Полу-высокой пропускной адаптации NADH-связанных АТПас анализ для скрининга малых ингибиторы молекулы

Никотинамид аденин динуклеотид (NADH) -связанный анализ ATPase был адаптирован к полувысокой пропускной скрининга малых ингибиторов миозина молекулы. Этот кинетический анализ проводится в формате микроплиты 384 колодца с общими объемами реакции всего 20 Лл на скважину. Платформа должна быть применима практически к любому ферменту ADP.

Ферменты ATPase используют свободную энергию, хранящуюся в аденозинтрифосфате, чтобы катализировать широкий спектр эндергонных биохимических процессов in vivo, которые не будут происходить спонтанно. Эти белки имеют решающее значение для практически всех аспектов клеточной жизни, включая обмен веществ, деление клеток, реакцию на изменения окружающей среды и движение. Протокол, представленный здесь, описывает никотинамид аденин динуклеотид (NADH)-связанный анализ ATPase, который был адаптирован к полувысокой пропускной скрининг абиторы малых молекул АТПасе. Анализ был применен к сердечной и скелетной мышцы миозина II, два актин основе молекулярного двигателя ATPases, в качестве доказательства принципа. Гидролиз АТФ связан с окислением NADH ферментативными реакциями в ходе асссея. Во-первых, ADP, генерируемый ATPase, регенерируется в АТФ пирувате киназой (PK). ПК катализает переход фосфоненолпирувата (PEP) в пируват параллельно. Впоследствии пируват сводится к лактату при лактате дегидрогеназы (ЛДГ), которая катализает окисление NADH параллельно. Таким образом, снижение концентрации АТФ напрямую коррелирует со снижением концентрации NADH, за которым следует изменение внутренней флуоресценции NADH. До тех пор, как PEP доступна в системе реакции, концентрация ADP остается очень низкой, избегая ингибирования фермента ATPase своим собственным продуктом. Кроме того, концентрация АТС остается почти постоянной, что дает линейные временные курсы. Флуоресценция постоянно контролируется, что позволяет легко оценить качество данных и помогает отфильтровывать потенциальные артефакты (например, в результате сложных осадков или тепловых изменений).

Миозины механохимических преобразователей энергии, которые гидролизуют аденозин трифосфат (АТФ) для генерации направленного движения вдоль нитей актина цитоскелета в эукариотах^1,2. Они имеют как структурно, так и кинетически адаптированы к их различных внутриклеточных функций, таких как транспорт органелл, сокращение мышц или генерации цитоскелетного напряжения^1,2. Суперсемейка миозина представлена 40 генами миозина, принадлежащими к классумиосинов No12 в геноме человека 3,⁴. Члены классов миозина играют различные роли в весьма разнообразный набор расстройств, таких как несколько раковых заболеваний, неврологических расстройств, скелетных миопатий, и гипертрофической кардиомиопатии^5,6. Учитывая большое количество физиологических и патологических функций этих молекулярных двигателей, неудивительно, что они становятся все более узнаваемыми в качестве лекарственных мишеней для различных условий⁷. Значительный прогресс был достигнут в последнее время воткрытии новых ингибиторов миозина 8,^9,10 и активаторов¹¹, и для улучшения свойств существующих^{12, 13 Год , 14 Год , 15}.

Никотинамид аденин динуклеотид (NADH)-связанный анализ ATPase уже давно используется для измерения активности ATPase различных ферментов, таких как саркоплазма ретикулум Ca² "насос ATPase¹⁶, РЕПАВ ATPase Rad54¹⁷, AAA ATPase p97¹⁸ или микротрубоум моторный кинезин¹⁹. В ассе используется цикл регенерации АТС. Аденозин дифосфат (ADP), генерируемый АТП, регенерируется аТФ с помощью пирувате киназы (PK), который параллельно преобразует одну молекулу фосфоненолпиррубвата (PEP). Впоследствии пируват е сводится к лактату при лактатной дигидрогеназе (LDH). Это, в свою очередь, окисляет одну молекулу NADH в NAD. Таким образом, снижение концентрации NADH как функции времени равно скорости гидролизу АТФ. Цикл регенерации АТС сохраняет концентрацию АТС почти постоянной, а концентрация ADP на низком уровне до тех пор, пока есть Pep. Это приводит к линейным курсам времени, что делает его простым, чтобы определить начальные показатели реакции и помогает избежать ингибирования продукта ADP¹⁹. Несмотря на то, что анализ ATPase, связанный с NADH, уже был адаптирован к формату 96 скважин^20,высокие объемы реакции (150 л) делают его относительно дорогим из-за высокого спроса на реагенты, что делает его менее поддающимся быстрому скринингу большого количества Соединений. Альтернативные методы, такие как малахит зеленый анализ^19,21, который опирается на обнаружение фосфатов, производимых ферментом ATPase, оказались более подходящими для миниатюризации и высокой пропускной платы скрининга^{22 , 23 , 24}. Однако, конечной точки асссы, скорее всего, будут затронуты несколько артефактов (обсуждается ниже), которые могут оставаться неоткрытыми в отсутствие полный рабочий день курсов.

Здесь анализ NADH-связанных ATPase был оптимизирован для полувысокого скрининга пропускной записи малых ингибиторов молекулы. Скелетные и сердечные мышцы миозина II и ингибиторымиозина blebbistatin 8, para-aminoblebbistatin¹³ и пара-nitroblebbistatin¹² используются для демонстрации силы анализа, который опирается на NADH флуоресценция как считывание. Этот протокол поддается скринингу проектов, ориентированных на любые ADP производства ферментов.

1. Подготовка фондовых растворов и реагентов

1. Подготовка дитиотрейтол (DTT) бульонный раствор путем растворения кристаллического DTT в дистиллированной воде до конечной концентрации 1000 мм. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
2. Подготовьте штучное решение АТС, растворив кристаллический АТС в дистиллированной воде до конечной концентрации 100 мМ. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
3. Подготовка 10x NADH буфер, содержащий 70 мМ 3-(N-морфолино) пропанесульфоновой кислоты (MOPS), 10 мм MgCl₂, 0,9 мМ этилен гликоль-бис (З-аминоэтил эфир)-N, N, N,N-тетраацетической кислоты (EGTA), и 3 мм На. . Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Хранить при 4 градусах по Цельсию.
4. Приготовьте 1x миозинный буфер, содержащий 10 мМ MOPS и 0,1 мм EGTA. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Добавьте бычий сывороточный альбомин (BSA) и DTT до конечной концентрации 0,1% (w/v%) и 1 мМ, соответственно, перед использованием.
5. Подготовка 1x актина буфера, содержащего 4 mM MOPS, 0,1 мМ EGTA, 2 мМ MgCl₂, и 3 мМ NaN₃. Отрегулируйте рН до 7.0 с помощью 1 M NaOH. Хранить при 4 градусах по Цельсию. Добавьте BSA и DTT к конечной концентрации 0,1% (w/v%) и 1 мМ, соответственно, перед использованием.
6. Подготовка nADH фондового раствора путем растворения кристаллического NADH в 10x NADH буфера до конечной концентрации 5,5 мм. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
7. Подготовьте штепситное решение PEP, растворив кристаллический PEP в 10x nADH буфере до конечной концентрации 50 мМ. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
8. Подготовка LDH фондового раствора путем растворения лиофилизированного порошка LDH в смеси глицерола и 10x NADH буфера (50%:50%) до конечной концентрации 2000 U/mL. Centrifuge раствор для удаления любого нерастворенного белка настоящее время (7,197 х г, 20 КК, 10 мин). Тщательно перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
9. Подготовка PK фондовых решение путем растворения лиофилизированного pK порошок в смеси глицерола и 10x NADH буфера (50%:50%) до конечной концентрации 10000 U/mL. Centrifuge раствор для удаления любого нерастворенного белка настоящее время (7,197 х г, 20 КК, 10 мин). Тщательно перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку. Aliquot и хранить при -20 градусах по Цельсию.
10. Восстановите лиофилизированные образцы миозина миозина миозина ii сердечной и скелетной мышц, добавив 100 л дистиллированной воды для получения 10 мг/мл стоковых растворов, соответствующих концентрации миозина в размере 37,9 евро и 40,8 мкм мл. Для получения более подробной информации, см инструкции производителя.
11. Подготовка F-актин из кролика мышечной ацетон порошок, как описано Парди и Spudich²⁵.

2. Измерение активности АТПаз и ингибирующих эффектов малых молекулных ингибиторов

1. Приготовить составную тарелку.
   1. Растворить соединения, представляющие интерес к высококачественным диметилсульфодоксиду (ДМСО).
   2. Создайте пятнадцатиступенчатые серийные 1:2 разбавления, начиная с концентрации соединения 10 мМ в DMSO.
   3. Перенесите образцы на 384-колодую полипропиленовые пластины в триплицяти (по 12,5 л каждый) с помощью многоканальной пипетки. Используйте два ряда на составной пластине для одного соединения (вместо трех столбцов), чтобы свести к минимуму количество скважин, потенциально пострадавших от эффектов края. Используйте последние три скважины во втором ряду для каждого соединения в качестве отрицательного контроля (только DMSO). Не используйте первый и последний ряд на пластине для соединения разбавления.
   4. Передача чистого DMSO в скважины первого ряда (зарезервированы для калибровки NADH).
   5. Используйте последний ряд для положительного контроля.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Пара-аминоблббистатин при концентрации 4 мМ в ДМСО был использован здесь.
2. Приготовьте 4500 л из 20 разбавленного раствора актина для каждой панели анализов (384-ну хорошо черностенная микроплита полистирола) путем разбавления актина в актиневом буфере. Тщательно смешайте раствор, прокладывая вверх и вниз 30x с помощью пипетки 5 мл, чтобы уменьшить вязкость и неоднородность, разбив атинниг. Centrifuge раствор для удаления любого осажденного белка настоящее время (7,197 х г, 20 КС, 10 мин). Аккуратно перенесите супернатант в чистую центрифужную трубку.
3. Подготовка мастер-микс, содержащий ферменты LDH и PK ("ферментная смесь"). Для каждой пластины асссея, объединить 171,4 л раствора LdH, 171,4 л pK раствора и 3189,3 Л или 3252,9 л буфера миозина для анализов с участием сердечной или скелетной мышцы миозина II, соответственно, в 15 мл конической центрифуги трубки. Не добавляйте миозин в этот момент, чтобы избежать агрегации и осадков.
4. Подготовка мастер-микс, содержащий все субстраты ("субстратная смесь"). Для каждой пластины смешайте 162,1 л АТФ, 162,1 л ПЭП и 324,1 л раствора NADH в конической центрифуге 15 мл в трубе конической центрифуги 15 мл. Не добавляйте актин в этот момент, чтобы избежать агрегации и осадков.
5. Создайте семиступенчатые серийные 1:2 разбавления NADH для калибровки, начиная с 250 мкм.
   1. Смешайте 12,3 л бульонного раствора NADH с 257,7 л буфера миозина в микроцентрифуговой трубке объемом 1,5 мл.
   2. Aliquot 135 л буфера миозина в семь микроцентрифуговых труб 1,5 мл.
   3. Перенесите 135 л раствора из первой трубки во вторую и смешайте путем трубачирования. Повторяйте до достижения^7-й трубки.
   4. Используйте последнюю трубку в качестве управления без NADH (только буфер).
6. Используя 8-канальный пипетку, перенесите 20 зликатовых растворов NADH в первый ряд пластины асссея в трипликатах.
7. Добавьте 68 л сердечной или 4,2 л скелетной мышцы миозина II в ферментную смесь. Вихрь кратко.
8. За исключением первого ряда, распределяйте 8,4 л приготовленного миозина-фермента в каждую скважину пластины асссея с помощью автоматизированного дозатора.
9. Перенесите 100 нл растворов из сложной пластины в пластину, содержащую ферментную смесь с помощью автоматизированной системы обработки жидкости, оснащенной головкой пин-инструмента 100 нл.
10. Встряхните тарелку асссея в течение 1 мин при комнатной температуре при температуре 1200 об/мин с помощью микроплитного шейкера.
11. Добавьте 4052 л из центрифуге смутообразного действия в субстратную смесь. Вихрь кратко.
12. Распределить 11,6 л актин-субстрата смесь в каждый колодец пластины ассея (за исключением первого ряда), чтобы начать ферментативную реакцию с помощью автоматизированного дозатора.
13. Встряхните тарелку асссея в течение 1 мин при комнатной температуре при температуре 1200 об/мин с помощью микроплитного шейкера.
14. Центрифуга ассеа пластины на 101 х г для 30 с.
15. Убедитесь, что внутренняя температура считывателя пластин ы стабилизировалась при температуре 25 градусов по Цельсию. Загрузите тарелку и встряхните еще 30 с. Этот шаг встряхивания необходим, чтобы сделать форму жидкой поверхности одинаковой в каждой скважине и позволяет времени для пластины достичь температуры измерения.
16. Запись NADH флуоресценции в течение 30 минут сканирования пластины в 45 с интервалами. Используйте фильтр для возбуждения пропускной способности в 380 нм, 10 нм и 470 нм, 24 нм пропускного моды в сочетании с дихроическим зеркалом на 425 нм. Выполнить измерение в режиме высокой концентрации. Оптимизируйте количество вспышек, увеличение детектора, размеры пластины и высоту измерения перед запуском анализов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Окончательный ассоциатив ные: 300 нМ сердечного/20 нм скелетной мышцы миозин II, 10 мкм актин, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 мкм NADH, 1 ММ ПЭП, 1 мМ АТП в буфере, содержащем 10 мМ ММ MOPS (pH 7.0), 2 мм МГК₂ , 0,15 мМ EGTA, 0,1 мг/мл BSA, 0,5% (v/v) DMSO и 1 мМ DTT. Общий объем составляет 20 л/ну. Самая высокая конечная концентрация соединения составляет 50 км. 20 мкм пара-аминоблббистатин в 0,5% DMSO служит положительным контролем и 0,5% DMSO только отрицательный контроль. Все измерения проводятся в триплицах.

3. Анализ данных

1. Участок наблюдается интенсивность флуоресценции против времени для каждого колодца.
2. Выполните простую линейную регрессию, чтобы определить наклон и перехват флуоресценции ответы для каждого колодца. Склон пропорциональн коэффициенту потребления АТС (NADH), в то время как перехват пропорциональен концентрации NADH в начале измерения (т 0 с).
3. Постройте кривую калибровки для NADH, построив перехваты, полученные для первого ряда пластины, против концентрации NADH. Убедитесь, что перехваты зависят линейно от концентрации NADH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перехваты оценивают реальную интенсивность флуоресценции на т 0 с с гораздо большей уверенностью, чем в среднем интенсивность сырой флуоресценции читается на т з0 с.
4. Выполните простую линейную регрессию, чтобы получить наклон и перехват линии калибровки NADH.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Перехват описывает фоновый сигнал флуоресценции (нет NADH настоящее время), в то время как склон соответствует экстраполированных / теоретической интенсивности флуоресценции 1 M NADH решение в этом конкретном эксперименте.
5. Разделите наклон флуоресценции ответ, полученный для остальной части скважин по склону линии калибровки NADH для преобразования флуоресценции изменения в атлетпотребления.
6. Участок аттестовые нормы потребления против концентрации ингибитора.
7. Для определения ингибирующих констант используйте соответствующее статистическое программное обеспечение, чтобы соответствовать данным доза-ответа к следующему квадратному уравнению, соответствующему простой модели обязательного равновесия один на один:
   
   где Y является скорость потребления АТФ, Y_мин является скорость потребления АТФ Int отсутствие ингибитора, Y_макс является теоретическая норма потребления АТФ на 100% ингибирование, K_I является ингибиторной постоянной , «E»_t и «Я»_т являются общей концентрацией фермента (миозина) и ингибитора, соответственно.

Типичная карта макета пластин, используемая для скрининговых экспериментов, показана на рисунке 1. Первая и последняя строки зарезервированы для калибровки NADH и положительного контроля (20 мкм пара-аминоблббистатин, 0,5% DMSO), соответственно. Остальные строки (B к O) используются для проверки ингибирующей активности соединений. Здесь готовятся и передаются из смежной пластины в тарелку 15-ступенчатые серийные 1:2 (0,5% ДМСО) на пластине асссея. Для получения кривой реакции дозы для одного соединения (48 точек данных/соединения) используются два ряда. Обратите внимание, что карты макета пластин могут быть переработаны для поддержки конкретных целей данного проекта. Например, если цель юаня состояла в том, чтобы получить данные одноточечного скрининга для большого количества соединений, можно было бы протестировать 112 соединений на одной пластине 384 колодца, используя один и тот же макет для положительного контроля и калибровки NADH (расчет с помощью трипликатов для каждого соединения). Всегда рекомендуется иметь как минимум 3 точки данных для одного соединения (или для каждой концентрации) и избегать использования только скважин по краям пластины для одного соединения, так как эти точки данных могут зависеть от эффектов края. Чтобы оценить важность эффектов края, всегда запускайте полную пластину с отрицательным контролем только в первую очередь.

Интенсивность флуоресценции имеет линейную зависимость от концентрации NADH, как показано на рисунке 2A. Склон линейной подгонки используется при анализе данных для преобразования изменений флуоресценции в скорость реакции. Обратите внимание, что необработанный след интенсивности флуоресценции, полученный для каждой скважины калибровки NADH, анализируется сначала путем линейной регрессии (аналогичный анализ показан на рисунке 2B,Cдля сложных данных). Эти следы, как ожидается, покажут экспоненциальный распад с течением времени из-за фотоотбелевания фторофора. Тем не менее, фотоотбеление очень медленно, и поэтому, необработанные данные могут быть проанализированы линейными припадками. Наклон и перехват этих припадков соответствуют начальной скорости фотоотбеления и интенсивности флуоресценции на т 0 с, соответственно. Перехваты этих линейных припадков используются вместо среднего значения сырой флуоресценции, считывающей на уровне т 0 с, чтобы построить кривую калибровки NADH, поскольку перехваты оцениваются на основе большего количества данных и, следовательно, связанные с ними ошибки гораздо меньше.

Рисунок 2B,C показывает, что независимо от используемого миозина или наличия ингибитора, временные курсы линейны в течение времени измерений. Самые высокие (50 мкм) и самые низкие (0 мкм) концентрации ингибитора здесь соответствуют ингибированию 100% и 0% соответственно. Обратите внимание, что из-за объема необработанных данных фактический анализ будет казаться хаотичным, если он будет отображаться на одной панели. Таким образом, эти панели были упрощены, чтобы лучше визуализировать процесс. Среднее значение интенсивности сырой флуоресценции было рассчитано для всех параллельных экспериментов (триплицатов для каждой концентрации) и преобразовано в концентрации NADH здесь. Показано только 3 концентрации ингибиторов. В реальном анализе, каждый сырый след интенсивности флуоресценции (48/compound испытанный) анализируется линейной регрессией сперва, и затем, наклоны преобразовывают сяртами потребления ATP.

Всегда желательно продемонстрировать, что скорость реакции меняется линейно с концентрацией фермента, как показано на рисунке 2D и Рисунок2E для скелетных и сердечных мышц миозина II, соответственно. На основе линейных припадков, окончательная концентрация ассеа фермента может быть легко оценена. Например, для 30-мин.курсы времени рекомендуется частота реакции 5 х 10^-8 мм^.1. Если активатор используется в реакционных смесях (например, актин здесь), рекомендуется проводить эксперименты как в присутствии, так и в отсутствии активатора, чтобы гарантировать наличие ожидаемого эффекта (активации). Условия и процедура должны максимально точно следовать итоговому протоколу. Здесь, разбавления серии миозина был подготовлен в буфере миозина в восьми микроцентрифуговых труб в первую очередь. Впоследствии была добавлена смесь ферментов LDH и PK. Наконец, реакции были начаты путем добавления субстрата смесь каждой трубки параллельно, используя многоканальный пипетки. Реакционные смеси были немедленно перенесены в один ряд асссеевой пластины в триплики. Если актин отсутствовал, вместо него использовался буфер актина. Другие параметры не изменились (см. примечание шага 2.16 в протоколе для условий окончательного ассеа).

На рисунке 2F показаны показатели потребления АТФ, полученные при множественных отрицательных и положительных контрольных реакциях (половина пластины). Эти данные можно сравнить на основе значения кью или "коэффициент акнетии"²⁶, который является широко используемым статистическим параметром для оценки качества высокопроизводительных анализов. Он сравнивает положительный и отрицательный контроль, принимая во внимание как средства, так и стандартные отклонения:

,

где n, _p и n_n,n , _p будут стандартными отклонениями и серединами отрицательного и положительного управления, соответственно. Две популяции хорошо разделены, если значение Кв падает между 0,5 и 1. Получено е0,78 а 0,78 показывает, что результаты этого сажа можно считать отличными²⁶.

Чтобы продемонстрировать, что анализ может быть использован для определения ингибирующих константов, небольшая молекула ингибитора миозина blebbistatin⁸ и два аналога, пара-nitroblebbistatin¹² и пара-аминоблббистатин¹³ имеют был выбран здесь, как показано на рисунке 3A и рисунок 3B. Блеббистатин является неконкурентоспособным, ингибитор аллостерного миозина^27,28. Одна молекула блеббистатина связывается с одной моторной областью миозина и блокирует цикл ATPase путем стабилизации миозина-АДП-фосфатного комплекса^27,28. Таким образом, ингибирующие эффекты производных блеббистатина были смоделированы с использованием простой, один-к-одному связывающей модели здесь (см. шаг 3.7 в протоколе). Обратите внимание, что эта модель может быть неприменима, если уровень потребления СПС непоказал линейную зависимость от концентрации миосина (см. рисунок 2D,E). Сообщается, что кинетическая акветическая растворимость блеббистатина, пара-нитроблбистатина и пара-аминоблббистатинасоставила 426 мкм, 3,6 мкм и 9,3 мкм, соответственно^13. Никаких отклонений в сигнале не наблюдалось ни на уровне, ни ниже заявленных растворимости в наших экспериментах; однако, несколько артефактов появились, когда либо blebbistatin или пара-nitroblebbistatin был использован выше их сообщили значения растворимости, как показано на рисунке 4. Поэтому сигнал, зарегистрированный в концентрациях выше растворимости, был исключен из анализа данных в этих случаях. Пара-аминоблббистатин очень растворим, и поэтому растворимость в этом случае не является ограничивающим фактором.

Наконец, всегда рекомендуется проверить, являются ли ингибирующие эффекты каких-либо положительных хитов являются специфическими для целевого фермента ATPase. В системе совместной реакции используются два других фермента, LDH и PK, и ингибирование одного из них приведет к ложноположительному сигналу. Запуск ассе ассса ATPase с несвязанным ферментом ATPase может помочь отфильтровать эти ложноположительные хиты (для дальнейших рекомендаций, см. обсуждение). Пара-аминоблббистатин и апираз, ат-гидролизный фермент, производящий ADP и неорганический фосфат²⁹, были использованы здесь в качестве примера для демонстрации такого контрольного эксперимента, как показано на рисунке 5.

Рисунок 1 : Планировка пластины. Семиступенчатые серийные 1:2 разбавления NADH, начиная с 250 мкм концентрации, готовятся и затем распределяются в строку А в тройном для калибровки (черный до зеленого градиента цвета). Последние три скважины строки А содержат только буфер миозина (без управления NADH, белый). Последняя строка (P) используется для положительного контроля (20 мкм пара-аминоблббистатин; красный). Типичный эксперимент по реакции на дозу требует двух рядов (например, B и C). Таким образом, 7 экспериментов по реакции на дозу могут проводиться параллельно на одной 384-хорошо пластине (представленной синим и белым градиентами цвета). Каждый образец загружается в виде триплиц. Здесь самые высокие конечные концентрации соединения начинаются от 50 мкм (в 0,5% DMSO). Последние три скважины каждого второго ряда зарезервированы для отрицательного контроля (без соединения, 0,5% Только DMSO; cyan). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 2 : Представитель данных ATPase. (A) Двухкратная серия разбавления NADH была подготовлена и перенесена в первый ряд каждой измерительной пластины. Интенсивность флуоресценции была зафиксирована в течение 30 мин, а исходные данные анализировались с помощью простой линейной регрессии. Перехват каждой регрессионной линии был начертон против концентрации NADH. Обратите внимание, что в идеальном случае интенсивность флуоресценции при т 0 с может быть просто использована для получения линии калибровки. Однако, в то время как необработанные данные о флуоресценции очень шумные, перехваты дают точную оценку интенсивности флуоресценции на 0 с, а связанная с ними стандартная ошибка (показанная как бары ошибок) очень мала. (B,C) Представитель флуоресценции интенсивности следы скелета (B) и сердечной (C) мышцы миозина II ATPase реакции были зарегистрированы в присутствии различных уровней (см. вставки) пара-aminoblebbistatin. Для простоты точки данных и бары ошибок представляют собой среднее значение трех независимых измерений и связанного стандартного отклонения, соответственно. Простая линейная регрессия была выполнена (твердые линии) для получения реакции. Обратите внимание, что типичный эксперимент по доза-реакции состоит из 15 различных концентраций ингибитора и отрицательного контроля в триплицах на измерительной пластине (см. Рисунок1) и линейная регрессия выполняется индивидуально для каждой флуоресценции интенсивность трассировки. Для простоты здесь показано только 3 различных концентраций. (D,E) Базальные (красные) и активизируются (синие) коэффициенты АТПасбыли определены для различных скелетных (D) и сердечных (E ) концентрации миозина II мышц. Коэффициенты ATPase показывают линейную зависимость от концентрации миозина. (F) Положительные (красные) и отрицательные (синие) элементы управления (половина пластины каждый) были запущены параллельно на 384-хорошо assay пластины и -фактор (Я) был рассчитан для оценки качества асса ATPase. Значение 0,78 указывает на надежный анализ с очень хорошо разделенным положительным и отрицательным контролем. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 3 : Кривые дозы-реакции и анализ ингибирующих констант. Сердечные(A ) и скелетные (B) мышцы миозина II были использованы для проверки ингибирующей активности блеббистатина, пара-аминоблббистатина и пара-нитроблбистатина. Ставки ATPase (синий) были получены путем применения простой линейной регрессии к необработанным данным флуоресценции. Бары ошибок представляют собой стандартную ошибку установки и использовались в качестве факторов взвешивания при установке квадратного уравнения (см. шаг 3.7 в протоколе), представляющей простую модель равновесной связывания (красный). Данные, полученные выше растворимости, находились под влиянием артефактов и исключались из анализа. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 4 : Артефакты, связанные с растворити. (A) Флуоресценция интенсивности следов для блеббистатина, полученных в анализе ATPase с использованием скелетной мышцы миозин II показать линейно уменьшающийся сигнал в зависимости от количества ингибитора настоящего (синий). Однако при использовании блеббистатина выше растворимости (50 мкм начальная концентрация блеббистатина) наблюдалось увеличение сигнала (красный), скорее всего, из-за образования ярко флуоресцентных кристаллов блеббистатина¹³. (B) В случае пара-nitroblebbistatin, который является нефлуоресцентным аналогом блеббистатина¹², сырые следы интенсивности флуоресценции появились нормальные (уменьшающиеся). Однако самый высокий уровень торможения был намного ниже, чем ожидалось (на основе положительного контроля). Таким образом, в анализ данных были включены только показатели реакции, полученные ниже растворимости (синий). Скорость реакции, полученная выше растворимости (красная), отличается от определенной кривой доза-реакции (зеленый), так как осадки ограничивают количество (концентрацию) ингибитора, оставшегося в растворе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Рисунок 5 : Ингибиторные эффекты пара- aminoblebbistatin в скелетной мышце миозин II и apyrase ATPase анализы. Пара-аминоблббистатин ингибирует скелетную мышцу миозин II с K_I 1,7 мкм, в то время как не было обнаружено торможение, когда апираза²⁹ была использована в качестве АТПаса в той же паре системы реакции. Этот эксперимент ясно показывает, что пара-аминоблббистатин специфичен для миозина и не подавляет ПК или ЛДГ, таким образом, обнаруженный ингибирующее действие не является артефактом. Апираза была использована при концентрации 0,5 нм. Нет миозина или актина не было, и реакция была выполнена в буфере, содержащем 100 мМ MOPS (pH 7.0), 3 мМ CaCl₂, 2 мМ MgCl₂, 3 мМ NaN₃, 1 мМ DTT, и 0,1% BSA. Никаких других изменений в протокол внесено не было. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Критические шаги в протоколе

Оптимизируйте расположение пластин, запустив несколько пластин только с отрицательным контролем (реакция ATPase без ингибитора). Тщательно проверяйте результаты на наличие закономерностей в темпах реакции. Например, они могут возникнуть в результате краевого эффекта и/или несовершенства в гидрофическом поверхностном покрытии "необязательных" пластин. При наблюдении шаблона измените тип пластины и/или макет пластины, чтобы свести к минимуму артефакты. Например, типичная кривая доза-ответ (16 концентраций с трипликетами, всего 48 баллов) может быть организована в три столбца или два ряда на 384-хорошей пластине. Эти механизмы дают 6 и 4 точки данных, соответственно, которые, вероятно, будут затронуты эффектами краев. Таким образом, расположение строки всегда предпочтительнее.

Модификации и устранение неполадок

Обратите внимание, что наблюдаемые флуоресценции ответы должны быть линейными на протяжении всего времени действия реакции. Нелинейности могут возникнуть в первые несколько минут из-за тепловых изменений или в последние несколько минут из-за достижения равновесия. При наличии нелинейности можно либо скорректировать параметры реакции (например, разбавить миозин, изменить температуру измерения), либо просто ограничить анализ линейной частью данных.

Нелинейности также могут присутствовать в начале реакции, если привязка ингибитора к ферменту ATPase происходит медленно (происходит в течение нескольких минут). В этом случае, реакция, как ожидается, замедляется с течением времени, как фермент-ингибитор комплекса накапливается. Инкубировать асссепластинку перед добавлением субстрата смесь по мере необходимости, чтобы избежать этой проблемы.

Условия асссея должны быть выбраны таким образом, чтобы линейная часть реакций превышала 15 минут. Более короткие линейные детали соответствуют менее полезным точкам данных (Злт;20, так как сканирование всей пластины занимает 45 секунд). Таким образом, линейные приспособления дают менее надежные склоны (скорость реакции) с гораздо более высокими стандартными ошибками. С другой стороны, не рекомендуется получать кинетическое считывание дольше, чем 120 минут. На такие эксперименты могут повлиять денатурация белка или изменение концентрации из-за испарения растворителя. Эти критерии могут быть выполнены наиболее легко путем корректировки концентрации миозина.

Важно обеспечить, чтобы реакции катализируются PK и LDH не являются ограничение медлительности в системе соединенных реакций. Контрольные эксперименты, проводимые без ATPase интереса или на высоком уровне мощного ингибитора ATPase не показали бы никакой (или малой) активности. Однако добавление ADP приведет к быстрому снижению сигнала, если LDH и PK активны и работают правильно. Скорость потребления NADH, как ожидается, будет очень высокой в этом эксперименте по контролю, поэтому очень важно, чтобы начать обнаружение как можно скорее после реакции была инициирована добавлением ADP.

Всегда рекомендуется исключить из анализа данных любые наблюдаемые показатели АТВС, полученные выше растворимости ингибитора. Поскольку растворимость зависит от температуры, чистоты соединения и различий в составе раствора, настоятельно рекомендуется измерять его в условиях, которые сильно похожи на фактические условия (температура, буфер и т.д.) под который проводится ассом ATPase. Попытка использовать небольшие молекулы ингибиторы выше растворимости может привести к осадкам, которые могут повлиять на результаты (см. рисунок 4). Осадки ограничивают концентрацию соединения при растворимости или вблизи нее. Таким образом, показатели ATPase не могут быть снижены за счет добавления большего количества ингибитора. Использование хорошего положительного контроля, который показывает 100% торможение, таким образом, может помочь определить такие аномалии в сигнале, даже если растворимость неизвестна. Большая разница между наблюдаемой скоростью реакции положительного контроля и скоростью реакции, относящейся к максимальному уровню торможения (I_max),определяемой установкой, всегда является хорошим показателем проблемы. Постепенно исключая все больше и больше данных из анализа и / или с использованием положительного контроля, как я_макс и держать его фиксированной в процессе установки, пока лучше подходят рекомендуется в таких случаях. Ингибитор осадков может также привести к сильному рассеянию света, а также может изменить оптические свойства ингибитора, что приводит к аномально высокой наблюдаемой интенсивности сигнала в начале реакций и / или увеличения сигналов с течением времени. Необработанные данные всегда должны быть тщательно проверены, а затронутые концентрации должны быть исключены из анализа.

Ограничения метода

Окончательная концентрация ассса для ATPases с низким числом оборота (например, сердечная мышца миозина II) должна быть высокой (несколько сотен нм) для достижения измеримых скоростей реакции в течение временного окна асссе (30–120 минут). Поэтому, возможно, было бы важно использовать квадратную привязку модели для анализа кривых реакции дозы. Другие привязки моделей (гиперболические, Хилл), как правило, не подходят для анализа таких данных. Кроме того, концентрация ATPase устанавливает более низкий предел диапазона измеримых тормозных констант, потому что кривые реакции дозы становятся неразличимыми на практике из-за наличия экспериментальных ошибок, если K_I близок или меньше, чем концентрации ATPase.

Различия в составных потенций всегда должны быть количественно путем проведения доза-реакции экспериментов и определения ингибирующих констант. Хотя данные одного точечного скрининга отражают эти различия в теории, нелинейность ответов, наряду с экспериментальной ошибкой, крайне затруднит проведение такого анализа. Эксперименты по одноточечному скринингу должны быть разработаны таким образом, чтобы фиксировать даже относительно слабые ингибиторы с высокой уверенностью, выбирая соответствующую концентрацию ингибитора и заранее определенный пороговый уровень реакции, чтобы различать активные и неактивные Соединений.

Установление того, что различия между тормозными константами являются статистически значимыми лучше всего выполнятьпутем перезаписи уравнения для нелинейной регрессии, чтобы определить рК_I (-logK_I) вместо K_I, как pK_I обычно распространяется, в то время как K_I не³⁰. Неопределенность для pK_I симметрична, в то время как она не симметрична для K_I³¹. Доверительные интервалы могут быть рассчитаны для pK_I и t-тест или анализ дисперсии (ANOVA) могут быть использованы для определения, если средства pK_I измерений значительно отличаются. Тем не менее, при выполнении такого статистического теста следует проявлять осторожность, поскольку они предполагают гомосценцию (то же самое отклонение данных в группах). Можно ожидать более высокое отклонение, связанное с pK_I, когда полная кривая ответа дозы не может быть получена из-за сложных проблем растворимости. В этом случае следует использовать другие соответствующие статистические тесты, не предполагающие равных отклонений (например, t-test Уэлча).

Любое соединение, ингибирующее PK или LDH даст ложноположительный сигнал в анализе NADH-связанных ATPase. Некоторые из этих ложных срабатываний можно определить, запустив ассс с несвязанным ADP, производящим фермент. В этом случае, не торможение для реальных положительных хитов можно ожидать, если ингибитор аналог АТФ связывания обоих ферментов. Чтобы продемонстрировать такой анализ, мы провели анализ ATPase с использованием пара-аминоблббистатина и апиразиза, гидролизирующего фермента АТФ, не связанного с миозинами (см. рисунок 5). Кроме того, другой функциональный ассс, характерный для фермента интереса, или другой атпастный ассс, не использующий PK и LDH, может быть запущен, чтобы различать реальные и ложноположительные хиты (например, малахит зеленый отзыв).

Измерение и анализ кинетики интенсивности флуоресценции во всех скважинах требует считывателя пластин достаточно быстро, чтобы сканировать всю пластину менее чем за 90–60 секунд.

Значение метода по отношению к существующим/альтернативным методам

Против "традиционных" абсорбции основе считыватель^{16,17,18,19,20}, модифицированный NADH-связанных ATPase самосср, представленный здесь опирается на NADH флуоресценции. Это делает анализ более чувствительным, позволяя пользователю уменьшить интенсивность возбуждения света и тем самым защитить NADH или ингибиторы от фотохимического разложения.

Хотя анализ, как правило, считается непригодным для обработки большого количества образцов³², небольшие объемы реакции, достигнутые здесь (20 qL) в формате 384-ну хорошо делает его поддается для полу-высокой пропускной проверки приложений, особенно если рассматривается определение ингибирующих констант.

Альтернативные методы обычно опираются на обнаружение неорганического фосфата, вырабатываемого ферментом ATPase. Например, в качестве субстрата для АТП можно использовать « З-32ПЗАТ», а затем высвобожденный неорганический фосфат может быть измерен на основе его радиоактивности. Ассес чувствителен; однако, он требует обработки радиоактивных веществ и остальные АТФ должны быть отделены от неорганического фосфата (например, путем адсорбции АТФ на древесном угле)³³. В вышеупомянутом малахитзеленый асссе, фосфат реагирует с молибдатом в кислых условиях и в результате фосфомолибдат комплекс связывает малахит зеленый краситель вызывает сдвиг в его абсорбции спектра^{19,21, 22,23,24}. Этот метод также требует закалки реакции ATPase; поэтому он в основном используется в качестве конечного асссе, особенно в формате высокой пропускной связи. В отличие от непрерывного мониторинга реакции ATPase в NADH-связанных ассе, конечная точка ассспросто предполагает линейные курсы времени и не может выявить артефакты, ведущие к нелинейности. Соединения, взаимодействующие с малахит зеленым или комплекс формируется также может привести к артефакты²¹. Кроме того, малахит зеленый асссе очень чувствителен к фосфатному загрязнению²⁴. В отличие от этого, NADH-связанный обзор не чувствителен к загрязнению ADP, так как ADP (который всегда присутствует на различных уровнях в образцах АТС) быстро трансформируется в АТС ПК в начале реакции. Нет необходимости в закалке или разделении продуктов. Другой флюорометрический обзор для измерения аТПаса ставки уже разработан путем соединения гидролиз АТФ реакции катализировали нуклеозид фосфорилаза³⁴. Однако, что обзор не использует цикл регенерации СПС, поэтому определение первоначальных показателей реакции может быть гораздо более сложным.

Будущие приложения или направления метода

Многие ферменты, опирающиеся на активность ATPase были изучены в качестве потенциальных целей наркотиков. К ним относятся цитоскелетные моторные белки, принадлежащие к кинезину³⁵ и динеин семейства³⁶ и днк helicases³⁷, все из которых являются терминальными эффекторами в различных сигнальных путей. Описанный здесь асссей может быть легко оптимизирован для проектов по открытию и разработке лекарств, включающих любой фермент, катализирующих реакцию, в которой ADP является продуктом.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана грантом Национального института неврологических расстройств и инсульта и Национального института по злоупотреблению наркотиками NS096833 (CAM).