Лазерно-индуцированное излучение флуоресценции (L.I.F.E.) как роман неинвазивный инструмент для измерения биомаркеров в Cryospheric Habitats

Углеродные потоки в криосфере пока практически не оцениваются, но имеют решающее значение в отношении изменения климата. Здесь мы показываем новый прототип устройства, которое захватывает фототрофический потенциал в надрагляционных средах на основе лазерной индуцированной флуоресценции выбросов (L.I.F.E.) технологии, предлагающие высокие спектральные и пространственное разрешение данных в условиях situ.

Глобальное потепление затрагивает микробные сообщества в различных экосистемах, особенно в местах обитания криосферных. Тем не менее, мало что известно о микробных опосредовано углеродных флюсов в экстремальных условиях. Таким образом, методология приобретения выборки, описанная в весьма немногих имеющихся исследованиях, предполагает две основные проблемы: А) данные высокого разрешения требуют большого числа выборок, которые трудно получить в отдаленных районах; B) неизбежные манипуляции образца, такие как резки, распиловки и таяния кернов льда, что приводит к непониманию условий in situ. В этом исследовании представлен прототип устройства, не требующего ни подготовки образцов, ни разрушения образца. Устройство может быть использовано для измерения situ с высоким спектральным и пространственным разрешением в наземных и ледяных экосистемах и основано на l aser-Induced Fluorescence Eмиссии (L.I.F.E.)техники. Фотоавтотрофные супраглационные сообщества могут быть идентифицированы путем обнаружения подписей L.I.F.E. в фотопигментах. Показано калибровку прибора L.I.F.E. для порфирина, производной хлорофилла_a (chl_a)(405 нм лазерного возбуждения) и B-фикоэритрина (B-PE) (532 нм лазерного возбуждения). Для проверки этой методологии данные L.I.F.E. были ратифицированы обычным методом для хл_{количественной} оценки, которая включала экстракцию пигмента и последующую спектроскопию поглощения. Прототип применимости в полевых условиях был доказан в экстремальных полярных условиях. Дальнейшие испытания на наземных средах обитания проводились во время аналогового моделирования Марса в марокканском десерте и на австрийском леднике. Инструмент L.I.F.E. позволяет сканировать большие территории с приемлемым разрешением и способствует лучшему пониманию экологического потенциала надувных сообществ в контексте глобальных изменений.

Криосфера содержит морской лед, ледники, высокогорные озера, снежные районы, ледники озера, талые потоки воды и вечную мерзлоту. Эти области покрывают приблизительно 11% суши Земли^1,2 и являются всеобъемлющими атмосферой как признанной криосферной средой. Недавние исследования показывают, что массивные участки криосферы быстро отступают^3,4. Антарктические^5,6,Альпы^7,Арктика^8,и другие регионы показывают отрицательные балансы ледяной массы. Отступление ледяных шапок и ледников приводит к истощению нашего крупнейшего пресноводного резервуара на Земле. В некоторых районах, отступление ледника остановить⁵.

Долгое время ледовые экосистемы считались стерильной средой. Однако, несмотря на суровые условия, наличие активной жизни в криосфере Земли очевидно^{9,10,11,12,13,14,15} . В связи с тенденцией к массовым потерям льда в результате таяния криосфера переживает сдвиг в биологической активности, затрагивая прилегающие места обитания. Чтобы понять эти частично необратимые изменения, нам требуются методы исследования биологической активности во льду в условиях ситу с высоким пространственным и временным разрешением.

В надувательных средах жизнь можно найти в криоконитных норах, снежных покровах, талой воде, ручьях и на голых ледяных поверхностях. Однако наиболее очевидными суфражистскими местами обитания являются криоконитовые отверстия. Они появляются глобально в оледенелых средах и были впервые описаны шведским исследователем Адольфом Эриком Норденшельдом во время экспедиции в Гренландию в 1870-х^16,17. Название происходит от греческих слов "kryos" (холодный) и "konia" (пыль). Темный и неорганический мусор, полученный из эолийской, прикрепляются к поверхности льда и уменьшают альбедо локально. Солнечная радиация способствует таянию мусора в более глубокие слои льда, образуя цилиндрические бассейны с осадками (криоконит) в нижней⁹. Криоконитовые отверстия покрывают 0,1-10% зон оленей^11.

Криоконитовые сообщества состоят из вирусов, грибков, бактерий, цианобактерий, микроводорослей и простейшей. В зависимости от региона, метазоановые организмы, такие как гнилые, нематоды, копеподы, tardigrades, и личинки насекомых также могут быть найдены. Эдвардс и другие¹⁸ описывают криоконитовые отверстия как «ледяные горячие точки». Они также прослеживают функциональные гены в криоконитных отверстиях, которые отвечают за N, Fe, S и P велоспорт. Мини-экосистемы озера respire и фотосинтезируют на тарифах найденных в очень более теплых и питательн-богатых habitats¹¹. Эти выводы подчеркивают важную роль микробного секвестра в супраглакиальной среде. Помимо живых сообществ в криоконитных ямах, голые ледяные поверхности населены ледяными водорослями. Их физиология хорошо изучена^19, но их пространственное распределение не было оценено²⁰. Их присутствие в supraglacial средах уменьшает альбедо и, следовательно, способствует плавлению, что приводит к питательным outwash и питательных веществ ввода в местах обитания вниз по течению⁹. Повышение температуры и, следовательно, более высокая доступность жидкой воды влияет на чистую продуктивность экосистем в этих ледяных экосистемах.

В супраглационной среде фотосинтетически активные организмы превращают неорганический углерод и азот в органические, доступные источники микробной пищевой сети^21,22. До сих пор Есть несколько исследований, которые оценивают supraglacial углеродных^{колебаний 11,20,23}. Расхождение в предлагаемых темпах углеродного потока обусловлено низким пространственным и временным разрешением данных. Кроме того, пространственное распределение свращенцев за пределами криоконитных отверстий практически не оценивается. Кук и другие²⁰ предсказал в своих моделях, что supraglacial водорослей общин исправить до 11x больше углерода, чем современные криоконит отверстия из-за их большого покрытия поверхности. Обнаружение супраглациальных водорослей общин обеспечения целостности выборки по-прежнему препятствует из-за отсутствия инструментов для обнаружения на месте и количественной оценки.

В ответ на трудности в области логистики ледовые экосистемы изучаются реже, чем места обитания в районах с умеренным характером. Разрешение данных зависит от количества оцениваемых образцов и зависит от доступности исследуемых участков. Стандартные методы отбора проб, такие как распиливание, корирование и последующее таяние, включают манипуляции микробного сообщества. Например, оценка хлорофилла (chl_a)в образцах твердого льда невозможна стандартными методами без существенных помех. Таким образом, таяние вызванных изменениями температуры в исследуемых микробных сообществах неизбежны. В ответ на термоловость фотосистемы II и других клеточных структур у психофилов^22,лабораторные анализы образцов растаяветого льда всегда приведут к фальсификации условий на месте.

Неразрушающие измерения на месте являются единственным разумным способом получения достоверных данных. Эта цель может быть достигнута с помощью методов, основанных на флуоресценции. Благодаря своей легкой функции сбора урожая, chl_a и B-phycoerythrin (B-PE) присутствуют в организмах, которые способствуют углеродному циклу в свраглачных средах, как это было доказано Anesio и другими¹¹. Таким образом, эти флуоресцентные молекулы являются подходящими биомаркерами для количественной оценки опосредованных микробами углеродных колебаний в ледяных экосистемах.

В этом исследовании мы представляем разработку, калибровку и применимость нового неинвазивного инструмента для количественной оценки молекул chl_a и B-PE в наземных и ледяных экосистемах. Прототип устройства основан на лазерной индуцированной флуоресцентной эмиссии, также известной как L.I.F.E. Оптический прибор(рисунок 1) фиксирует флуоресцентные подписи биомаркеров после лазерного индуцированного флуоресценции возбуждения. Процедура неразрушительная и может быть выполнена на месте исследования или в лаборатории.

Рисунок 1: прототип L.I.F.E. Слева: Фотография инструмента без защитной крышки. Справа: Схематическая иллюстрация инструмента. Общая масса - 5,4 кг (лазер и оптика - 4,025 кг, ноутбук - 1,37 кг). Алюминиевая рама 32,5 см х 20,3 см х 6,5 см. Оптическая трубка: 18,4 см х 4 см (диаметр). CCD: датчик bluefox mv220g; F: сервоуправляемые фильтры с длинным проходом (450 нм и 550 нм); L: оптические линзы; M1: зеркала; M2: дихроическое зеркало; MC: микроконтроллер; П: призма; PBS: поляризационный сплиттер пучка; S: щели диафрагмы из регулируемых лезвий бритвы. Шкала бар 70 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Портативный двухволновый комплект весит 4,5 кг и используется на штативе в сочетании с внешним компьютером. Установка поля быстрая и легкая. Инструмент крепится к штативу, а трубка объектива крепится к устройству вместе с USB-кабелем и кабелем камеры. Внешний компьютер подключен к инструменту с помощью USB-кабеля. Ноги штатива отрегулированы таким образом, что трубка объектива направлена на образец и покрывает его. Затем зеленый лазер размером 5 мВт попадает в образец после прохождения поляризационного сплиттера, который перенаправляет поляризованный свет к оптической оси спектрометра. Образец обладает флуоресцентным светом, иллюстрированным красным цветом на рисунке 1. Половина коллимированного света проходит поляризационный сплиттер луча и сосредоточена через сервоуправляемый фильтр с длинным проходом, который удаляет лазерные сигналы. Далее сигнал попадает в щель диафрагмы, состоящую из двух регулируемых лезвий бритвы. Призрак спектра отделяет тонкую линию света ортогонал к щели диафрагмы, прежде чем сигнал захвачен датчиком. Процедура повторяется с помощью синего лазера. Необработанные данные автоматически передаются на портативный компьютер, который также используется для работы программного обеспечения.

Инструмент управляется внешним компьютером с помощью среды LabVIEW, которая синхронизирует съемку с камерой CCD, включение/выключение лазеров и включение длиннопроходного фильтра. Графический пользовательский интерфейс (GUI) разделен на три основных раздела. Регулировка экспозиции выполняется вручную. Хотя коррекция между временем экспозиции и интенсивностью сигнала линейна(рисунок 2B),максимальное время экспозиции ограничено 10 с, поскольку более длительные сроки интеграции приводят к значительному снижению коэффициента сигнала к шуму. Поле комментариев используется для описания образца(рисунок 2A). В правом разделе, сырые изображения отображаются, как только измерения закончены. Эта функция имеет решающее значение для немедленной оценки данных в поле(рисунок 2C-E). Красные области указывают на переэкспонированные пиксели, которых можно избежать, сократив время экспозиции.

Последующий процесс сокращения необработанных данных отделяется от процедуры получения изображения и может быть выполнен в любое время после приобретения изображения.

Рисунок 2: графический пользовательский интерфейс L.I.F.E. для сбора данных и оценки необработанных данных. (A) Программное обеспечение позволяет ручной ввод текста для описания образцов. (B) Время экспозиции может быть скорректировано до измерения. (СЕ) Необработанные изображения отображаются на правой стороне интерфейса. (E) Красные цвета указывают на насыщенность датчика. (F) Активация кнопки RUN MEASUREMENT запускает процесс получения данных. В массиве (G), отображаются все команды, выполняемые автоматически при получении данных. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3: Пример необработанного изображения. Слева: Сырые данные chl_{стандарт} в растворе ацетона, записанные с помощью инструмента L.I.F.E. Благодаря оптическим свойствам устройства сигнал отображается как искривленная линия. Справа: Интерпретация исходного изображения на пиксель (px). Спектральная ось (разрешение 5 нм/px) построена на фоне пространственной оси (разрешение 30 мкм/px). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

12-битные серые необработанные изображения показывают пространственный компонент из-за одномерной щели диафрагмы и спектрального компонента из-за призмы перед CCD (Рисунок 3). В ответ на оптические ограничения необработанные изображения искажаются. Поэтому их необходимо обрезать и обезображить, применяя код, признающий степень искажения. Это делается с мастером программного обеспечения(Рисунок 4). Далее калибровка длины волны осуществляется с помощью лазера 532 нм. Зеленый свет производится путем удвоения частоты инфракрасного лазера на 1064 нм. Обе длины волн могут быть обнаружены CCD и, следовательно, спектральное положение каждого пикселя может быть рассчитано в dewarped изображения автоматически (Рисунок 4).

Затем картинка обрезается до заданного диапазона длин волн (550-1000 нм для измерений зеленого лазера и 400-1000 для синих лазерных измерений). Серые значения от каждого пикселя в выбранной строке пикселей подсчитываются и суммируются. Серое значение может варьироваться от 0 до 255. После этого каждая строка пикселей приходится на одно число. Дальнейшие инструкции по программному обеспечению на экране приводят к генерации сюжета, показывающего, что серое значение отсчитывается от каждой строки пикселей, построенной на основе пространственных координат. Это позволяет одновременно обеспечить количественную пространственную дискриминацию chl_a и B-PE в выборке. Кроме того, спектральные свойства образца могут быть построены из выбранных пиксельных линий автоматически.

Рисунок 4: Развенчивая необработанные изображения. Слева: Сырое изображение, снятое зеленым лазером. Фильтр не использовался. Сигналы отображаются на 532 нм и 1064 нм. Время экспозиции 0,015 с. Центр: обрезанный сигнал 532 нм используется в качестве эталонной линии для раздува набора изображений. Справа: Dewarped изображение из исходного источника изображения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

1. Калибровка и проверка

ПРИМЕЧАНИЕ: Для калибровки пигмента, подготовить разбавления строки из запасов решений chl_a и B-PE. Раствор хл_{бульона} разбавляют ацетоном, а B-PE разбавляют дистиллированной стерильной водой. Позже потребуется 15 мл каждого шага разбавления. Защитите пигменты от света, обернув их алюминиевой фольгой. Храните chl_a в морозильной камере и B-PE в холодильнике до дальнейшего использования. Подробный протокол для строки разбавления следует в разделах 1.1 для chl_a и 1.2 для B-PE. Ниже описана_как кхлная и лабораторная калибровка B-PE для обнаружения пигмента и количественной оценки с помощью прибора L.I.F.E. Предыдущая калибровка²⁴ была сделана с теми же пигментами, что и в данном исследовании.

1. Хлорофилл разбавления строки
   1. Растворите 1 мг хл_a (очищенного от водорослей A. nidulans) с ацетоном в 50 мл пробной трубки и разбавьте этот хл_{бульонный} раствор с ацетоном до следующих конечных концентраций: 1000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; 5; 1; и 0,5 нг/мл.
   2. Перенесите 15 мл каждого разбавления в 50 мл пробных трубок и накройте их алюминиевой фольгой из-за светочувствительности. Храните трубки в морозильной камере -20 градусов до тех пор, пока не будут проведены измерения калибровки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть прерван здесь.
   3. Измерьте_{функции} поглощения chl от каждого разбавления в двухлучевом спектрофотометре в виде триплетатов и вычислите_{содержание} chl, описанное Лоренценом²⁵, который будет подробно описан в разделе 2.2.2.
2. Строка разбавления PE
   1. Разбавить 4 мг/мл бульонного раствора B-PE стерильной фильтрованной водой (pH no 7) до следующих конечных концентраций: 1000; 800; 640; 320; 160; 80; 40; 20; 10; и 5 нг/мл B-PE. Перенесите 15 мл каждого разбавления в 50 мл пробной трубки и накройте его алюминиевой фольгой. Хранить при 4 градусах по Цельсию до дальнейшего использования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол может быть прерван здесь.
3. Настройка для калибровки
   1. Постройте стойку, как показано на рисунке 5, чтобы установить три измерительные платформы, каждая из которых на 1,5 см выше следующей.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Высота стойки и столбца играют важную роль для измерений, поскольку поверхность жидкостей должна оставаться в координационном центре прибора L.I.F.E., указанного на рисунке 5.
   2. Добавьте 5 мл самого высокого концентрированного разбавления в полицинтилляционный пластиковый флакон и положите его на самую высокую точку стойки. Измерьте интенсивность флуоресценции.
   3. Поместите флакон в среднее положение стойки и добавьте еще 5 мл (10 мл общего объема). Измерьте интенсивность флуоресценции. Повторите процедуру в самом низком положении на стойке с другой 5 мл (15 мл общий объем; в общей сложности 45 мм в высоту колонны).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Адаптировать время экспозиции для каждого шага разбавления, чтобы предотвратить насыщение детектора (серые значения более 255 на 12-битных изображениях) и для достаточного соотношения сигнала к шуму слабых сигналов флуоресценции.
   4. Повторите шаги 1.3.2 и 1.3.3 со всеми разбавлениями (шаги 1.1.1 и 1.2.1) chl_a и B-PE.
   5. Загрузите генерируемые файлы данных в мастер сокращения данных, чтобы автоматически подсчитать и суммировать серые значения от каждой пиксельной линии вдоль Y-оси (пространственное распределение).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Изменение времени экспозиции компенсируется автоматически путем нормализации интенсивности флуоресценции до времени интеграции 1 с.
   6. Рассчитайте плотность пигмента с помощью регрессионного анализа Пуассона, используя известные концентрации из серии разбавления и нормализованную интенсивность флуоресценции, которые были рассчитаны. Затем нормализовать количество флуоресценции с трех различных высот столбца до 1,5 см (5 мл) путем умножения отсчетов с каждой высоты столбца с коэффициентом (факторы 1, 0,5 и 0,33, для 5 мл, 10 мл и 15 мл концентрационных растворов соответственно).

Рисунок 5: Настройка для калибровки L.I.F.E. с кхлью_a и B-PE в лабораторных условиях.
(A) Ленс трубки инструмента. (B) Зеленый лазер для возбуждения B-PE. (C) Синий лазер для_chl возбуждение. (D) Scintillation флакон. (E) Координационный центр l.I.F.E. инструмент. (F) B-PE/вода или chl_a/acetone раствор с 5 мл, 10 мл и 15 мл. (G) Космические ракеты, которые держат поверхность каждого раствора в фокусной плоскости в течение трех различных томов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

2. Отбор проб и обработка проб

1. Коллекция снега и льда
   1. Собирайте снег и надраглациальный лед из ледника в стерильные полиэтиленовые пакеты и храните их замороженными до дальнейшей обработки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для этого исследования, образцы были собраны в Мидтре Lovenbreen (MLB), политермальный ледник вблизи исследовательской деревни Ny-Олесунд в высоком Арктическом архипелаге Шпицберген (78'53 'N, 12'03' E).
   2. Пример бактериальных ковриков из ледникового поля в стерильные полиэтиленовые пакеты и транспортировать все образцы в лабораторию для дальнейшей обработки.
   3. Растопить замороженный материал медленно в темноте при температуре 4 градусов по Цельсию. Фильтруй жидкие образцы на фильтрах GF/F (диаметр 47 мм) и обратите внимание на отфильтрованный объем. Держите фильтры замороженными до дальнейшей обработки.
2. Хлорофилл измерения
   1. Используя инструмент L.I.F.E., измерьте фильтр в четырех случайных областях, каждый в трипликисах с помощью зеленого и синего лазера. Рассчитайте общую концентрацию пигмента, умножая плотность области с отфильтрованной областью и отфильтрованным объемом. Нормализовать концентрацию пигмента (мкг/л) до объема 1 л.
   2. Оцените_{содержание} chl фильтров GF/F с лабораторным стандартом в соответствии с протоколом Лоренцена²⁵. Для этого поместите каждый из фильтров во флакон с 13 мл ацетона и храните их в темноте при 4 градусах Цельсия на ночь. Далее возьмите флакон и поместите его на лед до звуков в течение 2 минут при 50% мощности в непрерывном режиме. Сожмите и удалите фильтр с флакона.
   3. Прикрепите тигоновые трубки к шприцу и удалите_из флакона смесь экстракции-ацетона. Замените трубку тигона на держатель фильтра GF-5. Перенесите раствор в кварцевый кювет.
   4. После калибровки спектрометра абсорбции для ацетона поместите образец в кювет в спектрометр и измерьте абсорбционные объекты между 400–750 нм. Затем снимите квет из спектрометра и добавьте в образец 200 кл 2 М ЛК. Затем повторите измерение абсорбции для измерения содержания фаеофитина в образце.
3. Измерение микробной активности с помощью радиомаркированных маркеров и влияние интенсивности лазеров и времени воздействия на производительность
   ВНИМАНИЕ: Остерегайтесь маркерной радиоактивности (яп. Используйте лабораторное пальто, перчатки и очки, и работать под дымом капот в лицензированной лаборатории изотопов.
   1. Для бактериального производства перенесите пять аликотов бактериальных ковриков в стерильные полиэтиленовые пакеты. Инактивируйте элементы управления формальдегидом до 4% конечной концентрации.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три aliquots используются для ³H-маркированных лейцинов поглощения и два aliquots используются в качестве элементов управления.
   2. Вынатите коврики с помощью синего лазера (405 нм, 5 мВт) и зеленого лазера (532 нм, 5 мВт) по 10 с и 30 с каждый. Повторите процедуру с помощью лазеров 50 мВт. Затем инактивируйте образцы, которые не были обработаны формальдегидом.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Один коврик используется только для одного лазерного воздействия. Используйте неподвергающиеся микробным коврикам в качестве элементов управления.
   3. После лазерной обработки, оценить бактериальной и первичной продукции путем включения ³H-лейцин и¹⁴CO₃, соответственно. Для измерений производства бактерий используйте пять аликвот на образец (20 мл) и добавьте формалин (4% конечной концентрации) к двум параллелям, которые служат в качестве контроля для абиотического включения маркера. Добавьте ³H-лейцина (40 нм) во все образцы различных методов лечения и инкубировать их в течение 4 ч при условии на месте (0,1 градуса по Цельсию). Прекратите реакцию, добавив формалин к оставшимся живым образцам.
   4. Для бактериального производства бактериальных ковриков, передача помеченных образцов в криовиалы. Извлекайте клетки с 5% трихлороацетической кислотой и центрифугой при 10 000 х г в течение 5 мин в соответствии с протоколами Кирхмана²⁶ и Bell²⁷. Добавить сцинтилляционную жидкость и положить криовиальный в флакон пополнительности. Проанализируйте образцы с помощью счетчика жидкостного сцинтилляции и вычислите скорость поглощения.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Три aliquots используются для ³H-маркированных лейцина поглощения, два aliquots используются в качестве элементов управления.
   5. Для первичного производства, подготовить пять реплик различных процедур (100 мл), обернуть два из них в алюминиевую фольгу, чтобы имитировать темные образцы, и добавить¹⁴CO₃ (1 Ci) для всех. Инкубировать 4 ч в освещении окружающей среды и температуре на месте (0,1 градуса по Цельсию). Прекратите реакцию, затемнив оставшиеся три репликации и процедите образец на фильтры GF/F (диаметр 25 мм).
   6. Добавьте 100 кЛ 2 N HCl к фильтрам для того чтобы извлечь весь сверхнормальный углерод и препятствовать ему вне под капотом дыма. Высушите образцы на нагревательной пластине при 80 градусах Цельсия и поместите образцы в флаконы по полицинтилляции.
   7. Для измерения радиоактивных дезинтеграций в минуту (dpm) всех методов лечения первичного и бактериального производства, поместите криовиалы в флаконы пополнители и добавьте 5 мл сцинтилляционного коктейля. Измерьте dpm с жидким счетчиком сцинтилляции и вычислите тарифы поглощения.

Лабораторная калибровка для B-PE
Сигналы реакции b-PE разбавления были измерены с прибором L.I.F.E. в темной комнате на 20 c(рисунок 6). Скорость подсчета зависела как от концентрации, так и от высоты столбца измеренного образца. Низкая концентрация и низкая высота колонны B-PE образца флуоресцентный сильнее по сравнению с образцами той же концентрации и более высокой высоты столбца.

Рисунок 6: лабораторная калибровка B-PE. Показано содержание B-PE и калибровка плотности столбцов. Нормализованные ставки подсчета были рассчитаны для колонны высотой 1,5 см. Перепечатка с разрешения²⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Регрессия Пуассона была использована для окончательной линии калибровки. Существовала линейная корреляция между плотностью области и пиксельсерым серым значением. Функция кривой была y 81.04x(Рисунок 7),что означает, что серая скорость подсчета значений 8104 в 1 с открытой выборке равна плотности области 100 нг/см² B-PE. _{Калибровка} chl настроена аналогом. Функция была у 8.94x.

Рисунок 7: Окончательная кривая калибровки для B-PE. Серые значения были нормализованы до времени экспозиции 1 с и построены против плотности области. Перепечатка с разрешения²⁸. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Применение криоконита образцов Шпицбергена и лабораторная проверка данных
Средние значения измерений L.I.F.E. и одиночные измерения одних и тех же образцов, полученных из обычной добычи с использованием ацетона и последующего анализа с помощью спектрофотометра, иллюстрируются на рисунке 8.

Рисунок 8: Проверка данных с натуральными образцами. Образцы (MLB) ранжируются по_{содержанию chl,} на основе результатов лабораторного спектрофотометра (одиночные значения) и сравниваются с_кхли данных флуоресценции, измеренных на четырех случайных областях на фильтр. Бары ошибок представляют собой стандартное отклонение измерений L.I.F.E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Хл_{содержимое} в диапазоне от 48 мкг/L-67 мкг/л были недооценены, а более низкое_{содержание} chl от 0,7 мкг/Л-7 мкг/л было переоценено прототипом L.I.F.E. Стандартные отклонения от измерений L.I.F.E. были низкими.

Сравнение спектральных данных измерений на месте с лабораторными стандартами
Chl_{спектра} были сопоставимы между криоконит образцов и те, очищенных от водорослей A. nidulans. Пики флуоресценции во всех образцах были расположены на уровне 700 нм-710 нм. Тем не менее, спектры, полученные из криоконит образцов показали более высокие шумовые сигналы между 400 нм-650 нм и от 800 нм-1000 нм по сравнению с спектрами_КХЛ пигмента стандарта (Рисунок 9).

Рисунок 9: Интерпретация спектральных данных. Измерения четырех гранул криоконита (синий) и хл_{стандартный пигментный} раствор (красный) после возбуждения с 405 нм лазеров. Спектры были записаны через год после сбора образцов. Образцы были заморожены и не подвергались воздействию света до начала измерения. В ответ на вопросы калибровки длинволн пик флуоресценции расположен на уровне 700 нм-710 нм вместо 680 нм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Автоматизированный анализ криоконитного зерна
В примере автоматизированного анализа криоконитного отверстия(рисунок 10),самая высокая плотность пигментной области наблюдалась на пиксельной линии 50. Спектр образца после возбуждения с лазером 532 нм показал пик с отрезанным на сером значении 255 в ответ на перенасыщение датчика. Этот пик получен от зеленого лазера, а не от флуоресцентного сигнала.

Рисунок 10: Автоматизированный анализ данных одного криоконитного гранулы диаметром 1 мм. Образец был собран в Вестре Брюггербрене (VBB) и измерен в пределах 4 ч после взятия проб в темной лабораторной комнате на объекте Арктической станции (ГБ) в Ню-Олесунде. Левая колонка показывает измерения B-PE, а правая колонка представляет_{данные chl.} Необработанные изображения отображаются сверху. Лазерно-индуцированные флуоресценции ответы отображаются в серый цвет. Красные области указывают на реакцию стандартных пигментов. Средний раздел иллюстрирует пространственное распределение целевых пигментов. Спектральные свойства флуоресценции сигнала отображаются в нижних изображениях. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Влияние лазерного возбуждения на производительность в бактериальных ковриках
Ни первичной, ни бактериальной производительности не были затронуты при увеличении мощности лазера и / или время воздействия(рисунок 11). При лазерном лечении с повышенной мощностью не было обнаружено существенных различий.

Рисунок 11: Измерения производительности образцов со Шпицбергена. Бактериальные коврики были выставлены с зелеными и синими лазерами различной интенсивности лазера и времени экспозиции. Данные окрашены в соответствии с источником длины волны лазера (зеленый и синий). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Калибровки
Существовала линейная корреляция между концентрацией пигмента и интенсивностью флуоресценции после нормализации количества фотонов до времени экспозиции 1 с. Образцы с низкой высотой столбца и низкой концентрацией пигмента привели к завышению целевых пигментов, по сравнению с более высокими высотами столбцов с той же концентрацией пигмента. Кроме того, слабые сигналы флуоресценции требует длительного времени экспозиции для достаточного количества фотонов на датчике. Однако длительное время интеграции также увеличило количество рассеянного света на датчике, что привело к снижению соотношения сигнала к шуму. В своей текущей версии программное обеспечение не может различать шум и сигнал в процессе сокращения данных. Таким образом, низкие измерения интенсивности флуоресценции привели к переоценке пигмента, поскольку шум считался сигналом, полученным из целевых пигментов. Кроме того, интенсивность флуоресценции от более концентрированных пигментных растворов показала большую изменчивость, чем растворы низкой концентрации. Этот эффект можно объяснить процессами поглощения в пигментных растворах, которые использовались для кривой калибровки.

Проверка данных для хлорофилла_{количественной} оценки
После фильтрации образцов льда и снега трехмерные образцы почти появились в виде двухмерного образца на фильтре. Это оправдывало прямое сравнение L.I.F.E (плотность области) и спектрофотометрических данных (объемные измерения).

Набор данных(рисунок 8) указывает на то, что высокая концентрация пигмента приводит к недооценке, в то время как низкая концентрация пигмента приводит к завышению фактического значения. Этот эффект можно объяснить толщиной фильтровального торта и, следовательно, объемным характером образца. Глубина проникновения лазера зависела от оптической плотности и толщины образца. Высокое содержание пигмента было недооценено, потому что лазер не мог вызвать пигментную флуоресценцию в более глубоких слоях. Однако, в тонких тортах фильтра, низкие сигналы флуоресценции были захвачены из-за низкой плотности области пигментов. По-видимому, сам фильтр показал лазерно-индуцированных сигналов после прохождения 450 нм длиннопроходной фильтр(рисунок 12). Этот сигнал был ошибочно засчитан как сигнал флуоресценции, полученный из chl_a. Таким образом, тонкие и слишком толстые фильтры торты трудно измерить с помощью инструмента L.I.F.E.

Рисунок 12: Fluorescence сигналы от толстых (A) и тонких (B) фильтр торты на фильтре GF / F. (A) Самозатевание предотвращает лазерную флуоресценцию из более глубоких слоев, что приводит к недооценке фактической концентрации пигмента. (B) Fluorescence из-за фильтра торт с наложением на фильтр отражения. (C) Сырые данные показывают отражение фильтра (серый). Спектральное свойство лабораторного chl флуоресценции иллюстрируется красным цветом. Шкала бар 45 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Ограничения прототипа L.I.F.E.
Во время сокращения данных закодированное программное обеспечение MATLAB интерпретировало необработанные изображения, подводя итоги пиксельных линий в пределах заданного диапазона длин волн. В текущей версии программного обеспечения не проводится различия между органическими и неорганическими производными сигналами. Наличие нескольких сигналов может привести к завышению фактического содержания пигмента. Длительное время экспозиции из-за низкой интенсивности флуоресценции привело к снижению соотношения сигнала к шуму, способствуя эффекту, как описано выше (см. рисунок 8 и рисунок 12).

Геодовые породы, показанные на рисунке 13, продемонстрировали красный флуоресцентный свет при воздействии зеленым и синим светом. В настоящее время не ясно, является ли флуоресценция результатом минералов или из порфирина на основе молекул. Таким образом, наложение биологических и небиологических сигналов может ограничить применение этого метода и потребовать создания базы данных флуоресценции, специально созданной для прототипа L.I.F.E.

Рисунок 13: Минеральная флуоресценция из геодовой породы, найденной в Ню-Олесунде. Скала была возбуждена с 532 Нм 50 мВт лазера (A) и 405 нм 50 мВт лазера (B). Обе фотографии были сняты с помощью фильтра поляризации, прикрепленного на объективе, что привело к фальсификации фактических цветов флуоресценции. (C) Истинное цветное изображение без использования фильтра поляризации в условиях дневного света. Шкала бар 40 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Баутлер и другие²⁹ пришли к выводу, что характерные спектры выбросов цианобактерий в морских экосистемах зависят от условий окружающей среды. Также метаболическое состояние влияет на флуоресценцию в фототрофических организмах^30. Инструмент L.I.F.E может различать водоросли и цианобактериальную флуоресценцию с помощью библиотек био-отпечатков пальцев, содержащих спектральную информацию о образце, коррелируете с условиями окружающей среды.

В темных адаптированных chl молекул, все центры реакции полноо окислены и доступны для фотохимии и не урожайность флуоресценции угасает³¹. Используя процедуру L.I.F.E., образец сначала возбуждается лазером 532 нм (зеленый), а затем лазером 405 нм (синий). Во время второго возбуждения синим лазером, chl_a может показать снижение реакции флуоресценции из-за предварительного возбуждения зеленым лазером. Chl_a поглощает энергию на длине волны 532 нм, несмотря на ее расстояние от его поглощения максимальной длины волны^32. Перед_{фактическим} хл измерения на 405 нм, зеленый лазер может вызвать фотохимические реакции, активации механизмов закалки в целевых пигментов. Кроме того, предварительное освещение морских фототрофических организмов не привело к изменению кривых спектральной нормы между 450 нм-600 нм, в то время как стандартное отклонение в интенсивности флуоресценции увеличилось на 25%^29. В зависимости от вида, интенсивность флуоресценции даже увеличилась в ответ на предыдущее возбуждение. Эта тема требует дальнейшего изучения.

Применимость
Мы протестировали прибор L.I.F.E. в различных средах обитания с акцентом на криоконитные отверстия. Лазер был успешно применен в почве и биопленки обитания из-за отсутствия окружающего света во время измерения. Криоконит гранулы могут быть измерены, когда осадок слоев заблокирован свет из-под отверстия(Рисунок 14A,C). Тонкие отложенные криоконитовые отверстия проницаемы для бродячего света снизу(рисунок 14B). Бродячий свет мешает измерению. Таким образом, концентрация пигмента в голых ледяных поверхностях пока не поддается измерению при дневном свете. В настоящее время ведутся усилия по обработке сигналов, с тем чтобы обеспечить работу системы в условиях высокой окружающей среды.

Рисунок 14: Криоконитовое отверстие с жидкой водой сверху. (A) Криоконит на леднике с l.I.F.E. трубка объектива. Шкала бар 70 мм. (B) Слой осадка (красный) очень тонкий. Бродячий свет кровоточит через криоконитный слой. (C) Слой осадка достаточно толстый, чтобы блокировать бродячий свет снизу. Этот тип криоконитного отверстия поддается измерению с помощью инструмента L.I.F.E. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

В заключение, наш прибор L.I.F.E. обнаружил фотоавтотрофные организмы в наземных средах обитания, таких как почвы, бактериальные коврики, биопленки, а также в криоконитных отверстиях на ледниковых поверхностях. Молекулы-мишени были chl_a и B-PE. Пространственное разрешение составляло 30 мкм/пхс. Предел обнаружения chl_a составлял 250 пг/мл и 2 нг/мл для B-PE. После лабораторной калибровки мы смогли количественно определить содержание пигмента в образцах, которые были собраны на нашем учебном полигоне в Арктике. Мы применили самозапрограммированное программное обеспечение для автоматизированного процесса сокращения данных. Последствия присутствия минералов и изменяющиеся условия освещения во время измерений требуют дальнейшего изучения.

С потеплением климата повышение температуры приводит к повышению доступности жидкой воды, что приводит к повышению биологической активности на ледяных поверхностях автотрофического и гетеротрофного характера. Следует приложить энергичные усилия для выявления гетеротрофных организмов на месте, чтобы дать полную картину активной жизни в криосфере. Это может быть проверено с другими пигментами цели и соответствующие длины волн лазерного возбуждения. Таким образом, L.I.F.E. обеспечивает подходящую систему мониторинга, обеспечивающую высокое временное и пространственное разрешение для препонных условий в контексте глобальных изменений, а также возможных астробиологических применений.

Авторам нечего раскрывать.

Авторы с благодарностью благодарят полковника (IL) J.N. Pritzker, Фонд Тавани, США, Австрийское федеральное министерство науки, исследований и экономики (Sparkling Science SPA04-149 и SPA05-201), Alpine Forschungsstelle Obergurgl (AFO), Австрийский космический форум ( Роман Эрлер из Hintertuxer Natur Eis Palast, австрийский федеральный менеджер лесного хозяйства и базы Ник Кокс с арктической станции в Ню-Алесунде (Шпицберген). Мы также в долгу перед Сабриной Обвегезер, Кариной Рофер и Фабианом Дрюза за помощь во время съемок. Наконец, мы хотим поблагодарить Джеймса Брэдли за предоставление голоса для сопутствующего видео.