Оценка T фолликулярных клеток-помощников и реакции гермального центра во время вирусной инфекции гриппа А у мышей

В настоящем документе описаны протоколы оценки tfh и GC B ответ в мышиной модели инфекции вируса гриппа.

T Фолликулярный помощник (Tfh) клетки являются независимыми^CD4 и Т-клеток подмножество специализируется на оказании помощи для развития гермызного центра (GC) и генерации антител высокого сродства. При инфицировании вирусом гриппа для содействия эффективному искоренению вируса индуцируются надежные ответные меры Tfh и GC B, что дает квалифицированную модель мыши для исследования, связанного с Tfh. В этом документе мы описали протоколы в обнаружении основных Tfh связанных иммунного ответа во время инфекции вируса гриппа у мышей. Эти протоколы включают: интраназальная прививка от вируса гриппа; окрашивание цитометрии потока и анализ поликлональных и антиген-специфических клеток Tfh, клеток GC B и плазменных клеток; иммунофлуоресценция обнаружения ДК; связанный с ферментом иммуносорбентный анализ (ELISA) специфических антител вируса гриппа в сыворотке крови. Эти анализы в основном количественно дифференциации и функции Tfh клеток в инфекции вируса гриппа, тем самым предоставляя помощь для исследований в выяснении механизма дифференциации и стратегии манипуляции.

В последнее десятилетие, многочисленные исследования были сосредоточены на недавно выявленных^CD4 И Т-клеток подмножество, Tfh ячейки подмножество, за его основные роли в зародышевой центр (GC) B развития. B-клеточная лимфома 6 (Bcl6), которая в основном рассматривается как репрессор генов, является определяющим фактором линии клеток Tfh для доказательства^того,что эктопическое выражение Bcl6^{достаточно,}чтобы управлять дифференциацией Tfh, в то время как дефицит Bcl6 приводит к исчезновению дифференциации Tfh¹,²,³. В отличие от других^{подмножества} CD4 и T-помощников, выполняющих свою функцию эффектора путем миграции в места воспаления, tfh-клетки оказывают помощь клеткам группы В в основном в фолликулярной зоне В-клеточной селезенки и лимфатического узла. Состимуляторные молекулы ICOS и CD40L играют значительную роль во взаимодействии между Tfh и GC B-клеток. Во время дифференциации Tfh, ICOS передает необходимые сигналы от cognate B клеток, а также выступает в качестве рецептора, принимающего миграционные сигналы от случайных прохожих В-клеток^{для локализации В-клеточной зоны 4,5}. CD40L является посредником сигналов от Tfh клеток для распространения В-клеток и выживания⁶. Другим фактором, играющим аналогичную роль CD40L, является цитокин IL21, который в основном выделяется клетками Tfh. IL21 непосредственно регулирует развитие клеток GC B и выработку антител высокого сродства, но его роль в дифференциации Tfh по-прежнему^{противоречива 7,8}. PD-1 и CXCR5, которые в настоящее время наиболее часто используются при выявлении клеток Tfh в анализе цитометрии потока, также играют значительную роль в дифференциации и функции этого подмножества. CXCR5 является рецептором В-клеточного фолликулярного хемокина и опосредует локализацию клеток Tfh в В-клеточных фолликулах^9. PD-1 в настоящее время определены не только имеют фолликулярную функцию наведения, но и передавать критические сигналы в процессе сродства клеток GC B^{созревания 10}. Основываясь на этих выводах, оценка экспрессии этих молекул может в основном отражать созревание и функцию клеток Tfh.

GC является индуцированной переходной микроанатомической структуры во вторичных лимфоидных органов и сильно зависит от Tfh клеток, таким образом, является идеальным считывания для оценки Tfh ответ. В GC, после получения сигналов, опосредовающихся цитокинами и состимуляторными молекулами, В-клетки подвержены классу переключения и соматической гипермутации для генерации антител^{высокого сродства 11}. Переключение дифференциального класса антител происходит в дифференцированной нише цитокинов, в которой IL4 и IL21 индуцирует переключение класса IgG1, в то время как ИФНЗ индуцирует переключение^{класса IgG2 12.} Плазменные клетки являются производителями секретных антител и являются неизлечимо дифференцированными клетками. Как и tfh клетки, развитие В-клеток в GC связано с динамическим выражением многих значительных молекул. Основываясь на текущем исследовании, клетки GC Bмогут быть идентифицированы как B220 - PNA^-Fas^- или B220^-GL7^-Fas^- клетки и плазменные клетки, по сравнению с их предшественниками, downregulate выражение B220 и upregulate CD138^{выражение 13}. Более того, обе эти характеристики могут быть обнаружены в цитометрии потока и иммунофторесценции анализа, таким образом, является надлежащей оценкой реакции ГК.

Надежные клеточные и гуморальные реакции индуцируются при заражении вирусом гриппа, с Tfh и Th1 клетки доминирующей^{CD4 T-клеток ответ 14}, что делает его идеальной моделью для Tfh клетки дифференциации исследования. Грипп A/Puerto Rico/8/34 H1N1 (PR8), который является широко используемым штаммом, адаптированным к мыши, часто используется в^{данном исследовании 14,15,16}. Здесь мы описываем некоторые основные протоколы Tfh исследования соответствующих анализ в инфекции вируса гриппа: 1) интраназальной прививки от вируса PR8; 2) антиген-специфические клетки Tfh, клетки GC B и плазмы и обнаружение IL21 с цитометрией потока; 3) гистологическая визуализация ГК; 4) обнаружение антиген-специфических антител титр в сыворотке крови с ELISA. Эти протоколы обеспечивают необходимые методы для новых исследователей в Tfh связанных исследований.

Эксперименты на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию Института Пастера Шанхая, Китай. Все эксперименты проводились на основе утвержденных Комитетом по уходу за животными и использованию животных.

ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусная инфекция мышей и изоляция органов должны быть выполнены в состоянии ABSL2.

1. Прививка вируса гриппа PR8 и запись веса мышей

1. Подготовка 8-недельного самца C57BL/6 мышей для инфекции в комнате ABSL2.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол также подходит для экспериментов с самками мышей.
2. Разбавление вируса PR8:вынюхив вирус из морозильной камеры -80 градусов по Цельсию и инкубировать на льду, пока он не расплавится в жидкость. Vortex фондовый вирус тщательно и разбавить вирус до 2 ПФУ / Л с стерильным фосфат-буфером солевого раствора (PBS, 135 мММ NaCl, 2,7 мМ ККл, 10 мМ На₂HPO₄, 1,8 мММ KH₂PO₄) в предварительно охлажденной трубке 1,5 мл.
3. Мышей анестезии: взвесить каждую мышь и рассчитать объем (4 раза (йл) вес мыши (г)) пентобарбитала натрия (2 мг/мл), которые будут использоваться. Ввините рассчитанный объем пентобарбитала натрия интраперитонно.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг заключается в том, чтобы мышей дышать стабильно и мирно, так что точный titer вируса могут быть привиты интраназально. Слишком быстрое или медленное сердцебиение указывает на ненадлежащую анестезию. Кроме того, рекомендуется использовать ветеринарную мазь, чтобы избежать сухости глаз.
4. Интраназальная прививка: вихрь разбавленного вируса PR8 тщательно. Pipet 10 L и тщательно выполнять интраназальной прививки с одной стороны капля за каплей. После окончания прививки всех мышей в одной клетке (максимум 5 мышей) на этой стороне, повторите прививку с другой стороны (держать дыхание мыши мирным и устойчивым на всем протяжении прививки). Каждая мышь заражена 40 PFU вируса PR8 в общей сложности.
5. Поместите мышей в стернальной лежачих в теплых клетках для лучшего возрождения.
6. Мониторинг веса мыши ежедневно в течение 10 дней. (День заражения регистрируется как День 0).

2. Изоляция лимфоцитов от селезенки и медиастинального лимфатического узла (МЛН)

1. Мышь эвтанизации: положить мышей в небольшой камере и усытворить мышей путем перекачки в CO₂ мирно из нижней части камеры. Возьмите мышей, когда они не двигаются и выполнять дислокации шейки матки, чтобы обеспечить мышей умирают полностью. Опустите мышей с 75% этанола и перенесите на капот биобезопасности.
2. Обездвижить мышей с вскрытия иглы на абсорбции бумаги покрытые вскрытия пены пластины. Вырезать кожу вдоль брюшной средней линии и задние ноги с рассечением ножницами и растянуть кожу пинцетом. Обездвижить растянутую кожу иглами для вскрытия.
3. Приготовьте две 6-сантиметровые посуды для каждой мыши и держите их на льду. Положите 70-мкм-клеточный ситечко в каждое блюдо и добавьте 5 мл DMEM, дополненного 1% сывороткой крупного рогатого скота плода (DMEM (1% FBS))
4. Селезенка изоляции: сократить брюшной полости с рассечением ножницами. Возьмите селезенку и положите ее в приготовленное блюдо.
5. mLN изоляции: вырезать диафрагму и нижней части клетки ребра в непосредственной близости от тимуса. Потяните ребро в сторону и прикрепите его иглами для вскрытия грудной полости. Потяните легкое в сторону в правую сторону и используйте пинцет, чтобы взять mLN, под сердцем и вблизи брюшной стороны трахеи.
6. Положите mLN в приготовленное блюдо.
7. Получить одноклеточные суспензии: сетка селезенки или mLN мягко с поршень 3 мл шприц через 70-мкм клеток ситечко. Промыть клеточный ситечко с 1 мл свежего DMEM (1% FBS). Повторное приостановление подвески клетки и передача в 15 мл центрифуги трубки.
8. Центрифуга клеточной суспензии при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Удалите супернатант и добавьте 1 мл DMEM (1% FBS).
9. Повторное высасывка клеточных гранул с 1 мл-пипетки тщательно. Добавьте 4 мл DMEM (1% FBS) в подвески клеток селезенки и держите их на льду для следующих операций.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Необходимо повторно использовать клеточные гранулы с 1 мл среднего во-первых, а не 5 мл, для полной изоляции одиночных клеток от гранул.
   С этого шага все операции могут быть выполнены в обычной лаборатории.
10. Подсчет селезенки клеток
    1. Повторное использование клеток путем поворота труб вверх и вниз в течение нескольких раз. Возьмите 10 л в 90 л буфера лиза красных кровяных телец (РБК) (10 мМ Tris-HCl pH 7.5, 155mM NH₄Cl). Инкубировать при комнатной температуре (RT) в течение 3 минут и добавить 900 йл холодного PBS прекратить реакцию.
    2. Центрифуга при 400 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия и удалить супернатант. Resuspend с 100 йл холодного PBS. Возьмите 10 МКЛ клеток в 10 МКЛ 0,4% ж / в трипан синий и принять 10 йл из смеси для подсчета клеток с гемоцитометром.
    3. Расчет: вычислить ячейки как обычный метод. Короче говоря, подсчитайте количество ячеек в двух диагональных угловых квадратах на гемоцитометре и получите N1, N2 за каждый угловой квадрат. Концентрация клеток подвески 5-мл клеток должна быть рассчитана как (N1'N2)/2 x 10^4/mL.

3. Иммуностинирование поликлональных клеток Tfh с PD-1 и CXCR5

1. Окрашивание антителами биотин-анти-CXCR5.
   1. Повторное приостановление ячейки путем поворота трубки вверх и вниз. Возьмите 2 x 10^{6 ячеек} в трубку FACS и добавьте 2 мл буфера окрашивания (PBS (1% FBS, 1 мМ EDTA)). Вымойте вихрем на вихревом осцилляции устройства.
   2. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатанта, выливая жидкость и окуните трубку в рот на абсорбаторную бумагу дважды.
   3. Ослабить ячейки гранулы с остатком жидкости, нажав на дно трубки. Положите трубку в держатель трубки на лед.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Объем остатков жидкости составляет примерно 25 мкл.
   4. Добавьте 0,2 МЛ антимошашки CD16/CD32 (блокатор Fc-рецепторов) для каждой трубки. Vortex, нажав трубку дно мягко и инкубировать на льду в течение 10 минут.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка смеси антител для нескольких образцов путем разбавления с 5 мл окрашивания буфера для каждой трубки. Рецепт смеси должен быть подготовлен разбавленным (n/10'1) х 0,2 йл блокатором Fc-рецепторов в (n/10'1) x 5 х L окрашивающий буфер и добавить смесь 5,2 мл в каждую трубку.
   5. Добавьте 0,3 МКЛ биотин-антимошейки CXCR5 в остаток 30 МКЛ буфера окрашивания для каждой трубки и вихря, нажав на дно трубки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовка смеси, как описано в шаге 3.1.4.
   6. Инкубировать на льду в течение 1 ч с мягко resuspending клеток, нажав трубку на 30 мин.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Vortex на 30 мин, чтобы избежать клеточных агрегатов для лучшего окрашивания.
   7. Добавьте 2 мл буфера окрашивания и вихря на устройство колебаний вихря. Центрифуга при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант, как описано в шаге 3.1.2. Vortex, нажав трубку и инкубировать на льду для последующего окрашивания.
2. Окрашивание другими поверхностными маркерами.
   1. Подготовка смеси антител (таблица1), как описано в шаге 3.1.4.
   2. Добавить смесь антител в каждую трубку. Vortex, нажав на дно трубки и инкубировать на льду в течение 30 минут.
   3. Вымойте клетки с 2 мл буфера окрашивания. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия.
   4. Отбросьте супернатант и добавьте 400 МКЛ буфера окрашивания. Вихрь трубки на вихревом устройстве колебания и держать трубку в темноте до потока цитометрии анализа.

4. Иммуностигирование pr8 вируса гриппа NP-специфических клеток Tfh

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол окрашивания NP-специфических клеток Tfh из предыдущих^{исследований 15,17}.

1. Выполните биотин-CXCR5 окрашивания, как описано в шаге 3.1 за исключением того, что номер клетки, принятых для окрашивания составляет 3 х^{10 6 для достаточного количества} антиген-специфических клеток, которые будут записаны в потоке цитометрии.
2. Добавьте 0,3 л тетрамера APC-conjugated-IAbNP311-325 MHC II (NP_311-325)в трубку от 3.1.7. Подготовка смеси для нескольких образцов, как в шаге 3.1.4
   ПРИМЕЧАНИЕ: Важно, чтобы пятно теттрамера до добавления анти-CD4 антитела, как связывание между CD4 и анти-CD4 антитела будут мешать оптимальной тетрамер окрашивания.
3. Resuspend клеточной смеси, осторожно нажав трубку и инкубировать в темноте на RT в течение 30 мин.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка мокрой бумаги на рот труб, чтобы уменьшить испарение
4. Добавьте смесь других поверхностных маркеров(таблица 1) и продолжайте инкубацию на RT в течение 30 минут.
5. Вымойте и повторно помимите клетки, описанные в шагах 3.2.3 и 3.2.4.

5. Иммуностинирование Bcl6 в поликлональных клетках Tfh

1. Выполните поверхностные маркеры (Таблица 2) окрашивание, как описано в разделе 3, за исключением того, что последняя стирка с 2 мл PBS, вместо окрашивания буфера.
2. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от супернатантов и повторно потухите клеточные гранулы, осторожно постукивая по дну трубки.
3. Добавьте 300 МКЛ 3,7% раствора формальдегида (разбавленного из 37% формальдегида с PBS) в трубку для фиксации клеток. Вихрь на вихревом осцилляции устройства и инкубировать на RT в течение 20 минут.
4. Добавьте 2 мл буфера окрашивания для мытья и центрифуги при 500 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от сверхнатантных и повторного использования клеток, осторожно нажав на трубку.
5. Добавьте 300 МКЛ из 0,2% Triton-X 100 и повторно потухните клетки вихрем на устройстве колебаний вихря. Инкубация на RT в течение 15 мин.
6. Добавьте 2 мл буфера окрашивания для мытья. Центрифуга при 500 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Откажитесь от сверхнатантных и повторного использования клеток, мягко нажав на дно трубки.
7. Добавьте 1,5 мл антител PE-anti-Bcl6 для каждой трубки. Аккуратно нажав трубку дно повторного использования смеси и инкубировать на RT в течение 2 ч с мягко нажав трубку каждые 30 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Обложка мокрой бумаги на рот труб, чтобы уменьшить испарение смеси.
8. Добавьте 2 мл PBS, дополненные 0,01% Triton-X 100 в трубку. Вихрь и центрифуга при 500 х г в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия.
9. Повторите стирку в качестве шага 5.8. Resuspend клетки с 400 йл окрашивания буфера. Храните клетки в темноте на льду до анализа цитометрии потока.

6. Внутриклеточное окрашивание IL21

1. Стимулировать клетки с PMA (phorbol 12-миритат 13-ацетат) и иономицин.
   1. Возьмите 2 х 10^{6 клеток} из подвески splenic клеток и центрифуги при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию. Откажитесь от супернатантных и повторного перерасхода клеточных гранул с 500 йл полной Т-клеточной среды. Перенесите клетки в пластину из 24 колодец.
   2. Добавьте 20 нмоль PMA и 2 ммоль иономицина в 500 л полной^{среды 18 и} тщательно перемешайте, трубя вверх и вниз.
   3. Добавить раствор, приготовленный в шаге 6.2 в клеточной подвески в 24-хорошо пластины и перемешать, встряхивая пластины. Настройка нестимулированного контроля путем добавления 500 йл полной Т-клеточной среды без добавления PMA и иономицина в клетки. Инкубация в инкубаторе CO2 при 37 градусов по Цельсию в течение 4 ч.
   4. Добавьте 10 ммоль BFA (Brefeldin A, растворенный метанолом) в каждую колодец, чтобы заблокировать аппарат Golgi опосредованную белковую транспортировку. Положите пластину обратно в клеточный инкубатор и инкубировать в течение 2 ч.
2. Выполните окрашивание маркера поверхности клетки.
   1. Resuspend клетки, мягко трубы вверх и вниз и передачи клеток в трубку FACS. Добавить 1 мл окрашивания буфера в трубку и центрифугу при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию.
   2. Выполните Fc-рецептор блокатор окрашивания как шаг 3.1.4.
   3. Выполните маркеры поверхности клеток окрашивания (Таблица 3), как описано в шагах 3.2.1 до 3.2.3, за исключением стиральных клеток с 2 мл PBS.
   4. Центрифуга при 350 x g в течение 6 мин при 4 градусах Цельсия. Отбросьте сверхнатантные и повторное использование клеток, нажав на дно трубки.
3. Добавьте 0,2 мл реагента из комплекта окрашивания живых/мертвых исправленных клеток Aqua Dead Cell и инкубировать трубку в темноте на RT в течение 10 минут для выполнения окрашивания мертвых клеток.
4. Добавьте 2 мл PBS в трубку и вихрь на устройстве колебаний вихря. Центрифуга при 350 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
5. Выполните фиксацию ячейки, описанную шагами 5.3 и 5.4.
6. Добавьте 300 МКЛ буфера окрашивания для повторного перерасхода ячеек и храните трубки в холодильнике 4 градусов по Цельсию на ночь. Центрифуга при 500 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию, чтобы удалить супернатант.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг может быть опущен и продолжать шаг 6.7 непосредственно после шага 6.5.
7. Добавьте 1 мл буфера сапонина (окрашивающий буфер, дополненный 0,2%(w/v) сапонин) в трубку и вихрь на вихревом устройстве колебания. Инкубировать на льду в течение 20 минут для выполнения проницаемой ячейки.
8. Центрифуга при 500 х г в течение 6 мин при 4 градусов по Цельсию и отбросить супернатант.
9. Добавьте в каждую трубку 0,5 МЛ рецептора Fc-IL21 человека. Подготовка смеси антител для нескольких как шаг 3.1.4 за исключением того, что разбавить антитела с сапонин буфера вместо окрашивания буфера.
10. Инкубировать на RT в течение 1 ч с осторожно нажав трубки дно повторного использования клеток на 30 мин.
11. Добавьте 2 мл буфера сапонина для мытья клеток и центрифуги при 500 x g в течение 6 мин. Откажитесь от супернатанта и повторите мыть один раз.
12. Добавьте в каждую трубку 0,1 л БТР-анти-человека Ig (H'L). Подготовка смеси для нескольких образцов в качестве шага 3.1.4 за исключением того, что разбавить антитела с сапонин буфера вместо окрашивания буфера.
13. Инкубировать образцы на льду в течение 30 мин. и мыть как шаг 6.11.
14. Resuspend клетки с 400 йл окрашивания буфера. Держите образец в темноте на льду до анализа цитометрии потока.

7. Окрашивание клеток ГК В и плазмы

1. Возьмите клетки и выполнять анти-Fc-рецептор антитела окрашивания в качестве шагов от 3.1.1 до 3.1.4.
2. Выполните окрашивание поверхностных маркеров(таблица 4)в качестве шагов от 3,1,5 до 3,1,7, за исключением того, что время инкубации составляет 30 минут вместо 1 ч.
3. Resuspend клетки с 400 йл окрашивания буфера. Храните образцы в темноте на льду до анализа цитометрии потока.

8. Изоляция сыворотки от крови

1. На 14-й день после заражения (d.p.i 14) собирайте кровь из лицевой вены и храните образцы крови в холодильнике на 4 градуса Цельсия на ночь.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Выполнить сбор крови в состоянии ABSL2 и с этого шага и далее все процедуры могут быть выполнены в обычной лаборатории.
2. Центрифуга крови при 400 х г в течение 10 мин при 4 градусах Цельсия. Изолировать сыворотку с 200 МКЛ пипетки тщательно, чтобы избежать загрязнения красных клеток. Aliquot в 3 трубки для каждого образца и хранить их при -80 градусов по Цельсию.

9. Анализ HA-специфических антител титр с ELISA

1. Пальто ELISA пластины с 50 МКЛ 2 мкг / мл HA белковый раствор на колодец и инкубировать их в холодильнике 4 КК на ночь.
2. Вымойте три раза с 200 йл из PBS разбавленных 0,05% tween (PBST). Добавьте 100 мл разбавленного PBST 5% обезжиренного молока в каждую колодец и инкубировать в RT в течение 2 ч, чтобы заблокировать неспецифический связывание.
3. Разбавление и инкубация сыворотки: подготовить 3% BSA в PBS в качестве буфера разбавления. Разбавить сыворотку в буфере разбавления, как 1:50, 1:150, 1:450, ...... до 1:36450 (рекомендуется 3-кратное серийное разбавление). Добавьте 50 мкл разбавленной сыворотки к каждому хорошо и инкубировать в холодильнике 4 градусов на ночь.
4. Отбросьте сыворотку и быстро вымойте колодцы один раз, добавив 200 МКЛ ПБСТ в каждую скважину (встряхните ее мягко, затем отбросьте). Затем медленно мыть пластины на шейкере с 200 йл PBST три раза в течение 5 минут каждый.
5. Добавьте 100 мкл вторичного антитела, помеченного HRP, специфичного для всего IgG, IgM, IgG1, IgG2b, IgG2c (1:5000, разбавленного PBST) и инкубировать в RT на 1 ч. Вымойте пластины PBST, как описано в 9.4.
6. Вывийте равный объем Буфера А и Буфера B (TMB) из хранилища 4 КК и разогрейте в течение по крайней мере 30 минут на RT перед использованием. Смешайте A и B и добавьте 100 МКЛ TMB в каждый колодец и инкубировать их в течение 10-30 минут на RT, встряхивая мягко.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Это краткое описание руководства TMB Substrate Reagent Set (BD,555214).
7. Pipette 100 йл 2M H₂SO_{4 в каждую} колодец, чтобы прекратить реакцию. Прочитайте значение OD450 с помощью инструмента.
8. Анализ данных: получить окончательное значение OD450 путем вычитания фонового сигнала (значение OD450 пустой колодец). Нарисуйте кривую, соответствующую изотипу антитела каждого образца с фактором разбавления на оси X и значением OD450 на оси Y.

10. Гистология

1. Изолировать селезенку на d.p.i 10. Исправить их в 3,7% формальдегида раствор для 1 ч на RT. Отбросьте буфер фиксации и мыть с PBS в течение 5 минут на шейкере в течение трех раз.
2. Обезвоживание селезенки в PBS (10% сахарозы) при 4 градусов по Цельсию в течение 1 ч, а затем обезвоживать их в PBS (30% сахарозы) при 4 градусов по Цельсию с тряской мягко, пока селезенки опускаются на дно 15 мл трубки.
3. Вынул обезвоженные селезенки, встроить их в оптимальное соединение температуры резки и криозиции.
4. Предварительно охладите ацетон при -20 градусов по Цельсию. Инкубировать секции тканей с предварительно охлажденным ацетоном в течение 10 мин. Вымойте ткань с PBS в течение трех раз.
5. Permeabilize ткани разделов с PBS, содержащие 0,2% Тритон X-100 в течение 20 минут и мыть их в течение трех раз с PBS.
6. Блокировать неспецифические связывания с PBS, содержащие 10% нормальной сыворотки козы (блокирующий буфер) в течение 1 ч на RT и мыть ткани разделов с PBS один раз.
7. Заблокировыв неспецифическую привязку блокирующим комплектом STREPTAVIDIN/BIOTIN.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте образцам высохнуть с этого шага вперед.
8. Окрашивание первичными антителами: добавьте блокирующий буферный биотин-PNA (25 мкг/мл) и крысиный антимоша IgD (2,5 мкг/мл) на секции тканей тщательно. Инкубировать секции тканей во влажной камере в морозильной камере 4 КК на ночь.
9. Быстро мыть ткани разделов с PBST один раз. Быстро промыть секции тканей в PBST с встряхивания медленно в течение 5 минут. Повторите мыть в течение трех раз.
10. Разбавить Alexa Fluor 488-стрептавидин (1:500) и Alexa Fluor 555-Коза-анти крыса IgG (1:500) антитела с блокирующим буфером и добавить их на части ткани тщательно
11. Инкубация на RT в течение 1 ч.
12. Вымойте секции тканей как шаг 10.8 и тщательно смонтировать с пролонгировать раствор. Обложка ткани с coverslips тщательно и держать их в темноте при 4 градусов по Цельсию до конфокального анализа.
13. Проанализируйте величину реакции GC, подсчитав номера GC на размер области.

Характеристика заболеваемости мышей при инфицировании вирусом гриппа
После заражения вирусом гриппа, мыши менее активны и анорексией из-за болезни, которая находит свое отражение в тяжелой потере веса, широко используемый симптом для мониторинга заболеваемости^{мышей 19}. Как показано на рисунке 1a, PR8 вирус-инфицированных мышей начали терять вес на 6-й день, достигли самого высокого уровня потери на 8-й день и вернулся к первоначальному уровню на 10-й день. Как и ожидалось, потеря веса не наблюдалась на протяжении всего периода в PBS-обработанных контрольных мышей. При симптомах in vivo вирусная инфекция приводит к сильному расширению лимфоцитов в дренажных лимфатических узлах, МЛН в этом случае. Таким образом, значительно больший размер mLNs наблюдались у PR8 вирус-инфицированных мышей, чем у контрольных мышей(рисунок 1b). Взятые вместе, все эти мыши показали ожидаемые симптомы и были квалифицированы для последующего Tfh связанных иммунного ответа исследования.

Обнаружение дифференциации Tfh и связанных с функциями молекул
Чтобы проанализировать дифференциацию Tfh, мыши были принесены в жертву на 5, 7, 10 и 14 день после инфекции и mLNs или селезенки были изолированы для анализа цитометрии потока. Рисунок 2a и рисунок 2b показывают Tfh населения gating стратегии, с Tfh закрыты как PD-1^привет CXCR5^привет клеток и не-Tfh как PD-1^низкийCXCR5^{низких ячеек.} С помощью этой стратегии gating, кинетики Tfh дифференциации во время заражения вирусом гриппа были проведены анализы. Как показано на рисунке 2c, Tfh дифференциации инициализированы в день 5 и достиг пика в день 10. Поэтому мы взяли образцы 10-го дня для дальнейшего анализа. Как показано на рисунке 3a, надежная дифференциация клеток Tfh была вызвана у инфицированных вирусом гриппа мышей по сравнению с контрольных мышей. Для анализа специфических клеток Tfh, флюорохром помеченных IAbNP311-325 MHC класса II тетрамеры (NP_311-325) были добавлены в поликлональных Tfh клеток окрашивания панели (Таблица 1). Как в mLNs, так и в селезенке от инфицированных вирусом гриппа мышей, NP_311-325-специфические^CD4 и Т-клетки были значительно индуцированы и NP_311-325-специфические клетки Tfh могут быть проанализированы путем добавления PD-1 и CXCR5 в анализ(рисунок 3e). Из-за основных ролей Bcl6 в tfh дифференциации,^Bcl6и CXCR5^клетки могут также представлять население Tfh. Последовательно, Tfh клетки, отождествляемые с этой стратегией были также индуцированы надежно (Рисунок 3b). Мы также проанализировали экспрессию Bcl6 в Tfh и не-Tfh клеток. Как показано на рисунке 3c, более высокое выражение Bcl6 в tfh клеток, чем в не-Tfh клетки указывает на успешное окрашивание Bcl6. С аналогичной стратегией, ICOS, другой Tfh-ассоциированной молекулы также был проанализирован (Рисунок 3d). Из-за специализированной роли tfh клеток в оказании помощи для В-клеток, анализ экспрессии IL21, который выделяется в основном Tfh клеток и продемонстрировали непосредственно регулировать выживание и пролиферацию В-клеток, может выявить Tfh клетки функции в некоторой степени. Как показано на рисунке 3f, внутриклеточное окрашивание IL21 показало, что PR8 инфекции индуцированных значительно более высокое производство этого цитокина, с unstimulated клеток, как gating контроля. Взятые вместе, эти анализы могут отражать основную информацию о дифференциации Tfh и обеспечить понимание способности B-клеточной помощи.

Обнаружение развития GC B и плазменных клеток и специфических антител вируса гриппа в сыворотке крови
Основная функция tfh клеток заключается в том, чтобы обеспечить помощь В-клеток в GCs, в котором антитела класса переключения и сродства созревания происходят. Таким образом, развитие GC B может косвенно отражать дифференциацию и функцию клеток Tfh. Клетки GC B могут быть закрытыв качестве B220 и PNA^иFas⁽ Рисунок 2d). В рамках этой стратегии gating, мы анализированы кинетики GC B ответ клеток и обнаружили, что GC B ответ начался в день 10 и продолжал расти в день 14 (Рисунок 2e). Сравнение между PR8 вирус-инфицированных и контрольных мышей показали надежные GC B были вызваны как в mLN и селезенки после заражения вирусом гриппа(рисунок 4a), который согласуется с индуцированной Tfh дифференциации в PRB вирус инфицированных мышей. Кроме того, иммунофлуоресценция окрашивания с IgD и PNA обеспечивает визуализированы изображения, указывающие индуцированной реакции GC (зеленые зоны) в PR8 вирус-инфицированных мышей(рисунок 4d). Плазменные клетки, идентифицированные как IgD^низкийCD138 и клетки(рисунок 2d), также были созданы в PR8 вирус-инфицированных мышей (Рисунок 4b). Предыдущие исследования показали, что IFNƳ и IL21 могут быть секретированы из клеток Th1 и Tfh при вирусной инфекции и вызвать переключение класса IgG2 и IgG1,^{соответственно 20}. Рисунок 4c изображает генерацию вируса гриппа специфических антител ELISA анализ HA-специфических IgM, всего IgG, IgG1, IgG2b и IgG2C. В совокупности все эти анализы отражают связанные с Tfh В-клеточные реакции при инфицировании вирусом гриппа.

Рисунок 1: Характеристика заболеваемости мышей. 8-недельные мыши мужского пола были инфицированы 40 ПФУ вируса гриппа PR8 интраназальной прививкой. Мыши взвешивались ежедневно в течение 10дней (a)и mLNs были изолированы на d.p.i 10 (b). Бары ошибок вa ) представляютсреднее время ± SD. n и 4 мыши на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2: Стратегия Гэтинга клеток Tfh и клеток GC B. а)лимфоциты определяются FSC-A и SSC-A, а сотовые синглеты закрыты FSC-A, FSC-H и SSC-A, SSC-W. b)После замыквания в CD4^и T-ячейках, поверхностные маркеры CD62L и CD44 используются для различения наивных Т-клеток (CD44^loCD62L^hi)и активированных Т-клеток (CD44^hiCD62L^lo). Поликлональные Tfh клетки могут быть закрыты от активированных Т-клеток, как PD-1^привет CXCR5^{привет населения,} наоборот, не Tfh клетки, как PD-1^низкийCXCR5^низкий. PR8 вирус-специфических Tfh клетки определяются как^CD4и CD44 NP_311-325 тетрапераи PD-1^привет CXCR5 привет^{клеток.} (c,e) Кинетики tfh частоты в активированных клетках (c) и GC B частоты в B220^{и клеток} (e). (d)Клетки GC B закрыты как B220^- PNA^иFAS -^{клетки,} а плазменные клетки IgD^-CD138 -^{клетки.} Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Анализ дифференциации Tfh у зараженных вирусом мышей PR8. Мыши были принесены в жертву на d.p.i 10 и mLNs и селезенки были изолированы для анализа дифференциации Tfh. (a) Tfh процент в mLNs и селезенки в PR8 вирус-инфицированных мышей и PBS-обработанных мышей (верхняя панель). Статистика клеток Tfh (нижняя панель). b)внутриклеточное окрашивание Bcl6 в CD4^иCD44 привет^{Т-клеток} (верхняя панель). Статистика ячеек Bcl6^иCXCR5^{(нижняя} панель). c ) Bcl6и(d) выражениеICOS в Tfh (линии-красный) и не-Tfh клетки (твердо-серый). e)gating NP_311-325-специфических^CD4 и Т-клеток в mLNs и селезенках вирус-инфицированных PR8 и PBS-обработанных мышей (левая панель). Процент PR8 вирус-специфических tfh клеток в mLNs и селезенки (средняя панель). "Изотип" указывает на окрашивание с неуместным контролем теттрамера. Статистика NP_{311-325 -специфических}CD4 и^{Т-клеток} (правая панель). (f)Внутриклеточное окрашивание ИЛ-21 в splenic CD4^и Т-клеток от PR8 вирус-инфицированных и PBS-обработанных мышей, нестимуляция показано как контроль (слева). Статистика окрашивания Ил-21 (справа). «P lt; 0.01, «P»lt; 0.001 и P lt; 0.0001 (двуххвостый студенческий т-тест). Бары ошибок представляют среднее ± SD. n 3 мыши на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4: Анализ реакции, связанной с клетками GC B, у зараженных вирусом мышей PR8. Мыши были принесены в жертву на d.p.i 10 и mLNs и селезенки были изолированы для анализа. a)процент клеток GC B (верхняя панель). Статистика клеток GC B (нижняя панель). b)процент плазменных клеток (верхняя панель). Статистика плазменных клеток (нижняя панель). c)количественная оценка вируса PR8 HA-специфических IgG, IgM, IgG1, IgG2b и IgG2c в сыворотке крови (d.p.i 14) инфицированных вирусом мышей PR8 и мышей, обработанных PBS. d)Конфокальцавная микроскопия В-клеточных фолликулов^(IgD, Red) и GCs (PNA, Green) в образцах селезенки зараженных вирусом мышей PR8 и обработанных PBS мышей (d.p.i 10). «P lt; 0.5, хт; 0,01, и 0,001 (двуххвостый студенческий т-тест). Бары ошибок представляют среднее ± SD. n 3 мыши на группу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Поверхностный маркер (за исключением CXCR5) антител панели для окрашивания Tfh клеток (PD-1^приветCXCR5^привет).

Таблица 2: Поверхностные маркерные антитела (за исключением CXCR5) панели для окрашивания Bcl6 в клетках Tfh.

Таблица 3: Поверхность маркер антител панели для внутриклеточного окрашивания IL21.

Таблица 4: Поверхность маркер антител панели для окрашивания GC B и плазмы В-клеток.

Из-за специализированных ролей в предоставлении B-клеточной помощи для генерации антител высокого сродства, Tfh клетки были широко изучены в механизмах дифференциации и манипуляции, чтобы обеспечить новые стратегии для разработки вакцины. Инфекция вирусом гриппа вызывает энергичные ответы Tfh и GC B клеток, таким образом, является подходящей моделью для этой области исследований. В этом документе мы описали протоколы инфицирования вирусом гриппа путем интраназальной прививки, оценки связанных Tfh ответных мер по цитометрии потока, иммунофлюоресценции и ELISA. Эти анализы будут способствовать выявлению tfh дифференциации, развития GC B и гриппа вирус конкретных антител и помочь исследователям изучить и определить новые важные молекулы в иммунном ответе.

В исследованиях с моделями инфицированных вирусом гриппа мышей, потеря веса является широко используемым показателем заболеваемости мышей. Ожидаемое изменение веса кинетики в вирус гриппа инфицированных мышей, как описано на рисунке 1a, который отражает соответствующий иммунный ответ, вызванный у мышей. Тем не менее, ненормальные случаи будут регулярно происходить, в которых мыши теряют вес или не показывают никакого снижения веса на протяжении всего периода наблюдения. Согласно нашему опыту, эти мыши в основном несут ненормальный более низкий или более высокий иммунный ответ, тем самым нарушая результаты эксперимента. Чтобы избежать таких вариаций, во-первых, мыши, используемые в эксперименте, должны быть половых и возрастных, чтобы гарантировать аналогичную способность реагировать на вирус. Последовательный вирус titer для каждой мыши также важно²¹. Вирус titer используется в этом протоколе 40 ПФУ. Тем не менее, вирус titer, чтобы вызвать соответствующие изменения веса кинетики в каждой лаборатории может быть переменной из-за несоответствия в процедуре оценки вируса titer и штаммов мыши, используемых в эксперименте. Таким образом, мы советуем titration вируса титр для инфекции необходимо до иммунного ответа соответствующих исследований.

В этом протоколе мы определили tfh-клетки с часто используемыми маркерами PD-1, CXCR5 и существенным транскрипционным фактором Bcl6. Несмотря на то, что оба PD-1привет CXCR5 привет и Bcl6 и CXCR5^клетки могут быть обозначены как Tfh клетки, они представляют различные группы населения и не имеют отношения предшественника-потомства на основе того факта, что не все PD-1^приветCXCR5^привет клетки Bcl6 и не все Bcl6 и CXCR5 привет клетки PD-1 привет CXCR5 привет . Этот фенотип может быть объяснен неоднородностью экспрессии Bcl6 в клетках Tfh²². ICOS, важнейшая молекула как для дифференциации Tfh, так и для миграции, также должна быть включена в анализ дифференциации Tfh. Кроме того, другие связанные с функцией состимуляторные молекулы, такие как OX40 и CD40L, также должны быть обнаружены на уровне их экспрессии, хотя и не включены в этот протокол. IL21 и IL4 оба Tfh-секретных цитокинов, играющих роль в стимулировании IgG1 класса переключения. Протокол обнаружения выражения IL21 описан в настоящем документе. Однако, из-за трудностей в обнаружении IL4 в клетках Tfh, IL4-GFP репортер мышей были использованы в предыдущих^{исследованиях 23}. В этом протоколе, мы также использовали фторхром помечены NP тетрамеры для обнаружения NP_311-325-специфических tfh клеток. Тем не менее, ограничение в количестве NP_{311-325-специфических}клеток Tfh дает трудности в дальнейшем анализе. Таким образом, приемный эксперимент передачи гриппа гемагглютинин специфических-TCR трансгенных (Tg)^CD4 (TS-1) Т-клеток, которые могут быть изолированы от мышей ЦА-1, является альтернативной стратегией в решении этой^{проблемы 24}.

Здесь мы определили GC B как B220^-PNA и Fas^{- клеткив} окрашивание цитометрии потока. Альтернативная стратегия комбинации маркеров для определения GC B как GL7^приветFas^привет клетки также используется в других^{документах 14,16}. Мы также используем иммунофторесценцию для визуализации ДК с сочетанием анти-IgD и PNA. В этом добавлении антитела CD3 может помочь визуализировать клетки Tfh, таким образом позволяющ изучение взаимодействия между этими 2 типами^{клетки 10.}

Учитывая дифференциацию tfh-клеток является многоступенчатым и многофакторным процессом, дополнительный анализ других значительных молекул в нескольких точках времени необходим для выяснения более детального механизма дифференциации Tfh. Кроме того, параметры, обнаруженные здесь, также широко используются в других моделях¹⁸. Поэтому, помимо инфекции, связанной с вирусом гриппа, описанные здесь протоколы, особенно иммуностимуляторная часть, могут также давать инструкции в исследовании, связанном с Tfh, с другими моделями.

Авторов нечего раскрывать.

Благодарим сотрудников предприятия по цитометрии потока, объекта ABSL2 и животноводского комплекса SPF Института Пастера в Шанхае за техническую помощь и консультации. Эта работа была поддержана следующими грантами: Стратегическая приоритетная исследовательская программа Китайской академии наук (XDB29030103), Национальная ключевая программа НИОКР Китая (2016YFA0502202), Национальный фонд естественных наук Китая (31570886).