Биофункционализация магнитных наноматериалов

В данной работе представлен протокол биофункционализации магнитных наноматериалов с антителами для специфического клеточного таргетирования. Например, мы используем железные нанопроволоки для нацеливания на раковые клетки.

Магнитные наноматериалы привлекли большое внимание в различных биомедицинских приложениях. Биофункционализация этих наноматериалов специфическими агентами-мишенями является важнейшим аспектом для повышения их эффективности в диагностике и лечении при минимизации побочных эффектов. Преимущество магнитных наноматериалов по сравнению с немагнитными заключается в их способности реагировать на магнитные поля бесконтактно и на больших расстояниях. Это позволяет направлять или накапливать их, а также контролировать. Недавно были разработаны магнитные нанопроволоки (СЗ) с уникальными свойствами для биомедицинских применений. Большой магнитный момент этих СЗ позволяет более эффективно дистанционно управлять их движением с помощью магнитного поля. Это с большим успехом используется в лечении рака, доставке лекарств, отслеживании клеток, дифференцировке стволовых клеток или магнитно-резонансной томографии. Кроме того, изготовление СЗ методом электрохимического осаждения с помощью шаблона обеспечивает универсальный метод с жестким контролем над свойствами СЗ. В частности, СЗ железа и СЗ оксида железа (ядро-оболочка) подходят для биомедицинских применений из-за их высокой намагниченности и низкой токсичности.

В данной работе мы предлагаем метод биофункционализации железа/оксида железа с помощью специфических антител, направленных против специфического маркера клеточной поверхности, который сверхэкспрессируется в большом количестве раковых клеток. Поскольку метод использует свойства поверхности оксида железа, он также применим к суперпарамагнитным наночастицам оксида железа. NW сначала покрывают 3-аминопропилтриэтоксисиланом (APTES), действующим как линкер, к которому ковалентно присоединяются антитела. Покрытие APTES и биофункционализация антител доказаны с помощью спектроскопии потерь энергии электронов (EELS) и измерений дзета-потенциала. Кроме того, антигенность антител на СЗ проверяют с помощью иммунопреципитации и вестерн-блоттинга. Специфическое нацеливание биофункционализированных СЗ и их биосовместимость изучаются с помощью конфокальной микроскопии и анализа жизнеспособности клеток.

Уникальным свойством магнитных наноматериалов является их способность реагировать на магнитные поля¹, что может быть полезно для их приведения в действие различными способами, а также их можно контролировать, например, с помощью магнитно-резонансной томографии (МРТ). При воздействии переменного магнитного поля на высокой частоте они могут выделять тепло, которое может вызывать гипертермию, обеспечивая терапевтический вариант¹. Другим подходом является фототермическая обработка, которая может быть реализована с помощью лазера ближнего инфракрасного диапазона (NIR) ^2,3.

Среди большого количества магнитных наноматериалов оксид железа привлек наибольшее внимание в биологических приложениях, таких как магнитная сепарация, гипертермия^2,4, клеточное руководство⁵, доставка лекарств 6,7,8 и в качестве контрастного вещества в МРТ ^9,10. Это связано с их высокой биосовместимостью 11,12, большой намагниченностью 11,12, способностью к покрытию 9,13,14,15, способностью переносить лекарственные препараты 2,16, способностью функционализироваться с лекарственными препаратами^2,16 и/или таргетными агентами ^12,13,17,18 и способность преобразовывать оптическую энергию в тепло². Недавно компания MagForce начала клинические испытания на онкологических больных с использованием наночастиц оксида железа для лечения гипертермии¹⁹.

В последнее время магнитные нанопроволоки (СЗ) все чаще используются в биомедицинских приложениях 3,11,16,20,21,22. Они обладают теми же свойствами, что и магнитные наношарики, но имеют анизотропную форму и очень большой магнитный момент, что позволяет очень эффективно дистанционно управлять магнитным полем^23,24, включая низкочастотное срабатывание для индуцирования магнитомеханических эффектов 25,26,27,28,29. Как следствие, СЗ были внедрены для различных биологических применений, таких как выделение экзосом³⁰, отслеживание клеток 21, лечение рака 3,11,16, доставка лекарств 16,31,32 и в качестве контрастного агента для МРТ ³³.

Биофункционализированные магнитные наноматериалы со специфической способностью к нацеливанию клеток имеют большой потенциал для применения в биомедицине и в прецизионной медицине^34,35. Для присоединения этих таргетных агентов требуется модификация поверхности наноматериалов. Как правило, они нуждаются в покрытии, обеспечивающем функциональную группу, что облегчает прикрепление обрабатывающих средств. В литературе существует большое количество органических и неорганических покрытий для магнитных наноматериалов. В зависимости от функциональной группы, которая может быть иммобилизована наноматериалом, эти покрытия можно разделить на четыре основные группы: молекулы на основе групп карбоновых кислот, полимеры, гистидин и молекулы на основе силановых групп.

Молекулы на основе групп карбоновых кислот являются одним из методов модификации поверхности. Он использует высокое сродство
между отрицательной группой карбоновых кислот на покрытии и положительным зарядом на магнитных наноматериалах^36,37,38. Процесс связывания карбоновой кислоты с поверхностью металла может включать образование солей карбоксилатов металла или адгезию карбоксильной группы к металлу. Тем не менее, для многосегментных СЗ, таких как СЗ железо/золото или никель/золото, которые обладают превосходными свойствами для биоприменения^39,40, этот тип покрытия не может быть легко нанесен. Для этого требуются одновременно два разных покрытия: тиоловые группы для модификации золотых сегментов и карбоксильные группы для магнитных сегментов (железо или никель)³⁸. Примерами молекул на основе карбоксильных групп являются гематопорфирин, пимеловая кислота, пальмитиновая кислота и 3-[(2-аминоэтил)дитио] пропионовая кислота (AEDP)³⁸. Модификации поверхности магнитных наноматериалов с использованием полимеров имеют ряд явных преимуществ. Благодаря большой молекулярной массе полимеров повышает стабильность магнитного наноматериала в растворе³⁸. Однако это значительно увеличит размер наноматериала³⁸. Поливинилпирролидон (PVP), полиэтиленимин (PEI), аспарагиновая кислота аргинин-глицин-D (RGD) и полиэтиленгликоль (ПЭГ) являются некоторыми примерами наиболее часто используемых полимеров для модификации поверхности. Каждый из них имеет свои особенности и использует³⁸. Третий способ модификации поверхности заключается в использовании гистидинового покрытия. Гистидин представляет собой белок с боковой цепью аминокислоты гистидина, который имеет высокое сродство к ограниченному числу магнитных наноматериалов, таких как^{никель 38}. Он может быть использован для процессов очистки белка 38,41,42. Гистидиновое покрытие также может быть нанесено на многосегментные NWs, такие как никель/золото NWs³⁸. Силанизировка поверхности наноматериала является хорошо зарекомендовавшим себя процессом 38,43,44. В его основе лежит атом кремния, связанный с любой поверхностью оксида металла тремя одиночными связями, и в то же время этот атом кремния связывается с функциональной группой на конце через алкильную цепь ^38,43,44. Преимуществом данного покрытия является наличие свободных аминных групп, и оно обладает способностью покрывать как магнитные, так и немагнитные материалы^38,45, такие как никель и золото соответственно. Таким образом, использование молекул на основе солевой группы является практическим путем для биофункционализации многосегментных СЗ. Примерами молекул на основе силановых групп являются (3-аминопропил) триэтоксисилан (APTES) и (3-аминопропил) триметоксисилан (APTMS)^38,45.

Добавление в покрытие таргетного агента может играть значительную роль как в диагностике, так и в лечении больных клеток, и, в то же время, свести к минимуму побочные эффекты на здоровые ткани^46,47. Добавление таргетного агента на поверхность наноматериалов усиливает как клеточное селективное связывание, так и интернализацию через рецепторы эндоцитоза⁷. Без этих целевых лигандов наноматериалы неспецифически взаимодействуют с клеточными мембранами, которые связываются с меньшей скоростью по сравнению с наноматериалами с лигандами⁴⁸. Одной из проблем воздействия на раковые ткани является их характерное сходство со здоровыми тканями. Таким образом, успех таргетирования зависит, главным образом, от определения подходящего лиганда для использования в качестве биологической мишени^49,50. Различные агенты-мишени были использованы для направления наноматериалов к раковым клеткам^48,51 (например, CD44, из-за его высокой экспрессии в раковых клетках по сравнению со здоровыми клетками^52,53,54,55).

Таргетные агенты можно разделить на три основные группы в зависимости от компонентов, из которых они состоят, и их сложности: таргетирование на основе аптамеров, таргетирование на основе лигандов и таргетирование на основе антител. Аптамеры представляют собой короткие химически синтезированные нити ДНК или РНК-олигонуклеотидов, которые свернуты в двух- и трехмерные структуры, что делает их способными нацеливаться на специфический антиген, чаще всего на белки⁵⁶. Таргетирование на основе лигандов включает пептиды и короткие аминокислотные цепи⁵⁷. Таргетирование на основе антител предполагает использование целого антитела или фрагментов антител, таких как одноцепочечные вариабельные фрагменты или антигенсвязывающие фрагменты⁵¹. Использование этого метода имеет преимущество в том, что он обладает двумя сайтами связывания с высоким сродством связывания с его специфическим антигеном-мишенью, что придает ему чрезвычайно высокую селективность⁵⁸. Сайты связывания аналогичны замку, а антиген — ключу⁵⁸.

В этой работе использованные СЗ были изготовлены методом электроосаждения на мембраны из оксида алюминия, метод, подробно описанный в предыдущей публикации⁵⁹. Основное внимание здесь уделяется высвобождению этих железо-оксидных (ядро-оболочка) СЗ из мембран и биофункционализации их специфическими антителами для обеспечения способности к нацеливанию. Антитела не могут связываться непосредственно с СЗ оксида железа и требуют линкера. Покрытие СЗ APTES обеспечивает свободные аминные группы, что позволяет прикреплять коваленты через карбоксильную группу к антителам (рис. 1). Преимуществом покрытия APTES является его способность работать как с магнитными^{материалами 21} , так и с немагнитными^{материалами 60} , такими как железо/золото или никель/золото NWs⁴⁵. Все этапы покрытия и биофункционализации, описанные в этом протоколе, могут быть использованы с любым наноматериалом железа/оксида железа в целом. В качестве примера здесь использовались СЗ железа/оксида железа. Результаты показывают, что СЗ, функционализированные антителами, обладают высокой антигенностью к специфическим рецепторам клеточной поверхности, что может быть использовано для различных применений. В качестве примера можно привести разделение клеток, доставку лекарств, специфическое лечение раковых клеток с помощью фототермической и/или магнитомеханической обработки.

ВНИМАНИЕ: Перед использованием всегда сверяйтесь со всеми соответствующими паспортами безопасности материалов (MSDS). Используйте все надлежащие меры безопасности и средства индивидуальной защиты (защитные очки, перчатки, лабораторный халат, брюки полной длины, обувь с закрытым носком). Выполняйте все биологические реакции в биологическом вытяжном шкафу.

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол предназначен для получения 2 x 10 10 биофункционализированных NWs/мл, эквивалентных 0,36 мг железа/мл, покрытых антителами к CD44 с плотностью 3 x^{10 4} антител/NW. СЗ оксид железа (ядро-оболочка) имеют длину 2,5 мкм и диаметр 41,5 нм.

1. Высвобождение железных нанопроволок

ПРИМЕЧАНИЕ: Процесс изготовления железа/оксида железа был подробно описан в предыдущей публикации⁵⁹.

1. На коврике для резки разрежьте алюминиевые (алюминиевые) диски (Рисунок 2A) на мелкие кусочки (Рисунок 2B) с помощью лезвия с одной кромкой и небольшого молотка, чтобы они поместились в тюбик объемом 2 мл. Используйте пинцет, чтобы переложить маленькие кусочки алюминия на тюбик.
2. Наполните пробирку объемом 2 мл, содержащую маленькие кусочки алюминия, 1 мл 1 М гидроксида натрия (NaOH). Убедитесь, что все кусочки алюминия покрыты NaOH.
3. Оставьте раствор на 30 минут при комнатной температуре внутри химического вытяжного шкафа.
4. С помощью пинцета удалите только кусочки алюминия и оставьте высвободившиеся СЗ (черные кластеры, рис. 3A) в растворе NaOH еще 30 минут. Не меняйте раствор NaOH.
5. Соберите СЗ, поместив пробирку объемом 2 мл в магнитный штатив и подождите 2 минуты, прежде чем удалять старый раствор NaOH 1 М. Замените его свежим раствором NaOH.
6. Пробирку объемом 2 мл, содержащую СЗ, обработать ультразвуком в течение 30 с и оставить на 1 ч в химическом вытяжном шкафу.
7. Повторите шаги 1,5-1,6 не менее четырех раз.
8. Вымойте NW, поместив пробирку объемом 2 мл в магнитную стойку и подождите 2 минуты.
9. Выбросьте раствор NaOH и замените его 1 мл абсолютного этанола.
10. Ультразвуковая обработка трубки в течение 30 с.
11. Поместите пробирку объемом 2 мл в магнитную стойку и подождите 2 минуты.
12. Выбросьте старый раствор абсолютного этанола и замените его 1 мл свежего абсолютного этанола и обрабатывайте ультразвуком в течение 30 секунд.
13. Повторите шаги 1.11 и 1.12 не менее четырех раз.
14. Храните NW в 1 мл абсолютного этанола при комнатной температуре до тех пор, пока они не понадобятся.
15. Измерьте концентрацию железа и, следовательно, СЗ с помощью масс-спектрометрии с индуктивно связанной плазмой (ИСП-МС).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол можно приостановить здесь. Однако для длительного хранения не освобождайте NW из шаблона Al до тех пор, пока это не понадобится. Хранение высвобожденных СЗ, осаждаемых в этаноле, в течение длительного времени без частого ультразвукового воздействия приведет к созданию агрегаций, для разделения которых потребуется более длительное время ультразвуковой обработки.

2. Покрытие нанопроволок APTES

ПРИМЕЧАНИЕ: В этом протоколе 100 мкл раствора APTES (плотность 0,946 г/мл⁶¹) достаточно для покрытия 1,6 x 10^{7 м2}/г NWs. Если происходит изменение соотношения или массы наноматериала, объем APTES должен быть соответствующим образом скорректирован.

1. Переложите NWs с шага 1,14 в стеклянную пробирку объемом 5 мл с помощью пипетки объемом 1 мл.
2. Чтобы собрать все оставшиеся в пробирке объемом 2 мл, промойте пустую пробирку объемом 2 мл дважды, добавив 1 мл абсолютного этанола, и перенесите его в стеклянную пробирку объемом 5 мл с помощью пипетки объемом 1 мл.
3. С помощью пипетки возьмите 100 мкл APTES и добавьте его непосредственно в раствор NW.
4. Встряхните стеклянную пробирку объемом 5 мл в течение 10 с.
5. Отрегулируйте стеклянную пробирку объемом 5 мл на зажиме лабораторной ретортной стойки.
6. Поместите половину стеклянной пробирки объемом 5 мл в воду ультразвуковой ванны и выполняйте ультразвуковую терапию в течение 1 часа.
7. Выньте стеклянную пробирку объемом 5 мл из ультразвуковой ванны и добавьте 400 мкл деионизированной (DI) воды, а затем 20 мкл 1 M NaOH (основного катализа).
   ВНИМАНИЕ: Важно сначала добавить деионизированную воду.
8. Отрегулируйте стеклянную пробирку объемом 5 мл, как описано в шагах 2.5–2.6, и выполняйте ультразвуковую терапию в течение еще 1 часа.
9. Выньте стеклянную пробирку объемом 5 мл из ультразвуковой ванны.
10. Поместите магнит рядом со стеклянной трубкой на 5 минут, чтобы собрать NWs.
11. Замените надосадочную жидкость 1 мл свежего абсолютного этанола и обрабатывайте ультразвуком в течение 10 с.
12. Повторите шаги 2.10-2.11 четыре раза.
13. Перелейте все взвешенные этанолы в новую стеклянную пробирку объемом 5 мл с помощью пипетки объемом 1 мл.
    ПРИМЕЧАНИЕ: NW с покрытием APTES можно хранить в стеклянной пробирке с этанолом до тех пор, пока они не понадобятся. Здесь протокол можно приостановить.

3. Биофункционализация нанопроволок

1. Активация антител
   ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения примерно 3 x 10⁴ частей антитела/СЗ используйте 30 мкл антител (1 мг/мл) на 0,1 мг железа.
   1. В пробирке объемом 2 мл растворяют 0,4 мг 3-3-диметиламинопропилкарбодиимида (EDC) и 1,1 мг сульфо-N-гидроксисульфосукцинимида (Sulfo-NHS) в 1 мл гидрата 2-N-морфолиноэтансульфоновой кислоты (MES) (рН 4,7).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смесь EDC / sulfo-NHS должна быть свежей и подготовленной перед использованием.
   2. В новую пробирку объемом 2 мл добавьте 30 мкл антител к CD44 (1 мг/мл), 960 мкл 0,1 М фосфатно-солевого буфера (PBS, pH 7) и 10 мкл смеси EDC/sulfo-NHS (приготовленной на этапе 3.1.1) соответственно.
   3. Поместите пробирку объемом 2 мл в шейкер при концентрации 10 x G на 15 минут при комнатной температуре.
2. Подготовка нанопроволок с покрытием APTES
   1. В течение 15-минутной инкубации на этапе 3.1.3 промойте СЗ, поместив магнит рядом с пробиркой СЗ с покрытием APTES (из шага 2.13) на 2 мин для сбора СЗ.
   2. Выбросьте этанол и замените его 1 мл 0,1 М PBS (pH 7), а затем обрабатывайте ультразвуком в течение 10 с.
   3. Повторите шаги 3.2.1-3.2.2 четыре раза.
   4. Соберите NW, как описано в шаге 3.2.1, и выбросьте 0,1 M PBS. Держите NWs в пробирке без раствора.
3. Прикрепление антител
   1. Весь активированный раствор антител (приготовленный на этапе 3.1.3) переносят в пробирку NWs (приготовленную в 3.2.4) и проводят ультразвуковую терапию в течение 10 с.
   2. Поместите стеклянную трубку во вращатель на ночь при температуре 4 °C.
   3. Соберите NW с помощью магнита, как показано на шаге 3.2.1, и выбросьте надосадочную жидкость.
   4. Добавление 1 мл 2% раствора бычьего сывороточного альбумина (БСА) в течение 1 ч при 4 °C для блокирования реакции.
   5. Проверяют антигенность функционализированных СЗ антител, например, с помощью иммунопреципитации (ВП) и вестерн-блоттинга (ВБ).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения лучших результатов используйте биофункционализированные СЗ в анализе IP, WB или биосовместимости сразу после этапа блокировки.

4. Анализ на биосовместимость

ПРИМЕЧАНИЕ: Для изучения биосовместимости СЗ могут быть использованы различные анализы жизнеспособности клеток и различные клеточные линии. Концентрация СЗ, используемая здесь, основана на предыдущей публикации¹⁶. Посев клеток следует проводить за сутки до биофункционализации СЗ.

ВНИМАНИЕ: Все перечисленные ниже шаги следует выполнять под шкафом биобезопасности.

1. В 96-луночном планшете засейте девять лунок 4 x 10⁴ клеток рака толстой кишки (клеточная линия HCT116), взвешенными в питательной среде Маккоя (100 мкл/лунка), и поместите ее в инкубатор на ночь при температуре 37 °C и 5% углекислого газа (CO₂).
2. Промойте СЗ (из шага 3.3.4) PBS, собрав их с помощью магнита, как в шаге 3.2.1, и замените старый раствор 1 мл 0,01 M PBS (pH 7). Повторите этот шаг три раза.
3. Промойте СЗ (из шага 4.2) нагретой средой Маккоя, собрав их с помощью магнита, как в шаге 3.2.1, и замените старый ПБС 1 мл нагретой среды Маккоя. Повторите этот шаг три раза.
4. Собираем СЗ (из шага 4.3) с помощью магнита, как показано на шаге 3.2.1, и заменяем 1 мл нагретой среды Маккоя на 900 мкл нагретой среды Маккоя. Концентрация СЗ должна составлять 0,02 мг СЗ на мл.
5. Перенесите пластину на 96 лунок (из шага 4.1) из инкубатора в шкаф биобезопасности.
6. Под шкафом биобезопасности выбросьте старую среду из клеток и замените ее 100 мкл взвешенных СЗ (приготовленных на шаге 4.4).
7. Встряхните планшет (подготовленный на шаге 4.6) вручную, а затем инкубируйте его в течение 24 ч в инкубаторе при 37 °C и 5% CO₂.
8. На следующий день выньте из инкубатора 96-луночную пластину (подготовленную на шаге 4.7). Под шкафом биобезопасности добавьте 11 мкл реагента для определения жизнеспособности клеток (таблица материалов) в каждую лунку с помощью многостенной пипетки.
9. Встряхните тарелку с помощью шейкера со скоростью 10 x g в течение 10 с.
10. Инкубируйте пластину в течение 1 ч в инкубаторе.
11. Выньте из инкубатора 96-луночную пластину (подготовленную на шаге 4.10). Считывание пластины в микропланшетном ридере (Таблица материалов) путем измерения абсорбции реагента жизнеспособности клеток (возбуждение 540 нм, излучение 590 нм).

Важно разрезать алюминиевые (Al) диски (Рисунок 2A) на небольшие кусочки (Рисунок 2B), чтобы они поместились в используемую трубку. После добавления 1 М NaOH к кусочкам Al немедленно должна начаться реакция, которая наблюдается по образованию пузырьков. Если реакция не возникает в течение 1 мин или если реакция протекает очень быстро и раствор становится полностью мутным с белым облаком, немедленно удалите старый раствор NaOH и замените его свежим раствором. Проверьте значение рН раствора NaOH. Он должен быть рН>12. Когда NW высвобождаются из кусочков Al в течение первых 30 минут с NaOH, NWs (черные кластеры, рис. 3A) будут плавать в растворе NaOH. На последнем этапе высвобождения СЗ раствор должен быть однородным. Кластер СЗ не должен быть (рис. 3B). Если NWs собирали с помощью магнита в течение 3 мин, раствор должен быть прозрачным, а гранула NW должна быть черной (рис. 3C). Если гранула была серой, выбросьте пробирку и начните снова с новой пробой Al.

В процессе высвобождения СЗ получают нативный слой оксида железа толщиной около 5 нм, что аналогично предыдущим отчетам^11,16,20. Этот оксидный слой вносит важный вклад в биосовместимость 16, функционализацию ^16,18 и магнитные свойства²⁰ СЗ. Тем не менее, если держать СЗ в их шаблоне (т.е. не выпускать их) до тех пор, пока это не понадобится, это предотвратит их воздействие на окружающую среду. Средний диаметр и длина СЗ после процесса высвобождения составили 2,5 мкм и 41,5 нм соответственно. Масса одного СЗ может быть рассчитана, как описано в таблице 1, и подтверждена с помощью масс-спектроскопии с индуктивно-связанной плазмой (ИСП-МС). Здесь каждый глиноземный диск содержал около 0,3 мг железа.

Чтобы уменьшить агрегацию NW после выпуска и обеспечить дальнейшую функционализацию, NW были покрыты APTES. Это покрытие обеспечивает свободные аминные группы и обладает способностью покрывать как магнитные, так и немагнитные материалы^39,45, что делает его пригодным для покрытия многосегментных NW^, таких как железо/золото NW. При нанесении покрытия нанопроволоками важно сосредоточиться на двух вещах. Во-первых, рассчитайте необходимый объем из молекул APTES⁶² на основе площади поверхности и массы СЗ. Эти расчеты представлены в таблице 2. Во-вторых, удерживать нанопроволоки в непрерывном движении, чтобы предотвратить их агломерацию и блокировку некоторых участков поверхностей СЗ от покрытия APTES. Например, в этом протоколе нанопроволоки инкубировались в ультразвуковой ванне и ротаторе во время покрытия APTES и функционализации антител соответственно. Каждая молекула APTES содержит атом кремния и концевую функциональную аминную аминную группу²¹. Таким образом, карты спектроскопии потерь энергии электронов (EELS) могут быть использованы для подтверждения наличия покрытия APTES путем отображения атомов кремния (розового цвета) на поверхности СЗ (рис. 4A). Напротив, на непокрытых NW атомы железа окрашены в синий цвет коры (Рисунок 4B), а атомы смеси железа и кислорода — в светло-голубой цвет (Рисунок 4B). Соответствующее картирование EELS непокрытых СЗ (рис. 4 C, 4D) показывает более высокую интенсивность железа по отношению к кислороду в центре (рис. 4C), чем на поверхности (рис. 4D), что указывает на структуру железо-оксид железа (ядро-оболочка). Картирование EELS (рис. 4 C, 4D) показало, что слой оксида железа на СЗ содержит Fe 3 O₄ больше, чем Fe₂O₃, что аналогично предыдущей публикации²⁰.

Антигенность прикрепленных антител может быть подтверждена с помощью анализов IP и WB, где полоса может наблюдаться на положительном образце, но не на отрицательном контроле (рис. 5). Обратите внимание, что для наблюдения четкой полосы не используйте менее 0,1 мг NWs/10 x^{10 6} клеток. Анализ BCA (Таблица материалов) в сочетании с некоторыми расчетами, представленными в таблице 3 , был использован для количественного определения количества антител на СЗ.

Кроме того, измерение дзета-потенциала было использовано для выяснения функционализации поверхности. Концевая аминная группа на APTES снижала отрицательный заряд непокрытых СЗ, как показано на рисунке 6. Функционализированные антителами СЗ также изменяли заряд по сравнению с СЗ, покрытыми APTES (рис. 6). Все измерения дзета-потенциала проводились при рН 7.

Специфическое клеточное нацеливание на СЗ, функционализированные антителами, может быть подтверждено с помощью конфокальной микроскопии (рис. 7). Биосовместимость любого нового наноматериала должна быть проверена перед началом любого применения. Поэтому был использован анализ жизнеспособности клеток, который подтвердил, что непокрытые, покрытые APTES и покрытые антителами NW были биосовместимы даже при высокой концентрации (рис. 8).

Рисунок 1: На схеме представлен метод покрытия и биофункционализации нанопроволок. (A) Покрытие СЗ железа APTES. (B) Активация антител с помощью EDC + Sulfo-NHS, чтобы иметь на конце (C) функционализированную нанопроволоку антитела. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 2: Алюминиевый диск, наплавленный железом. (A) Алюминиевый диск перед резкой. (B) Красными линиями было показано, где нужно разрезать диск. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 3: Этапы выпуска нанопроволоки. (А) Кластеры нанопроволок плавают в растворе NaOH. Снимок был сделан через 10 минут после добавления NaOH и удаления алюминиевой мембраны. (B) Нанопроволоки, взвешенные в этаноле. Фотография была сделана на последнем этапе выпуска, сразу после этапа ультразвуковой обработки. (C) Черная нанопроволочная гранула, собранная магнитом. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 4: Карта спектроскопии потерь энергии электронов (EELS). (A) Нанопроволока с покрытием APTES (APTES-NW). Синий и розовый цвета обозначают атомы железа и кремния соответственно. (B) Нанопроволока без покрытия (NW). Голубой и светло-голубой цвета коры представляют собой сопоставление железа и смеси железа и кислорода соответственно. Соответствующее отображение EELS (C) сердцевины и (D) оболочки NW без покрытия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 5: Подтверждение функционализации и активности конъюгированных нанопроволок антител. Антигенность CD44-NWs подтверждали с помощью иммунопреципитации (ИП) и вестерн-блоттинга (ВБ). +Ve: представляет положительный контроль (лизат полных клеток). -Ve: представляет отрицательный элемент управления (только NW без покрытия). – клетки CD44: представляют собой клетки, которые не экспрессируют антиген CD44; + CD44 клетки: представляют клетки рака толстой кишки, экспрессирующие антиген CD44. Это репрезентативный блот n = 3 независимых экспериментов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 6: Значения потенциала Дзетов для СЗ, АПТЕС-ЯО и антител. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартной ошибки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 7: Конфокальные микроскопические изображения показывают специфическое наведение. Показано, что CD44-NW прикрепляются (A и C), в то время как Isotype-NWs (отрицательный контроль) не прикрепляются (B и D). Красный, синий и зеленый цвета обозначают клеточную мембрану, ядро и кластер CD44-NW соответственно. A и B являются яркими полевыми изображениями C и D соответственно. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Рисунок 8: Исследование жизнеспособности клеток рака толстой кишки (HCT116), инкубированных с различными составами нанопроволок. Клетки обрабатывали СЗ после 24 часов инкубации, а затем инкубировали в течение 24 часов с СЗ. Все эксперименты проводились в инкубаторе при температуре 37 °C. Столбцы представляют собой среднее значение ± стандартной ошибки. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы увидеть увеличенную версию этого рисунка.

Таблица 1: Расчет массы железа СЗ.

Таблица 2: Расчет количества молекул APTES, необходимых для покрытия СЗ.

Таблица 3: Расчет количества антител на нанопроволоке.

Как и при любом методе изготовления наноматериалов и нанесения покрытий, требуется высокое качество используемых решений. Решения для высвобождения (1 млн NaOH) и функционализации (MES) могут быть повторно использованы несколько раз. Тем не менее, проверка их значения рН перед началом нового процесса очень важна. На этапе высвобождения промывку СЗ NaOH следует проводить не менее четырех раз. Чем лучше промывка, тем лучше стабильность СЗ и тем меньше они агрегатируются. Оксидный слой повышает стабильность СЗ при погружении в этанол или воду⁶³.

Диаметр и длина СЗ были изменены после покрытия их APTES и антителами. Здесь диаметр увеличился с 41,5 нм до 70 нм, а длина уменьшилась с 2,5 мкм до 1,6 мкм из-за звуковых ступеней, разрывающих СЗ. Поэтому важно охарактеризовать морфологию СЗ после стадии биофункционализации.

Присоединение антител к СЗ основано на ковалентном взаимодействии между аминной группой (на APTES) и карбоксильной группой (на антителе). Поэтому подтверждение наличия покрытия APTES является важным этапом, для которого мы использовали EELS-картирование. Метод нанесения покрытия безопасен и прост. Ему не нужны высокие температуры или длительные сроки инкубации. Кроме того, покрытие APTES работает как линкер, обеспечивая ковалентное присоединение других антител или белков, имеющих карбоксильную группу.

В случае биофункционализации СЗ антителом может быть нарушена антигенность сайтов связывания антител после процесса биофункционализации. Для исследования этого вопроса можно использовать метод IP и WB. Использование метода биофункционализации, упомянутого в этом протоколе, позволит антителам связываться с СЗ с высокой антигенностью к специфическому клеточному рецептору. Кроме того, биофункционализация СЗ антителами добавила способность нацеливаться на клетки с интересующим рецептором, CD44. Это было подтверждено с помощью конфокальной микроскопии. Несмотря на то, что биосовместимость непокрытых СЗ была высокой (>95%), добавление покрытия APTES или антител к СЗ повысило их биосовместимость на 100%.

Кроме того, протокол покрытия и биофункционализации является эффективным, экономичным и воспроизводимым. Он должен быть применим к любому другому наноматериалу железо-оксид железа, при этом концентрация как покрытия, так и прикрепленных антител должна быть оптимизирована в зависимости от площади поверхности и массы наноматериала. Этот протокол может быть безопасно выполнен в условиях окружающей среды в общей лаборатории. Биофункционализация значительно повысила биосовместимость наноматериалов и их таргетную способность. В целом, СЗ являются чрезвычайно перспективными материалами для наномедицинских применений (включая мультимодальные или комбинаторные методы лечения, обнаружение или наведение клеток, а также биологическое зондирование). В сочетании с биофункционализацией, как описано здесь, можно достичь специфического нацеливания на клетки для повышения точности и эффективности.

Авторам нечего раскрывать.

Исследование, представленное в этой публикации, было поддержано Университетом науки и технологий имени короля Абдаллы (KAUST).