联受体的合成得到证明。

膜蛋白（MPs）由于其在水环境中的不溶性，是蛋白质生产研究中具有挑战性的靶标。传统的MP生产平台包括基于细胞的系统，如大肠杆菌、酵母或真核细胞。合成的重组MP要么从细胞膜中提取，要么从包涵体¹中重新折叠。洗涤剂溶解后，MPs可以通过建立的体外复溶方案转移到合适的膜环境中。除了囊泡和脂质体外，MP以纳米盘²或salipro³颗粒的形式重建为平面膜已成为最近常规技术。然而，所有这些策略都意味着洗涤剂与MP接触可能导致不稳定，低聚物解离，甚至蛋白质结构^{和活性丧失}4。因此，筛选最佳的洗涤剂增溶和复溶条件可能既繁琐又耗时^5。

无细胞（CF）系统的开放性允许表达反应直接提供具有确定脂质组成的预制膜。在这种基于脂质的表达模式（L-CF）中，合成的MP有机会共平移插入到提供的双层^6，7 中（图1）。由围绕平面脂质双层盘⁸ 的膜支架蛋白（MSP）组成的纳米盘似乎特别适合于此策略^9，10。纳米盘可以常规地与各种不同的脂质在体外组装，它们非常稳定，并且储备液可以浓缩到1mM。然而， 大肠杆菌 中的MSP表达及其纯化是必要的。作为一种替代策略，MSP可以在脂质体^11，12，13提供的CF反应中与目标MP共同表达。将MSP和MP的DNA模板添加到反应中，并且在表达时可以形成MP /纳米盘。虽然避免了MSP的产生，但共表达策略需要仔细微调最终的DNA模板浓度，并且可以预期样品生产效率的变化更大。

MPs共翻译插入预成型纳米盘的膜是一种非生理的，并且在很大程度上仍然未知的机制，独立于易位机器和信号序列¹³，¹⁴，^15，16。插入效率的主要决定因素是膜蛋白的类型以及所提供膜的脂质组成，通常首选带负电荷的脂质^15，17。由于纳米盘膜的尺寸相对受限，因此在MP插入¹⁸时释放了大量的脂质。纳米盘尺寸的变化使得插入和调谐更高的低聚MP配合物^15，18。其中，离子通道KcsA，离子泵蛋白视质（PR）和多药转运蛋白EmrE^15，18显示了同源低聚复合物的正确组装。MPs可能以相对相等的频率从两侧进入对称纳米盘膜。因此，应该考虑到插入一个纳米盘的不同单体或低聚物可能具有相反的方向。然而，方向偏差可能是由PR六聚体和KcsA四聚体¹⁸形成的合作插入机制引起的。MP取向的进一步偏差可能是由于插入的MP的方向开关可能在纳米盘膜的边缘。

从大肠杆菌菌株生产CF裂解物是一种可靠的常规技术，几乎可以在任何生化实验室中进行^19，20。应该考虑到，除了二硫键形成外，如果使用大肠杆菌裂解物合成MP，则大多数其他翻译后修饰都不存在。虽然这可能会为结构研究产生更均匀的样本，但可能有必要排除对单个MP靶标功能的潜在影响。然而，在大肠杆菌CF裂解物中有效生产G蛋白偶联受体（GPCR）14，²¹，22^，真核转运蛋白23或大型异构体组装体²⁴的高质量样品表明它们甚至适用于复杂的靶标。制备级量（≈ 1 mg/mL）的样品可以通过由反应混合物（RM）和进料混合物（FM）室组成的双室连续交换无池（CECF）配置获得。FM体积超过RM体积15至20倍，并提供低分子量能量化合物和前体的储存库¹⁹。因此，表达反应延长数小时，MP靶标的最终产率增加。RM和FM隔室由截止时间为10-14 kDa的透析膜隔开。两个隔室需要CECF反应容器的特殊设计（图1）。作为RM容器的商用透析盒与固定FM的定制有机玻璃容器相结合就是合适的例子。MP产量可以通过修改RM:FM比率或在一定孵育一段时间后交换FM来进一步操纵。

MP的产量和质量经常需要对反应参数进行严格优化。CF表达的一个重要优点是可以根据MP的个性化要求修改和微调几乎任何化合物。一个简单的策略是首先通过建立基本的生产方案来提高MP的产量，然后通过微调反应和折叠条件来优化MP质量。CF裂解物中没有生理过程，其复杂性降低，因此^MPs25的有效生产成功率很高。在大多数情况下，DNA模板设计和优化Mg 2⁺离子浓度的常规考虑因素足以获得令人满意的产率²⁶。根据表达模式的不同，MP质量的优化可能会变得非常耗时，因为需要筛选更多种类的参数¹⁴，^17，22。

为了建立所描述的CF表达平台，需要生产 大肠杆菌 CF裂解物（i），T7 RNA聚合酶（ii），纳米盘（iii）和碱性CECF反应化合物（iv）（图1）的方案。 大肠杆菌 K12 菌株 A19²⁷ 或 BL21 衍生物经常用于制备高效的 S30（以 30，000 x g 离心）裂解物。除 S30 裂解物外，还可以使用在其他 g 力（例如 S12）下离心的相应裂解物。裂解物在表达效率和蛋白质组复杂性方面有所不同。对所述方案制备的S30裂解物的蛋白质组进行了详细研究²⁸。S30蛋白质组仍然含有一些残留的外膜蛋白，这些蛋白可能会在离子通道的表达和分析时产生背景问题。对于此类靶标，建议使用 S80-S100 裂解物。裂解物制备过程中有价值的修饰是在细胞的对数生长中期通过热休克和乙醇供应相结合来诱导SOS反应。所得的HS30裂解物富含伴侣，可与S30裂解物共混，以改善MP折叠²²。 大肠杆菌 裂解物中的CF表达作为偶联转录/翻译过程操作，DNA模板含有由T7 RNA聚合酶（T7RNAP）控制的启动子。该酶可以在携带pAR1219质粒²⁹的BL21（DE3）星形细胞中高效生产。

MSP1E3D1的两个拷贝组装成一个直径为10-12nm的纳米盘，但下面描述的协议也可能适用于其他MSP衍生物。然而，比用MSP1E3D1形成的纳米盘大的纳米盘往往不太稳定，而用MSP衍生物（如MSP1）形成的较小的纳米盘可能无法容纳较大的MP或MP复合物。MSP1E3D1纳米盘可以在体外与各种不同的脂质或脂质混合物组装。预制纳米盘通常在-80°C下稳定>1年，而不同脂质成分的稳定性可能有所不同。为了筛选脂质对MP折叠和稳定性的影响，有必要制备一套由代表性的脂质/脂质混合物组装而成的纳米盘。以下脂质可以给出良好的起始选择:1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油）（DMPG）、1，2-二肉豆蔻酰-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DMPC）、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸-rac-（1-甘油）（DOPG）、1，2-二油酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱（DOPC）、1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-（1'-rac-甘油）（POPG）和1-棕榈酰基-2-油酰基甘油-3-磷酸胆碱（POPC）。

描述了制备3mL CECF反应的方案。可以以 1:1 的比例进一步向上或向下缩放。对于双室CECF配置，必须制备包含所有化合物的RM和仅包含低分子量化合物的FM。具有 10-14 kDa MWCO 的商用 3 mL 透析设备可用作 RM 容器，然后将其放入装有 FM 的定制有机玻璃容器中（图 1D）³⁰。RM:FM的比例为1:20，因此必须为3 mL RM制备60 mL FM。 几种组分的质量、浓度或类型对于合成MP的最终产量和/或质量至关重要（表1）。DNA模板应根据已发表的指南制备，并对靶标的阅读框进行密码子优化，可进一步显著提高产物收率²⁶。对于制备级CECF反应，描述了用于生产PR的既定方案。为了建立新MP的表达方案，通常需要对某些化合物进行优化筛选（表1）以提高产量和质量。对于Mg²⁺ 离子，确实存在聚焦良好的最佳浓度，该浓度经常显示不同DNA模板的显着差异。其他CF反应化合物，如新批次的T7RNAP或S30裂解物，可能会进一步改变最佳Mg²⁺ 浓度。作为示例，描述了在14-24mM浓度范围内并以2mM步长的典型Mg²⁺ 筛选。每种浓度一式两份和分析规模的CECF反应中筛选。作为CECF反应容器，定制的Mini-CECF Plexiglas容器³⁰ 与容纳FM的标准24孔微孔板结合使用（图1B）。或者，可以使用商业透析柱与96深孔微孔板或其他适当设置的商用透析器装置的组合（图1C）。

1. S30裂解物的制备

1. 第一天: 从LB琼脂平板上的甘油储备液中划出细胞，并在37°C孵育过夜。
2. 第二天: 用琼脂平板上的细胞接种200mLLB培养基，并在37°C下孵育12-14小时。
3. 第三天:接种10 L无菌YPTG培养基（10 g / L酵母提取物，16 g / L胰蛋白胨，5 g / L NaCl，19.8 g / L葡萄糖，4.4 mM KH 2 PO 4，8 mM K₂HPO₄）在15 L搅拌釜式反应器中回火至37°C，并加入100 mL预培养物（1:100）。在37°C，500rpm和高曝气（每分钟~3个空气量）下培养。为防止过度起泡，请添加无菌消泡剂。
4. 以固定的时间间隔测量 600 nm 处的光密度 （OD）。大约2小时后，培养物将进入对数阶段。
5. HS30裂解物的改性: 当细胞处于对数中期（OD 600≈3.6-4.2）时，向培养基中加入300mL乙醇，并在42°C，500rpm和高通气（每分钟约3个空气体积）下再培养45分钟。然后按照步骤1.6中的说明继续冷却和收获细胞培养物。对于标准S30裂解物的生产，请跳过此步骤并继续执行步骤1.6。
6. 当细胞处于对数中期（OD 600≈3.6-4.2）时，在30分钟内将发酵罐冷却至20°C以下<。最终的OD 600应该在4.5-5.5左右。在4°C下以4，500×g收获细胞20分钟，并弃去上清液。在以下步骤中将细胞保持在4°C。
   注意:在冷却过程中，可能会发生过多的泡沫。在这种情况下，添加消泡剂或降低搅拌速度和/或减少生物反应器中的气流。
7. 使用刮刀将细胞完全悬浮在 300 mL S30-A 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2、14 mM Mg（OAc）2、60 mM KCl、6 mM ₂-巯基乙醇）中，然后上下移液悬浮液直至均匀。在4°C下以8，000× g 离心10分钟。 重复此步骤两次。
   注意:2-巯基乙醇有毒。避免接触皮肤或呼吸道。如果可能的话，在引擎盖下工作。在最后一个洗涤步骤之前称量空离心杯。离心后，称量湿细胞沉淀，然后继续步骤1.8或储存沉淀直至进一步使用。
   注意:湿细胞沉淀的重量为每1升生物反应器培养物5-7克。此时，方案可以暂停，沉淀可以在液氮中冷冻并在-80°C下储存4-8周。
8. 将细胞彻底悬浮在 1.1 体积 （1 g = 1 mL） 的 S30-B 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2、14 mM Mg（OAc）₂、60 mM KOAc、1 mM DTT、1 片 cOmplete 蛋白酶抑制剂）中。将悬浮液填充到预冷的法国压力单元中，并在 1，000 psig 下破碎细胞。将单元格通过法式印刷机一次。
9. 将裂解物在4°C下以30，000× g 离心30分钟。 将上清液转移到新管中并重复离心步骤。
   注意:第一次离心后，沉淀顶部可能存在松散和粘稠的层，不应与上清液一起转移。
10. 应用高盐和加热步骤去除不稳定的裂解物成分并从核糖体中释放mRNA。将裂解物调节至0.4M NaCl，并在42°C下在水浴中孵育45分钟。
    注意:此步骤将导致显着的沉淀形成。在孵育期间不时翻转或倒置试管。
11. 将浑浊悬浮液（通常为 50-80 mL）转移到截止浓度为 10-14 kDa 的透析管中，并用 5 L S30-C 缓冲液（10 mM Tris-HCl，pH 8.2，14 mM Mg（OAc）₂，60 mM KOAc，0.5 mM DTT）透析。2-3小时后更换S30-C透析缓冲液，再透析12-14小时。
12. 第四天: 将透析悬浮液转移到离心管中，并在4°C下以30，000× g 离心30分钟。 将上清液（S30裂解物）转移到新鲜的50 mL管中并轻轻混合。裂解物的蛋白质浓度应约为30-40mg / mL。在液氮中冲击冷冻等分试样（例如0.5mL，1mL），并储存在-80°C。 等分试样稳定>1年。

2. T7 RNA聚合酶的表达和纯化

1. 第一天: 用新鲜接种的BL21（DE3）星形x pAR1219细胞接种含有100μg/ mL氨苄青霉素的200mL LB培养基，并在37°C和180rpm下孵育12-16小时。
2. 第二天: 将 1 L 极好的肉汤（12 g/L 胰蛋白胨、24 g/L 酵母提取物、4 mL/L 甘油）接种在装有 10 mL 预培养物的 2 L 挡板烧瓶中，并在 37 °C 和 180 rpm 搅拌下孵育。起始 OD 600 应在 0.1 左右。
3. 当OD 600达到0.6-0.9时，加入IPTG至终浓度为1mM以诱导T7RNAP表达并继续培养5小时。
4. 通过在4°C下以4，500× g 离心20分钟来收获细胞。 将细胞冷冻在液氮中并储存在-80°C。
   注意:协议可能在此处暂停。
5. 第三天: 向冷冻细胞沉淀中加入 30 mL 冰冷悬浮缓冲液（30 mM Tris-HCl，pH 8.0，含一片 cOmplete 蛋白酶抑制剂），并在室温下在水浴中解冻沉淀。然后，通过上下移液悬浮沉淀直至均匀。
6. 如上一节所述，使用法式压榨机进行细胞破碎，或根据制造商的建议使用超声设备。随后，在4°C下以20，000× g 离心30分钟，并将上清液转移到新管中。
7. 为了沉淀基因组DNA，缓慢地将硫酸链霉素添加到上清液中，并在轻轻搅拌下，直到达到3%（w / v）的终浓度。在4°C下轻轻搅拌孵育5-10分钟。在4°C下以20，000× g 离心30分钟。
8. 用0.45μm过滤器过滤上清液，并将其加载到柱体积（CV）为40mL的Q-琼脂糖柱上，使用蠕动泵以4mL/min的流速与2 CV平衡缓冲液（30 mM Tris-HCl，pH 8.0，10 mM EDTA，50 mM NaCl，5%甘油和10 mM 2-巯基乙醇）平衡。然后，将色谱柱连接到UV检测器，并继续用平衡缓冲液洗脱，直到280nm处的UV信号达到稳定的基线。
9. 以 3 mL/min 的流速以 50 mM 至 500 mM NaCl 的梯度洗脱 T7RNAP。收集 1 mL 级分，通过将每种馏分的 10 μL 与 2 x SDS 样品缓冲液混合，制备用于 SDS-PAGE 分析的样品。运行SDS-PAGE并用考马斯蓝R染色凝胶，T7RNAP应在大约90 kDa处显示为突出的条带以及许多其他杂质条带。
10. 含有T7RNAap的池级分，并使用具有12-14kDa MWCO的膜在透析缓冲液（10mM_K2 HPO 4 / KH₂PO₄，pH 8.0，10mM NaCl，0.5mM EDTA，1mM DTT，5%（w / v）甘油）中透析12-16小时。
11. 第四天: 收集 T7RNAP 溶液并使用具有 12-14 MWCO 的过滤装置浓缩至终浓度为 3-10 mg/mL。T7RNAP可能在浓缩过程中开始沉淀。一旦样品出现浑浊，立即停止浓缩。加入甘油至终浓度为50%（w / v）并轻轻混合。速冻0.5-1mL等分试样并储存在-80°C。 工作T7RNAP等分试样可以储存在-20°C。
    注意:应从 1 L 发酵中获得大约 20-40 mL 的 5 mg/mL 部分纯化的 T7RNAP，含 20，000-40，000 单位。为了测试每个T7RNAP批次的最佳量，应进行含有0.02mg / mL-0.1mg / mL制备的T7RNAP样品的绿色荧光蛋白（GFP）的CF表达反应。

3. MSP1E3D1的表达和纯化

1. 第一天:使用标准热冲击转化或电穿孔方案，用pET28（a）-MSP1E3D1载体³¹转化大肠杆菌BL21（DE3）星形细胞。在含有30μg/ mL卡那霉素的LB琼脂上划线或板转化细胞，并在37°C下孵育12-16小时。
2. 第二天: 接种200mL补充有0.5%（w / v）葡萄糖和30μg/ mL卡那霉素的LB培养基，从琼脂平板上挑选单个菌落，并在37°C下以180rpm孵育12-16小时。
3. 第三天: 在搅拌罐生物反应器中接种补充有 0.5% （w/v） 葡萄糖和 30 μg/mL 卡那霉素和 100 mL 预培养物的 10 L LB 培养基。在37°C，500rpm下进行发酵，每分钟曝气约3个生物反应器体积。在起泡过度的情况下，添加消泡剂。
   注意:可以使用带挡板的摇瓶代替发酵罐。
4. 在OD 600为6.5-7.5时，加入IPTG至终浓度为1mM，并继续在37°C下孵育1小时。通过在4°C下以4，500× g 离心20分钟来收获细胞。 用200mL的0.9%（w / v）NaCl洗涤细胞沉淀，并在4°C下以8，000× g 再次离心10分钟。 弃去上清液并使用刮刀将细胞转移到 50 mL 管中。预期的湿颗粒重量为每升生物反应器培养物8-12g。在液氮中速冻细胞沉淀并储存在-80°C直至进一步使用。
   注意:协议可以在此处暂停。
5. 第四天: 为了纯化，在室温水浴中解冻细胞沉淀。 将细胞悬浮在MSP-A缓冲液（40mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，1%（w / v）Triton X-100，每50mL细胞悬液1片c0mplete蛋白酶抑制剂混合物）中，以产生30-40%（w / v）细胞悬液。
6. 通过超声处理或使用法式压榨机破碎细胞，并在4°C下以30，000× g 离心30分钟。 将上清液转移到新管中并通过0.45μm过滤器过滤。使用蠕动泵将滤液涂在与5 CV的MSP-B缓冲液（40mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，1%（w / v）Triton X-100）平衡的Ni^{2 +} 负载的次氮基三乙酸柱（CV > 15 mL）上。
   注意:为了便于过滤，可以将上清液再超声处理一分钟以分解大的DNA片段。
7. 样品上样后，用 5 CV MSP-B、5 CV MSP-C（40 mM Tris-HCl，pH 8.9，300 mM 氯化钠，50 mM 胆酸）、5 CV MSP-D（40 mM Tris-HCl，pH 8.9，300 mM NaCl）、5 CV MSP-E（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl）和 5 CV MSP-F（40 mM Tris-HCl，pH 8.0， 300 mM 氯化钠，50 mM 咪唑）。
   注意:MSP-C缓冲液中的胆酸对于去除附着在MSP上的脂质很重要。胆酸在低pH值下不完全溶解。因此，在MSP-C和MSP-D中，pH值必须调节到8.9。用MSP-D缓冲液清洗色谱柱非常重要，因为较低的pH值可能会导致残留的胆酸沉淀并堵塞或损坏色谱柱。
8. 用MSP-G（40 mM Tris-HCl，pH 8.0，300 mM NaCl，300 mM咪唑）洗脱MSP。收集 1 mL 的馏分并监测 280 nm 处的紫外线吸收。收集并合并洗脱峰的馏分。
9. 将汇集的MSP级分转移到12-14kDa MWCO透析膜管中，并在4°C下对5L的MSP-H（40mM Tris-HCl，pH 8.0，300mM NaCl，10%（w / v）甘油）透析2-3小时。 更换为新鲜的5L MSP-H缓冲液，并在4°C下再透析12-16小时。
10. 第五天:将MSP溶液转移到离心管中，并在4°C下以18，000×g离心30分钟以除去沉淀物。将上清液转移到新管中，并在4°C下使用具有12-14kDa MWCO的超滤设备浓缩至200-800μM。 使用紫外可见分光度计测量设备测量浓度。使用消光系数27.31 M-1 ^cm-1和分子量31.96 kDa计算浓度。
    注意:在生物反应器中的表达通常每L培养物产生15-30mg的MSP1E3D1。
11. 将浓缩的MSP溶液在液氮中减震冷冻等分试样并储存在-80°C。

4. MSP1E3D1纳米盘的组装

1. 第一天: 在 100 mM 胆酸钠中制备 1-2 mL 的 50 mM 脂质储备液（DMPG、DOPG、POPG DMPC、DOPC 或 POPC）。如果在同一天不使用，则储存在-20°C。
   注意:脂质溶液必须澄清。如果溶液不澄清，胆酸钠浓度可以增加到150mM。
2. 将MSP1E3D1溶液与脂质溶液混合。加入终浓度为0.1%（w / v）的十二烷基磷酸胆碱（DPC）。组装反应可以调节至3 mL（表2）或12 mL的最终体积，对应于典型体积的透析盒（10 kDa MWCO）。在温和搅拌下在21°C孵育组装反应1小时。
   注意:对于每种脂质，必须使用特定的MSP1E3D1:脂质比以确保均匀的纳米盘制备（表2）。对于新的脂质或脂质混合物，应通过中试实验和体积排阻色谱分析确定最佳比例¹⁴。
3. 用椎间盘形成（DF）缓冲液（10mM Tris-HCl，pH 8.0，100mM NaCl）预润湿透析盒的膜。用注射器将组装混合物转移到透析盒中。潜在的气泡可以通过使用注射器抽吸去除。
4. 第1-4天: 使用搅拌棒在室温下在室温下对3 x 5 L DF缓冲液透析10-20小时。然后将组装混合物从透析盒转移到具有10 kDa MWCO的离心过滤单元中，该单元与DF缓冲液平衡。在4°C下浓缩4，000× g 。
   注意:浑浊的透析混合物可能表明MSP:脂质的化学计量比错误。沉淀物必须在4°C下以18，000× g 除去20分钟，然后才能浓缩样品。为避免样品浓缩过程中沉淀，请使用具有大死角的超滤装置。
5. 将组装好的纳米盘浓缩至至少300μM的浓度。 使用紫外可见光读数器测量浓度。考虑到一个纳米盘由两个MSP1E3D1分子形成，因此，MSP的浓度必须除以2才能确定正确的纳米盘量。
   注意:所述设置（表2）将产生0.6-1 mL的300 μM纳米盘溶液。
6. 将浓缩的纳米盘制剂在4°C下以18，000× g 离心20分钟以除去沉淀物。然后，吸出上清液并在液氮中速冻50μL等分试样并储存在-80°C。
   注意:建议使用体积排阻色谱法评估纳米盘形成的成功。样品应该是单分散的，并且应该只含有少量的聚集体。聚集体表明设置中的脂质量过高。作为参考，可以使用纯化的MSP1E3D1。如果纳米盘制备在参比MSP1E3D1峰的高度处显示峰，则所选脂质与MSP1E3D1的比率太低。

5. 制备级 3 mL CECF 反应装置

1. 第一天: 准备列出的所有必要的储备溶液（表3）。将储备储存在-20°C并在室温下解冻。确保在解冻后和移液前彻底混合所有原液。计算所有库存所需的体积并制定移液方案（表4）。高分子量化合物将仅添加到RM中。对于低分子量化合物，可以制备用于RM和FM的3 x预混液。
   注意:由于混合过程中的体积损失，化合物混合物的最终体积可能小于计算值。这可以通过添加 2-5% 的过量体积来补偿体积损失来避免。
2. 在 100 mM 三乙酸酯（pH 8.0）中平衡 3 mL 透析盒的膜。确保去除多余的缓冲液。
3. 使用注射器将RM转移到透析盒中。用注射器抽吸去除RM室中过多的空气。将透析盒放入透析室。
4. 用 60 mL 的 FM 填充透析室。 将盖子放在室上并拧紧螺钉以固定它。将室在30°C以200rpm孵育12-16小时。
   注意:确保在搅拌过程中腔室保持直立位置，否则会阻碍低分子化合物的交换。
5. 第二天: 使用注射器，从透析室吸出RM。将RM转移到新管中，并在4°C下以16，000× g 离心10分钟以除去沉淀物。将上清液转移到新鲜管中。现在可以进一步分析上清液中的蛋白质。
   注意:在某些情况下，离心后会出现沉淀。这可以提供有关所分析的纳米盘或反应化合物的适用性的重要信息，以保持合成的MP可溶性。因此，建议通过使用SDS-PAGE、蛋白质印迹或通过目视评估沉淀大小来分析沉淀物中可能存在的目标量。

6. 用于 Mg²⁺ 离子筛选的分析规模 60 μL CECF 反应装置

1. 第一天: 混合相应 3x 预混液的所有组分，并将 60 μL 分配给 RM，将 825 μL 分配给 FM。 用 H₂O 填充 FM，并通过涡旋混合 FM。将FM转移到24孔微孔板的3个孔中（表5）。
   注意:由于可能无法访问定制的Mini-CECF容器，因此计算表 5 中的体积是在透析柱（10-14 kDa MWCO，RM:100 μL）中进行的反应，FM体积为1.7 mL，在96个深孔（2 mL）板中（图1）。
2. 用 10-14 kDa MWCO 将再生纤维素透析管切成约 25 x 20 mm 大小的碎片，并储存在含有 0.05% （w/v） 叠氮化钠的 H₂O 中。
   注意:叠氮化钠毒性很大。避免与皮肤或粘膜接触。不要使用金属容器，因为叠氮化钠会与金属反应形成爆炸性金属叠氮化物。
3. 在Mini-CECF容器组装之前，用组织从透析膜中去除过量的H₂O。在每个容器上放置一个膜片，并用聚四氟乙烯环固定膜。
4. 将 Mini-CECF 容器转移到装有 825 μL FM 的 24 孔板的孔中。 避免 Mini-CECF 容器透析膜下方的气泡。
5. 如表5所示向RM中加入高分子组分，并通过上下移液进行混合。向反应容器中加入 60 μL。避免在转移粘性溶液时产生气泡。
6. 切割 2 张 8 x 10 cm 的密封热塑性薄膜片，并将它们包裹在 24 孔板上，反应容器在里面。这将减少反应混合物的蒸发。现在将细胞培养板的盖子放在板上并用胶带固定。将板在30°C和200rpm搅拌下孵育12-16小时。
7. 第二天: 通过在Mini-CECF容器上用移液管尖端刺穿透析膜并吸出RM来收获反应混合物。 将RM转移到新管中，并在4°C下以16，000× g 离心10分钟以除去沉淀物。将上清液转移到新鲜管中。现在可以进一步分析上清液中的蛋白质。
   注意:在某些情况下，离心后会出现沉淀。这可以提供有关所分析的纳米盘或其他反应化合物的适用性的重要信息，以保持合成的MP可溶性。因此，建议通过SDS-PAGE、蛋白质印迹或颗粒大小的目视评估来分析沉淀物中可能存在的靶标量。

举例说明了微调反应化合物对合成MP的最终产率或质量的影响。一种常见的常规方法是通过表达绿色荧光蛋白（GFP）来调整CF反应中的最佳Mg²⁺浓度，作为系统效率的便捷监测器。例如，GFP是由Mg 2+浓度在14至24mM之间的pET-21a（+）载体合成的（图2）。SDS-PAGE分析确定了20mM处的最佳Mg 2+浓度（图2A），这与CF反应上清液的互补荧光测量（485nm处激发，535nm处发射测量）非常吻合（图2B）。对于从pIVEX 2.3载体表达的细菌PR和从pET-21a（+）载体表达的火鸡β 1_肾上腺素能受体（Tβ₁AR）的CF表达，在20-22mM处鉴定最佳Mg²⁺浓度。

作为进一步的例子，显示了使用所述策略合成MP的质量细化。将MPs共翻译插入预成型纳米盘的可调参数是（i）纳米盘膜的脂质组成和（ii）反应中的最终纳米盘浓度。众所周知，疏水环境是MP正确折叠、寡聚组装和稳定性的重要参数。由于纳米盘中的脂质组成可以被调节，因此所描述的方法能够直接系统地筛选脂质对MP结构和功能的影响。在初始实验中，建议用磷脂酰胆碱（PC）和磷脂酰甘油（PG）头基筛选脂质，并测试不同的链长和饱和度。显示了膜组成和纳米盘浓度对两种不同MP的增溶效率和质量的影响。PR 是一种光激活质子泵和非常稳定且高度合成的 MP，在 RM 中达到 > 100 μM 的最终浓度。因此，建议将其用作阳性对照，以确保正确的反应设置，因为可以通过测量RM上清液中530nm处的吸收来轻松评估PR浓度。相比之下，Tβ₁AR是真核G蛋白偶联受体（GPCR）大家族的一个例子，并且是一种复杂且不稳定的MP。为了便于监测，合成了Tβ₁AR-GFP融合构建体，并通过GFP荧光测定CF反应中纳米盘可溶受体的总浓度（图3A）。使用过滤器结合测定和标记的配体[3H]-二氢阿丙洛尔进一步测定功能折叠和配体结合活性受体的分数（图3B）。如前所述进行过滤器结合测定¹⁴。简而言之，RM中的Tβ₁AR-GFP浓度是通过其荧光测定的。将GPCR与放射性标记的配体在20°C下孵育1小时，施加到过滤器上，并洗去未结合的配体。为了测定非特异性[^3H]-二氢阿泼洛尔结合，在对照反应中用未标记的阿普洛尔饱和受体。在闪烁计数器中测量过滤器中放射性配体的计数，并通过其特定的标记活性确定结合配体的量。然后根据结合配体的量，Tβ₁AR-GFP浓度和测定体积计算GPCR结合活性的百分比。Tβ₁AR-GFP的整体合成和纳米盘溶解与所有分析的膜组成相似，并且在8-13μM的范围内（图3A）。相比之下，在合成的GPCR质量中可以检测到更高的变化。活性组分低于10%的最低活性是使用脂质DMPC和POPC获得的。使用DOPG和POPG，Tβ₁AR-GFP的活性部分可以增加到约30%（图3B）。结果表明，脂质头基的电荷和脂肪酸链的柔韧性是该GPCR折叠和活性的重要调节剂。

除了纳米盘组成外，它们在CF反应中的最终浓度也是影响MP质量的重要因素。一旦确定了纳米盘的合适膜组成，就应筛选其在MP合成过程中的浓度。很明显，纳米盘浓度需要根据MP的表达效率进行调整。Tβ₁AR-GFP 受体和 PR 的 CF 合成导致 RM 中的最终浓度分别约为 10 μM 和 100 μM。如果在 3.75-60 μM 的范围内筛选纳米盘浓度，则在大约 30 μM 纳米盘下获得 GPCR 的完全溶解，得到 Tβ 1 AR:纳米盘的比例为₁:3（图 4A）。相比之下，使用大约 10 μM 纳米盘已经实现了 PR 的完全溶解，并且 PR:纳米盘比为 10:1（图 4B）。因此，过量的纳米盘是实现Tβ₁AR-GFP几乎完全溶解所必需的，而在PR的情况下，倒置比率表明将多个PR拷贝插入到一个纳米盘中。随后用天然质谱法对纯化的PR/纳米盘复合物的研究证实了这一观察结果，并发现如果在较低的纳米盘浓度下合成，则普遍存在较高的低聚形式PR15^，18。因此，用纳米盘滴定CF合成的MP可以用作触发低聚组装体和研究其对MP功能的影响的工具。

图1:将膜蛋白插入纳米盘的CECF表达策略。 （A） 说明流程主要步骤的基本工作流程。 （B） 用于CECF表达的定制分析规模反应容器。 （C） 用于分析规模CECF设置的市售透析盒。 （D） 制备型规模设置 （3 mL RM），包括 3 mL 透析盒和定制的有机玻璃 FM 容器。 （E） 将MPs共平移插入到预成型的纳米盘中，并在CECF配置中进行脂质筛选。RM包含所需的转录/翻译机制和纳米盘，而低分子量化合物存在于两个隔室中。进一步说明了生产的MP/纳米盘样品的生化和结构应用。 请点击此处查看此图的大图。

图2:不同Mg²⁺ 浓度对CF GFP合成的影响。GFP在CF反应中合成，Mg 2⁺ 浓度在14-24mM范围内。 （A） SDS-PAGE分析显示GFP在20 mM Mg²⁺时最强的条带。男:标记。 （B） 不同Mg²⁺ 浓度的CF表达后的GFP荧光。20 mM Mg²⁺ 下的最大 GFP 荧光对应于 4.6 mg/mL。误差线表示重复测量的标准偏差。 请点击此处查看此图的大图。

图3:纳米盘膜组成对CF合成GPCR的溶解度和质量的影响。 在含有不同膜组成的30μM纳米盘存在下合成的Tβ₁AR-GFP的产量和活性。总合成蛋白（ A ）和配体结合活性受体 （B） 的分数以μM为单位。 通过GFP融合的荧光测量确定总浓度。通过放射性标记配体[^3H]-二氢阿泼洛尔的过滤器结合测定来测量活性。误差线表示独立一式三份的标准偏差。数据取自先前发表的手稿¹⁴. 请点击此处查看此图的大图。

图4:随着纳米盘浓度的增加，CF合成MP的增溶筛选。 MPs是在提供的纳米盘存在下合成的，范围为3.75-60μM。 （A ）Tβ₁AR-GFP与纳米盘（DMPC）在CF反应中的表达。通过GFP融合的荧光测量确定总浓度。数据取自先前发表的手稿¹⁴.通过SDS-PAGE分析亲和标签纯化样品，Coomassie-Blue染色显示两个突出的条带对应于约50 kDa处的Tβ₁AR-GFP和MSP1E3D1在25 kDa（B）以上与纳米盘（DOPG ） 的PR在CF反应中的表达。通过530nm处的吸收测量测定PR的总浓度。数据取自先前发表的手稿^10，18。照片显示了由于存在折叠 PR 而导致的最终反应的红色。象形图说明了在纳米盘浓度增加后向较低寡聚构象的调制PR组装，如随后的天然质谱¹⁸所示。通过SDS-PAGE分析亲和标签纯化样品，Coomassie-Blue染色显示两个明显的条带对应于PR，在大约20 kDa和MSP1E3D1高于25 kDa。 请点击此处查看此图的大图。

表1:CF反应的关键筛选成分。

表 2:3 mL 体外组装装置的脂质与 MSP1E3D1 比率。

表3:CF储备溶液的制备。

表 4:使用 3 mL RM 和 60 mL FM 进行 CECF 反应的移液方案

表 5:含有 100 μL RM 和 1.7 mL FM 的 Mg²⁺ 浓度筛选的移液方案。

描述了优化CF表达和功能性MPs共翻译插入纳米盘的设置和策略。所需设备包括生物反应器、法式压榨装置或类似设备、紫外可见分光光度计和荧光读数器、适用于两室配置设置的 CF 反应容器以及温控培养箱。其他标准设备是用于收获大肠杆菌细胞的离心机以及用于制备S30裂解物的台式离心机，其重量至少为30，000 x g。如果要制备S80-S100裂解物，则需要超速离心机。所列设备定期在生化实验室提供，开始使用CF表达不需要更大的初始投资。此外，用于CF裂解物和T7RNAP制备的大肠杆菌细胞的发酵和处理是常见且稳健的技术。最昂贵的化合物是CF裂解物，T7RNAap和纳米盘。它们可以通过可靠和有效的方案制备，等分试样在-80°C下可稳定多年。 CF裂解物和T7RNAP制备方案各需要三天，MSP的表达和纯化以及纳米盘的预成型大约需要一周。靶标模板DNA可以使用pET-21、pIVEX或类似的载体系统提供。对于CF表达系统的设置和优化，GFP变体（如移位GFP（GFP+）或超级文件夹GFP的生产可用作监视器^20，32。对于MP生产条件，PR的表达是一个很好的模型系统或阳性对照，因为它在许多不同的条件下折叠，可以很容易地通过530nm^10，15，18处的吸光度进行监测。为了为新MP建立有效的CF表达方案，建议对目标阅读框进行密码子优化，并使用与C端连接的GFP融合^25，26。其他所需材料包括所有市售的化学品和酶。这些组分需要高质量地获得，并且使用3 mL RM和60 mL FM进行所述CF反应的总成本计算约为150-200欧元。因此，CF表达系统的主要应用是产生难以在经典细胞表达系统（如许多MP或毒素）中获得的蛋白质。此外，CF系统是合成生物学的核心平台，不断增长的应用领域使它们作为分子研究的工具越来越不可或缺。常规应用包括蛋白质标记、高通量工艺或合成细胞设计。

所展示的策略能够无洗涤剂生产已经插入到高溶性纳米盘的所需脂质环境中的纯MPs。一旦建立并优化了MP的CF表达方案，生产速度非常快，即使在制备级的范围内，也可以在不到24小时的时间内获得纯样品。MP/纳米盘复合物通过附着在MP上的链霉亲和素II或聚组氨酸标签直接从CF反应中纯化。该过程允许通过一系列不同的技术对相同的MP样品进行并行的功能和结构分析³³。因此，该策略的快速性和效率与采用基于细胞的表达系统和从细胞膜中提取MPs的去垢剂，然后进行常规体外重建的传统方法相比具有竞争力5^，34。CF反应的开放性进一步促进了MP折叠和膜插入15，16，^18，MP复合物组装^15，18，24或功能调节²³的许多独特机理研究。

CF表达与基于细胞的表达的一个重要区别是合成的蛋白质产物缺乏质量控制系统。任何独立于其功能折叠的翻译多肽最终都会出现在最终产品样品中。此外，插入纳米盘膜的过程是人工的和易位子独立的，可能导致不完全整合或可能根本不适用于许多MP靶标。因此，CF反应中最终溶解的产物部分可能是非常不均匀的，包含完全插入但仅部分整合或膜相关的MPs。因此，只有一小部分纯化的MP/纳米盘复合物样品可能在功能上折叠。通过调节纳米盘和DNA模板的浓度来修改膜组成并仔细微调MP与纳米盘的比例是合适的优化工具。然而，下游质量控制方法（如尺寸排阻分析和靶标特异性定量功能测定）对于优化CF表达方案始终是必要的。因此，这种检测的可用性可能会限制应用，特别是在包括需要脂质体环境以实现功能（如转运体、通道或泵）的MP的项目中。此外，纳米盘的尺寸限制可能会限制大型MP组件的插入。

在记录的示例中，GPCR Tβ₁AR-GFP的功能折叠部分的变化在几个百分点的范围内，高达约30%。功能折叠需要仔细调整许多参数¹⁴，并且对于其他GPCR22，可能需要类似的单独和繁琐的优化过程。然而，功能折叠GPCR最终实现的产量与其他生产系统相比具有竞争力，并允许在分析规模的Mini-CECF反应器中从单个60 μL反应器中设置>1，000次放射性测定，用于配体结合研究。值得一提的是，GPCR-GFP融合构建体的配体结合研究不需要任何纯化步骤。如有必要，可以通过利用附着在合成MP上的亲和标签（例如His标签或链球菌标签II）来实现纯化。然后将RM在所需缓冲液中稀释，并上样到相应的亲和色谱柱上，该色谱柱已相应地进行预平衡。通过核磁共振波谱或结晶对PR和其他CF合成MP进行结构评估，已经有助于将CF表达系统确立为MP研究的核心平台。所描述的MP/纳米盘配合物生产策略对于未来的电子显微镜结构研究可能变得特别有趣。

作者没有什么可透露的。

我们要感谢德国研究协会（DFG）资助BE1911/8-1、LOEWE罗意威项目GLUE和跨膜运输与通信合作研究中心（SFB807）的财政支持。