Uma adaptação semi-high-throughput do ensaio ATPase NADH-acoplado para a seleção de inibidores pequenos da molécula

Um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH) foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de miosina de pequena molécula. Este ensaio cinético é executado em um formato de microplaca de 384 poços com volumes de reação total de apenas 20 μL por poço. A plataforma deve ser aplicável a praticamente qualquer enzima produtora de ADP.

As enzimas ATPase utilizam a energia livre armazenada em trifosfato de adenosina para catalisar uma grande variedade de processos bioquímicos endergônicos in vivo que não ocorreriam espontaneamente. Estas proteínas são cruciais para essencialmente todos os aspectos da vida celular, incluindo o metabolismo, divisão celular, respostas a mudanças ambientais e movimento. O protocolo aqui apresentado descreve um ensaio de ATPase acoplado a nicotinamida adenina dinucleotídeo que foi adaptado à triagem de taxa de transferência semialta de inibidores de ATPase de pequenas moléculas. O ensaio foi aplicado à miosina II do músculo cardíaco e esquelético, dois ATPases motores moleculares à base de actina, como prova de princípio. A hidrólise do ATP é acoplada à oxidação de NADH por reações enzimáticas no ensaio. Primeiramente, o ADP gerado pelo ATPase é regenerado ao ATP pelo piruvato kinase (PK). PK catalisa a transição de fosfoenolpiruvato (PEP) para piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH), que catalisa a oxidação de NADH paralelamente. Assim, a diminuição da concentração de ATP está diretamente correlacionada com a diminuição da concentração de NADH, que se segue da mudança para a fluorescência intrínseca da NADH. Contanto que o PEP esteja disponível no sistema de reação, a concentração de ADP permanece muito baixa, evitando a inibição da enzima ATPase pelo seu próprio produto. Além disso, a concentração de ATP permanece quase constante, produzindo cursos de tempo linear. A fluorescência é monitorada continuamente, o que permite uma fácil estimativa da qualidade dos dados e ajuda a filtrar artefatos potenciais (por exemplo, decorrentes de precipitação composta ou alterações térmicas).

Myosins são transdutores de energia Mecanoquímica que hidrolisam trifosfato de adenosina (ATP) para gerar movimento direcional ao longo dos filamentos do citoesqueleto de actina em eucariontes^1,2. Eles têm tanto estruturalmente e kineticamente adaptados às suas várias funções intracelulares, como o transporte de organelas, contração muscular ou a geração de tensão citoesquelética^1,2. A superfamília da miosina é representada por ~ 40 genes de miosina pertencentes a ~ 12 classes distintas de miosina no genoma humano^3,4. Os membros das classes de miosina desempenham vários papéis em um conjunto altamente diversificado de distúrbios, como vários cânceres, distúrbios neurológicos, miopatias esqueléticas e cardiomiopatia hipertrófica^5,6. Dado o grande número de funções fisiológicas e patológicas destes motores moleculares, não é surpreendente que eles estão se tornando cada vez mais reconhecidos como alvos de drogas para uma variedade de condições⁷. Avanços significativos foram feitos recentemente na descoberta de novos inibidores da miosina^8,9,10 e ativadores¹¹, e para melhorar as propriedades dos já existentes^{12, 13} anos de ^{, 14} anos de ^{, quinze anos}.

A nicotinamida adenina dinucleotídeo (NADH)-acoplado ATPase ensaio tem sido usado para medir a atividade ATPase de várias enzimas, tais como o retículo sarcoplasmático CA^{2 +} bomba ATPase¹⁶, o reparo de DNA ATPase RAD54¹⁷, o AAA + ATPase p97¹⁸ ou o motor microtúnica cinesina¹⁹. O ensaio emprega um ciclo de regeneração ATP. O difosfato de adenosina (ADP) gerado pela ATPase é regenerado para ATP por piruvato quinase (PK), que transforma uma molécula de fosfoenolpiruvato (PEP) em piruvato em paralelo. Subseqüentemente, o piruvato é reduzido ao lactato pelo desidrogenase do lactato (LDH). Isso, por sua vez, oxida uma molécula de NADH a NAD. Portanto, a diminuição da concentração de NADH em função do tempo é igual à taxa de hidrólise do ATP. O ciclo de regeneração ATP mantém a concentração de ATP quase constante e a concentração de ADP baixa, contanto que PEP esteja disponível. Isso resulta em cursos de tempo linear, tornando simples determinar as taxas de reação inicial e ajuda a evitar a inibição do produto pela ADP¹⁹. Embora o ensaio ATPase acoplado ao NADH já tenha sido adaptado a um formato 96-bem²⁰, os volumes de alta reação (~ 150 μL) tornam-se relativamente dispendiosos devido à alta demanda de reagentes, tornando-o menos adequado à rápida triagem de um grande número de Compostos. Métodos alternativos, como o ensaio verde de Malaquita^19,21, que depende da detecção do fosfato produzido pela enzima ATPase, foram comprovados mais adequados para miniaturização e triagem de alta produtividade^{22 , 23} anos de ^{, 24}. no entanto, um ensaio de ponto final é mais susceptível de ser afectado por vários artefactos (discutidos abaixo), que podem continuar a não ser descobertos na ausência de cursos a tempo inteiro.

Aqui, o ensaio ATPase acoplado à NADH foi otimizado para triagem de produção semialta de inibidores de pequenas moléculas. O músculo esquelético e cardíaco miosina II e os inibidores da miosina blebbistatina⁸ , para-aminoblebbistatin¹³ e para-nitroblebbistatin¹² são utilizados para demonstrar o poder do ensaio, que se baseia na NADH fluorescência como uma leitura. Este protocolo é capaz de triagem de projetos focados em qualquer ADP produzindo enzimas.

1. preparação de soluções de estoque e reagentes

1. Prepare a solução de ações ditiotreitol (DTT) dissolvendo a DTT cristalina em água destilada até uma concentração final de 1000 mm. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c.
2. Prepare a solução de estoque ATP dissolvendo ATP cristalino em água destilada para uma concentração final de 100 mM. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Alíquota e armazene a-20 ° c.
3. Prepare 10x NADH tampão contendo 70 mM 3-(N-morpholino) propanesulfonic ácido (MOPS), 10 mM MgCl₂, 0,9 mm etileno glicol-bis (β-aminoetil éter)-n, N, n ′, n′-ácido tetraacético (EGTA), e 3 mm Nan₃. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Conservar a 4 ° c.
4. Prepare o tampão da miosina 1x contendo 10 mM de MOPS e 0,1 mM de EGTA. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Conservar a 4 ° c. Adicionar albumina sérica bovina (BSA) e TDT a uma concentração final de 0,1% (p/v%) e 1 mM, respectivamente, antes da utilização.
5. Prepare 1x tampão de actina contendo 4 mM MOPS, 0,1 mM EGTA, 2 mM MgCl₂e 3 mm Nan₃. Ajuste o pH para 7,0 com solução de NaOH de 1 M. Conservar a 4 ° c. Adicionar BSA e DTT a uma concentração final de 0,1% (w/v%) e 1 mM, respectivamente, antes da utilização.
6. Prepare a solução de estoque de NADH dissolvendo o NADH cristalino no amortecedor de 10x NADH a uma concentração final de 5,5 milímetros. Alíquota e armazene a-20 ° c.
7. Prepare a solução de ações PEP dissolvendo a PEP cristalina no tampão NADH 10x para uma concentração final de 50 mM. Alíquota e armazene a-20 ° c.
8. Prepare a solução de estoque LDH dissolvendo o pó liofilizado de LDH em uma mistura de glicerol e tampão de NADH 10x (50%: 50%) a uma concentração final de 2000 U/mL. Centrifugue a solução para remover qualquer proteína não dissolvida presente (7.197 x g, 20 ° c, 10 min). Transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo com cuidado. Alíquota e armazene a-20 ° c.
9. Prepare a solução de estoque de PK dissolvendo pó de PK liofilizado em uma mistura de glicerol e tampão de NADH 10x (50%: 50%) a uma concentração final de 10000 U/mL. Centrifugue a solução para remover qualquer proteína não dissolvida presente (7.197 x g, 20 ° c, 10 min). Transfira o sobrenadante para um tubo de centrifugação limpo com cuidado. Alíquota e armazene a-20 ° c.
10. Reconstituir as amostras de miosina II do músculo cardíaco e esquelético liofilizado, adicionando 100 μL de água destilada para obter 10 mg/mL de soluções de ações correspondentes a ~ 37,9 μM e ~ 40,8 μM concentrações de miosina (monomérica), respectivamente. Para obter mais detalhes, consulte as instruções do fabricante.
11. Prepare o F-Actin do pó do acetona do músculo de coelho como descrito por Pardee e por Spudich²⁵.

2. medir atividades de ATPase e efeitos inibitórios de inibidores de pequenas moléculas

1. Prepare a placa composta.
   1. Dissolva os compostos de interesse em Dimetilsulfóxido de alta qualidade (DMSO).
   2. Crie diluições de série 1:2 de quinze passos a partir de concentração composta de 10 mM em DMSO.
   3. Transfira as amostras para uma placa de polipropileno de 384 poços em triplicados (12,5 μL cada) utilizando uma pipeta multicanal. Use duas linhas na placa composta para um composto (em vez de três colunas) para minimizar o número de poços potencialmente afetados por efeitos de borda. Use os três últimos poços na segunda linha para cada composto como controle negativo (somente DMSO). Não utilize a primeira e a última linha da placa para diluições compostas.
   4. Transfira DMSO puro para os poços da primeira linha (reservado para calibração NADH).
   5. Use a última linha para controle positivo.
      Nota: para-aminoblebbistatin na concentração de 4 milímetros no DMSO foi usado aqui.
2. Prepare 4500 μL de solução de actina diluída de 20 μM para cada placa de ensaio (microplaca de poliestireno de parede preta de 384 poços), diluindo a solução de actina em tampão de actina. Misture a solução completamente pipetando para cima e para baixo 30x usando uma pipeta de 5 mL para reduzir a viscosidade e a heterogeneidade quebrando filamentos de actina. Centrifugue a solução para remover qualquer proteína precipitada presente (7.197 x g, 20 ° c, 10 min). Transfira com cuidado o sobrenadante em um tubo de centrifugação limpo.
3. Prepare a mistura mestra contendo enzimas LDH e PK ("mistura enzimática"). Para cada placa de ensaio, combine 171,4 μL de solução de LDH, 171,4 μL de solução de PK e 3189,3 μL ou 3252,9 μL de tampão de miosina para ensaios envolvendo a miosina II do músculo cardíaco ou esquelético, respectivamente, em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Não adicione qualquer miosina neste ponto para evitar a agregação e precipitação.
4. Prepare a mistura mestra contendo todos os substratos ("mix de substrato"). Para cada placa, combine 162,1 μL de ATP, 162,1 μL de PEP e 324,1 μL de solução de NADH em um tubo de centrífuga cônico de 15 mL. Não adicione actina neste ponto para evitar a agregação e precipitação.
5. Crie diluições de série 1:2 de sete etapas de NADH para calibração a partir de 250 μM.
   1. Misture 12,3 μL de solução de estoque de NADH com 257,7 μL de tampão de miosina em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
   2. Alíquota 135 μL de tampão de miosina em sete tubos de microcentrífuga de 1,5 mL.
   3. Transferir 135 μL de solução do primeiro tubo para o segundo e misturar com pipetagem. Repita até chegar ao tubo de 7^º .
   4. Use o último tubo como controle no-NADH (somente buffer).
6. Utilizando uma pipeta de 8 canais, transfira 20 μL das soluções de calibração NADH para a primeira linha da placa de ensaio em triplicados.
7. Adicionar 68 μL de μL cardíacos ou 4,2 de miosina do músculo esquelético II à mistura enzimática. Vortex brevemente.
8. Exceto a primeira linha, dispense 8,4 μL da mistura de miosina-enzima preparada em cada poço da placa de ensaio usando um dispensador automatizado.
9. Transfira 100 nL de soluções da placa composta para a placa de ensaio contendo mistura enzimática utilizando um sistema automatizado de manuseio de líquidos equipado com uma cabeça de ferramenta de pino de 100 nL.
10. Agitar a placa de ensaio durante 1 min à temperatura ambiente a 1200 RPM utilizando um agitador de microplacas.
11. Adicionar 4.052 μL da solução de actina centrifugada à mistura de substrato. Vortex brevemente.
12. Dispense 11,6 μL de mistura de substrato de actina em cada poço da placa de ensaio (excepto a primeira linha) para iniciar a reacção enzimática utilizando um dispensador automatizado.
13. Agitar a placa de ensaio durante 1 min à temperatura ambiente a 1200 RPM utilizando um agitador de microplacas.
14. Centrifugue a placa de ensaio a 101 x g durante 30 s.
15. Certifique-se de que a temperatura interna do leitor de placas foi estabilizada a 25 ° c. Carregar a placa e agitar por mais 30 s. Esta etapa de agitação é necessária para fazer a forma da superfície líquida similar em cada poço e permite o tempo para que a placa alcangue a temperatura da medida.
16. Grave a fluorescência NADH durante 30 minutos de digitalização da placa em intervalos de 45 s. Use um 380 Nm, filtro de excitação de largura de banda de 10 nm e um 470 nm, filtro de emissão de largura de banda de 24 nm em conjunto com um espelho de corte de 425 nm dichroic. Execute a medição no modo de alta concentração. Otimize o número de flashes, ganho do detector, dimensões da chapa e altura da medição antes de executar os ensaios.
    Nota: as condições finais do ensaio são 300 nM cardíaco/20 nM músculo esquelético miosina II, 10 μM de actina, 40 U/mL LDH, 200 U/mL PK, 220 μM NADH, 1 mM PEP, 1 mM ATP em um tampão contendo 10 mM MOPS (pH = 7,0), 2 mM MgCl₂ , 0,15 mM EGTA, 0,1 mg/mL BSA, 0,5% (v/v) DMSO e 1 mM DTT. O volume total é de 20 μL/poço. A concentração final mais elevada do composto é 50 μM. 20 μM para-aminoblebbistatin em 0,5% DMSO serve como o controle positivo e 0,5% DMSO sozinho é o controle negativo. Todas as medições são realizadas em triplicates.

3. analisando dados

1. Plotar a intensidade de fluorescência observada contra o tempo para cada poço.
2. Realize uma regressão linear simples para determinar a inclinação e o intercepto das respostas de fluorescência para cada poço. A inclinação é proporcional à taxa de consumo de ATP (NADH), enquanto o intercepto é proporcional à concentração de NADH no início da medição (t = 0 s).
3. Construa uma curva de calibração para NADH traçando as Interceptas obtidas para a primeira linha da placa contra a concentração de NADH. Certifique-se de que as Interceptas dependem linearmente sobre a concentração de NADH.
   Nota: as Interceptas estimam as intensidades de fluorescência reais em t = 0 s com muito mais confiança do que a média da intensidade da fluorescência bruta lê-se em t ≈ 0 s.
4. Realize uma regressão linear simples para obter a inclinação e o intercepto da linha de calibração NADH.
   Nota: o intercepto descreve o sinal do fundo da fluorescência (nenhum NADH atual), quando a inclinação corresponder à intensidade extrapolada/teórica da fluorescência de uma solução de 1 M NADH nesse experimento particular.
5. Divida a inclinação da resposta da fluorescência obtida para o descanso dos poços pela inclinação da linha da calibração de NADH para converter mudanças da fluorescência às taxas de consumo do ATP.
6. Plotar as taxas de consumo de ATP contra a concentração do inibidor.
7. Para determinar as constantes inibitórias, use o software estatístico apropriado para ajustar os dados da dose-resposta à seguinte equação quadrática correspondente a um modelo de equilíbrio de ligação um-para-um simples:
   
   onde y é a taxa de consumo de ATP, y_min é a taxa de consumo de ATP int a ausência de inibidor, y_Max é a taxa de consumo teórico de ATP a 100% de inibição, K_I é a constante inibitória , [E]_t e [I]_t são a concentração total da enzima (miosina) e o inibidor, respectivamente.

O mapa de layout de placa típico usado para experimentos de triagem é mostrado na Figura 1. As primeiras e as últimas fileiras são reservadas para a calibração de NADH e o controle positivo (20 μM para-aminoblebbistatin, 0,5% DMSO), respectivamente. As linhas restantes (B a O) são usadas para testar a atividade inibitória de compostos. Aqui, as diluições de série 1:2 de quinze passos que partem da concentração composta de 10 mM no DMSO são preparadas e transferidas da placa composta para a placa de ensaio, de modo que a maior concentração final de compostos seja de 50 μM (em 0,5% DMSO) na placa de ensaio. Duas linhas são usadas para obter uma curva de dose-resposta para um composto (48 DataPoints/Compound). Observe que os mapas de layout da placa podem ser reprojetados para suportar os objetivos específicos de um determinado projeto. Por exemplo, se o objetivo fosse obter dados de triagem de ponto único para um grande número de compostos, poderia-se testar 112 compostos em uma única placa de 384 poços usando o mesmo layout para controle positivo e calibração de NADH (calculando com triplicados para cada composto). É sempre aconselhável ter um mínimo de 3 pontos dados para um composto (ou para cada concentração) e para evitar usar apenas os poços ao longo das bordas da placa para um composto, como estes pontos dados podem ser influenciados por efeitos de borda. Para estimar a importância dos efeitos de aresta, sempre execute uma placa completa com controle negativo apenas primeiro.

As intensidades de fluorescência têm uma dependência linear na concentração de NADH, como mostrado na Figura 2a. A inclinação do ajuste linear é usada durante a análise de dados para converter alterações de fluorescência em taxas de reação. Observe que o traço de intensidade de fluorescência bruta obtido para cada poço da calibração de NADH é analisado pela regressão linear primeiro (uma análise semelhante é mostrada na Figura 2b, C para dados compostos). Estes traços são esperados mostrar a deterioração exponencial sobre o tempo devido ao photobranqueamento do fluorophore. No entanto, o fotobranqueamento é muito lento e, portanto, os dados brutos podem ser analisados por ajustes lineares. A inclinação e o intercepto desses ajustes correspondem à taxa inicial de fotobranqueamento e à intensidade de fluorescência em t = 0 s, respectivamente. Os interceptos destes ajustes lineares são usados em vez da média da fluorescência crua lê em t = 0 s para construir a curva de calibração NADH porque os interceptos são estimados com base em mais dados e, portanto, os erros associados são muito menores.

A Figura 2b,C demonstra que, independentemente da miosina utilizada ou da presença do inibidor, os cursos de tempo são lineares na janela temporal das medições. As concentrações mais elevadas (50 μM) e mais baixas (0 μM) do inibidor correspondem a ~ 100% e 0% de inibição, respetivamente. Observe que, devido à quantidade de dados brutos, a análise real apareceria caótica se mostrada em um único painel. Portanto, esses painéis foram simplificados para melhor Visualizar o processo. A média das leituras da intensidade de fluorescência bruta foi calculada para todos os experimentos paralelos (triplicados para cada concentração) e convertido em concentrações de NADH aqui. Apenas 3 concentrações de inibidores são mostradas. Na análise real, cada traço de intensidade de fluorescência bruta (48/composto testado) é analisado pela regressão linear primeiro e, posteriormente, as inclinações são convertidas em taxas de consumo de ATP.

É sempre aconselhável demonstrar que as taxas de reação mudam linearmente com a concentração enzimática, como mostra a Figura 2D e a Figura2e para a miosina II do músculo esquelético e cardíaco, respectivamente. Com base nos ajustes lineares, a concentração final do ensaio da enzima pode ser facilmente estimada. Por exemplo, uma taxa de reação de ~ 5 x 10^-8 MS^-1 é recomendada para cursos de tempo de 30 min. Se um ativador é usado nas misturas de reação (como a actina aqui), recomenda-se executar os experimentos tanto na presença e ausência do ativador para garantir que o efeito esperado (ativação) esteja presente. As condições e o procedimento devem seguir o protocolo final o mais próximo possível. Aqui, uma série da diluição do miosina foi preparada no amortecedor da miosina em oito tubos do microcentrifugador primeiramente. Posteriormente, foram adicionadas uma mistura de enzimas LDH e PK. Finalmente, as reações foram iniciadas adicionando a mistura de substrato para cada tubo em paralelo, usando uma pipeta multicanal. As misturas da reação foram transferidas imediatamente a uma fileira da placa do ensaio nos triplicates. Se o actina estava ausente, o tampão do actina foi usado preferivelmente. Não foram alterados outros parâmetros (ver a nota da etapa 2,16 no protocolo para as condições finais do ensaio).

A Figura 2F mostra as taxas de consumo de ATP obtidas para múltiplas reações de controle negativas e positivas (meia placa cada). Esses dados podem ser comparados com base no valor de Z ou "coeficiente de janela de triagem"²⁶, que é um parâmetro estatístico amplamente utilizado para estimar a qualidade dos ensaios de alta taxa de transferência. Compara os controlos positivos e negativos, tendo em conta os meios e os desvios-padrão:

,

onde σ_n, σ_p e μ_n, μ_p são os desvios-padrão e os meios dos controles negativos e positivos, respectivamente. As duas populações são bem separadas se o valor de Z ' cai entre 0,5 e 1. A Z ' = 0,78 obtido aqui mostra que o ensaio pode ser considerado como excelente²⁶.

Para demonstrar que o ensaio pode ser utilizado para determinar constantes inibitórias, a pequena molécula inibidor da miosina blebbistatina⁸ e dois análogos, para-nitroblebbistatin¹² e para-aminoblebbistatin¹³ têm foram escolhidos aqui, como mostra a Figura 3a e a Figura 3B. A blebbistatina é um inibidor da miosina incompetitivo e alostênico^27,28. Uma molécula de blebbistatina liga-se a um domínio motor da miosina e bloqueia o ciclo da ATPase estabilizando o complexo miosina-ADP-fosfato^27,28. Portanto, os efeitos inibitórios dos derivados da blebbistatina foram modelados usando um modelo de ligação simples, um-para-um aqui (ver passo 3,7 no protocolo). Note que este modelo pode não ter sido aplicável se as taxas de consumo de ATP não tivessem demonstrado dependência linear na concentração de miosina (ver Figura 2D,E). A solubilidade aquosa cinética de blebbistatina, para -nitroblebbistatin e para-aminoblebbistatin tem sido relatada como sendo 426 μm, 3,6 μm e 9,3 μm, respectivamente¹³. Nenhuma anomalia no sinal foi observada ou abaixo das solubilidades relatadas em nossos experimentos; no entanto, vários artefatos apareceram quando a blebbistatina ou para-nitroblebbistatina foi usada acima de seus valores de solubilidade relatados, como mostrado na Figura 4. Portanto, o sinal registrado em concentrações superiores à solubilidade foi excluído da análise dos dados nesses casos. Para-aminoblebbistatin é altamente solúvel e, portanto, a solubilidade não foi um fator limitante nesse caso.

Finalmente, recomenda-se sempre testar se os efeitos inibitórios de quaisquer acertos positivos são específicos para a enzima ATPase alvo. O sistema de reação acoplada emprega duas outras enzimas, LDH e PK, e a inibição de um deles resultaria em um sinal falso positivo. Executar o ensaio ATPase com uma enzima ATPase não relacionada pode ajudar a filtrar esses acertos falsos positivos (para obter mais recomendações, consulte a discussão). Para-aminoblebbistatin e apyrase, enzima hidrolisada ATP produtora de ADP e fosfato inorgânico²⁹, foram utilizadas aqui como exemplo para demonstrar tal experimento de controle, como mostra a Figura 5.

Figura 1 : Layout da placa de ensaio. As diluições de série 1:2 de sete etapas de NADH que partem da concentração de 250 μm são preparadas e dispensadas subseqüentemente na fileira a no triplicado para a calibração (preto ao inclinação da cor verde). Os últimos três poços da linha A contêm somente o buffer de miosina (sem controle NADH, branco). A última linha (P) é usada para o controle positivo (20 μM para-aminoblebbistatin; vermelho). Um experimento de dose-resposta típica requer duas linhas (por exemplo, B e C). Portanto, 7 experimentos de dose-resposta podem ser executados em paralelo em uma única placa de 384 poços (representada por gradientes de cor azul a branco). Cada amostra é carregada como triplicates. Aqui, as concentrações de compostos finais mais elevadas começam em 50 μM (em 0,5% DMSO). Os últimos três poços de cada segunda fileira são reservados para o controle negativo (nenhum composto, 0,5% DMSO somente; ciano). Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2 : Dados representativos de ATPase. (A) uma série de diluição dupla de NADH foi preparada e transferida para a primeira fileira de cada placa de medição. A intensidade da fluorescência foi registrada por 30 min e os dados brutos foram analisados por regressão linear simples. O intercepto de cada linha de regressão foi plotado contra a concentração de NADH. Note que em um caso ideal, a intensidade da fluorescência em t = 0 s poderia simplesmente ser usada para obter a linha de calibração. Entretanto, quando os dados crus da fluorescência forem muito ruidosos, os interceptos dão uma estimativa exata da intensidade da fluorescência em t = 0 s e seu erro padrão associado (mostrado como barras do erro) é muito pequeno. (B,C) Os traços representativos da intensidade da fluorescência das reações esqueletais (B) e cardíacas (C) do músculo miosina II ATPase foram gravados na presença de vários níveis (veja Insets) do para-aminoblebbistatin. Para simplificar, os pontos de dados e as barras de erro representam a média de três medições independentes e o desvio padrão associado, respectivamente. Foi realizada regressão linear simples (linhas sólidas) para obtenção de taxas de reação. Note-se que um experimento de dose-resposta típica é composto por 15 diferentes concentrações de inibidores e controle negativo em triplicados na placa de medida (ver Figura 1) e a regressão linear é realizada individualmente para cada fluorescência traço de intensidade. Para simplificar, apenas 3 concentrações diferentes são mostradas aqui. (D,E) As taxas de ATPase basal (vermelha) e actina-ativadas (azul) foram determinadas para as várias concentrações esqueléticas (D) e cardíacas (e) do músculo miosina II. As taxas de ATPase mostram dependência linear na concentração de miosina. (F) os controles positivos (vermelho) e negativos (azul) (meia placa cada) foram executados paralelamente em uma placa de ensaio de 384 poços e o z-factor (z ') foi calculado para avaliar a qualidade do ensaio de ATPase. O valor de a Z de 0,78 indica um ensaio fiável com controlos positivos e negativos muito bem separados. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3 : Curvas dose-resposta e análise de constantes inibitórias. Foram utilizados para testar a atividade inibitória de blebbistatina, para-aminoblebbistatina e para-nitroblebbistatina (a) ea miosina II do músculo esquelético (B). As taxas de ATPase (azul) foram obtidas aplicando-se regressão linear simples aos dados brutos de fluorescência. As barras de erro representam o erro padrão do encaixe e foram usadas como fatores de ponderação durante a montagem de uma equação quadrática (ver etapa 3,7 no protocolo) representando um modelo de ligação de equilíbrio simples (vermelho). Os dados obtidos acima da solubilidade foram influenciados por artefatos e excluídos da análise. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4 : Artefatos relacionados à solubilidade. (A) traços de intensidade de fluorescência para blebbistatina obtidos em um ensaio de ATPase usando a miosina do músculo esquelético II mostram sinal de diminuição linear, dependendo da quantidade de inibidor presente (azul). No entanto, quando a blebbistatina foi usada acima da solubilidade (50 μM de concentração inicial de blebbistatina), observou-se um aumento no sinal (vermelho), provavelmente devido à formação de cristais de blebbistatina fluorescentes brilhantes¹³. (B) no caso do para-nitroblebbistatin, que é um análogo não-fluorescente da blebbistatina¹², os traços crus da intensidade da fluorescência pareceram normais (diminuindo). No entanto, o maior nível de inibição foi muito menor do que o esperado (com base no controle positivo). Portanto, apenas as taxas de reação obtidas abaixo da solubilidade (azul) foram incluídas na análise dos dados. As taxas de reação obtidas acima da solubilidade (vermelha) divergem da curva de dose-resposta determinada (verde), à medida que a precipitação limita a quantidade (concentração) do inibidor remanescente em solução. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5 : Efeitos inibitórios da para- aminoblebbistatin nos ensaios do miosina II e do Apirase do músculo esqueletal do ATPase. Para-aminoblebbistatin inibiu a miosina II do músculo esqueletal com um K_I de 1,7 μm, quando nenhuma inibição foi detectada quando o Apirase²⁹ foi usado como um ATPase no mesmo sistema acoplado da reação. Esta experiência demonstra claramente que para -aminoblebbistatin é específico ao miosina e não inibe o PK ou o LDH, assim o efeito inibidor detectado não é um artefato. A apyrase foi utilizada na concentração de 0,5 nM. Nenhuma miosina ou actina estava presente, e a reação foi realizada em um tampão contendo 100 mM de MOPS (pH = 7,0), 3 mM CaCl₂, 2 mm MgCl_2,3mm Nan₃, 1 mm DTT e 0,1% BSA. Nenhuma outra modificação foi feita ao protocolo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Etapas críticas no protocolo

Otimize o layout da placa executando várias placas com controle negativo somente (reação de ATPase sem inibidor). Inspecione os resultados cuidadosamente para padrões em taxas de reação. Por exemplo, estes podem surgir de efeitos de aresta e/ou imperfeições no revestimento de superfície hidrófilo de placas "não vinculantes". Se um padrão for observado, mude o tipo de chapa e/ou o layout da placa para minimizar os artefatos. Por exemplo, uma curva de dose-resposta típica (16 concentrações com triplicates, 48 pontos totais) pode ser arranjada em três colunas ou duas fileiras em uma placa 384-well. Esses arranjos produzem 6 e 4 DataPoints, respectivamente, que provavelmente são afetados por efeitos de aresta. Portanto, a disposição da linha é sempre preferida.

Modificações e solução de problemas

Note-se que as respostas de fluorescência observadas devem ser lineares durante todo o tempo completo da reacção. As não-linearidades podem ocorrer nos primeiros minutos devido a alterações térmicas ou nos últimos minutos devido ao equilíbrio de alcance. Se as não-linearidades estiverem presentes, pode-se ajustar os parâmetros de reação (por exemplo, diluir a miosina, alterar a temperatura de medição) ou simplesmente limitar a análise à parte linear dos dados.

As não-linearidades também podem estar presentes no início das reações se a ligação do inibidor à enzima ATPase for lenta (ocorrendo ao longo de minutos). Neste caso, a reação é esperada para retardar ao longo do tempo como o complexo enzima-inibidor se acumula. Incubar a placa de ensaio antes de adicionar a mistura de substrato conforme necessário para evitar este problema.

As condições do ensaio devem ser escolhidas de modo a que a parte linear das reacções seja superior a 15 minutos. As peças lineares mais curtas correspondem aos pontos dados menos úteis (< 20, porque a exploração da placa inteira toma ~ 45 segundos). Portanto, os ajustes lineares produzem inclinações menos confiáveis (taxas de reação) com erros padrão muito mais elevados. Por outro lado, não se recomenda a obtenção de leituras cinéticas maiores que ~ 120 minutos. Tais experimentos podem ser afetados por desnaturação de proteínas ou mudanças de concentração devido à evaporação do solvente. Estes critérios podem ser cumpridos mais facilmente ajustando a concentração da miosina.

É importante garantir que as reações catalisadas por PK e LDH não são limitantes de taxa no sistema de reação acoplada. Os experimentos de controle realizados sem a ATPase de interesse ou em altos níveis de um potente inibidor da ATPase mostrariam nenhuma (ou pouca) atividade. No entanto, a adição de ADP resultaria em uma redução rápida do sinal se LDH e PK estiverem ativos e funcionarem corretamente. A taxa de consumo de NADH é esperada ser muito elevada neste experimento de controle, por isso é crucial para iniciar a detecção o mais rapidamente possível após a reação foi iniciada pela adição de ADP.

Recomenda-se sempre excluir todas as taxas observadas de ATPase obtidas acima da solubilidade do inibidor a partir da análise dos dados. Como a solubilidade depende da temperatura, pureza do composto, e as diferenças na composição da solução, é altamente recomendável para medi-lo em condições que são altamente semelhantes às condições reais (temperatura, tampão, etc.) que o ensaio ATPase é realizado. A tentativa de usar inibidores de pequenas moléculas acima da solubilidade pode resultar em precipitação que pode influenciar os resultados (ver Figura 4). A precipitação limita a concentração do composto em ou perto de solubilidade. Portanto, as taxas de ATPase não podem ser reduzidas mais adicionando mais inibidor. Usando um bom controle positivo que mostra a inibição de ~ 100%, conseqüentemente, pode ajudar a identificar tais anomalias no sinal, mesmo se a solubilidade é desconhecida. Uma grande diferença entre a taxa de reação observada do controle positivo e a taxa de reação pertencente ao nível máximo de inibição (I_máx.) determinada pelo encaixe é sempre uma boa indicação do problema. Gradualmente, excluindo mais e mais dados da análise e/ou usando o controle positivo como eu_Max e mantê-lo fixado durante o processo de montagem até que um melhor ajuste é obtido é recomendado em tais casos. A precipitação do inibidor também pode resultar em forte espalhamento de luz e também pode alterar as propriedades ópticas do inibidor, levando a intensidades de sinal anormalmente elevadas observadas no início das reações e/ou aumentando os sinais ao longo do tempo. Os dados brutos devem ser sempre cuidadosamente inspecionados e as concentrações afetadas devem ser excluídas da análise.

Limitações do método

A concentração final do ensaio para atpases com um número baixo do retorno (por exemplo, miosina do músculo cardíaco II) deve ser elevada (diverso cem nanômetro) para conseguir taxas de reação mensuráveis dentro da janela de tempo do ensaio (30 − 120 minutos). Portanto, pode ser importante usar o modelo de ligação quadrática para a análise das curvas dose-resposta. Outros modelos de ligação (hyperbolic, Hill) normalmente não são adequados para a análise de tais dados. Além disso, a concentração do ATPase ajusta um limite mais baixo à escala de constantes inibitórias mensuráveis porque as curvas da resposta de dose começ indistinguíveis na prática devido à presença de erros experimentais se o K_I é próximo ou menos do que o concentração da ATPase.

As diferenças nas potências compostas devem sempre ser quantificadas realizando experimentos de dose-resposta e determinando as constantes inibitórias. Embora os dados de triagem de ponto único reflita essas diferenças na teoria, a não-linearidade das respostas, juntamente com o erro experimental, dificultaria muito a realização dessa análise. Experimentos de triagem de ponto único devem ser projetados para capturar até mesmo os inibidores relativamente fracos com alta confiança, escolhendo uma concentração de inibidor adequado e um nível de resposta de limiar pré-definido para distinguir entre ativos e inativos Compostos.

Estabelecer que as diferenças entre as constantes inibitórias são estatisticamente significantes é melhor realizada por re-escrever a equação para regressão não-linear para determinar pK_i (-logk_i) em vez de K_i, como PK_i é normalmente distribuídos, enquanto K_I não é³⁰. A incerteza para pK_i é simétrica, enquanto não é simétrica para K_i³¹. Os intervalos de confiança podem ser calculados para o teste de pK_i e t ou análise de VARIÂNCIA (ANOVA) pode ser usado para determinar se as médias das medições de PK_i são significativamente diferentes. No entanto, deve-se ter cautela ao realizar esse teste estatístico, pois eles assumem homocedasticidade (mesma variância de dados em grupos). Pode-se esperar uma maior variância associada com pK_I quando uma curva de dose-resposta completa não pode ser obtida devido a problemas de solubilidade compostos. Neste caso, devem ser utilizados outros testes estatísticos adequados que não assumirem variâncias iguais (por exemplo, teste t de Welch).

Qualquer composto que inibe a PK ou LDH daria um sinal falso positivo no ensaio ATPase acoplado à NADH. Alguns desses falsos positivos podem ser identificados por meio da execução do ensaio com uma enzima produtora de ADP não relacionada. Neste caso, nenhuma inibição para acertos positivos reais pode ser esperada, a menos que o inibidor é uma ligação analógica ATP para ambas as enzimas. Para demonstrar tal análise, realizamos um ensaio de ATPase usando para-aminoblebbistatin e apyrase, uma enzima HIDROLISANTE ATP não relacionada a miosinas (ver Figura 5). Alternativamente, um ensaio funcional diferente específico para a enzima de interesse, ou um ensaio ATPase diferente não empregando PK e LDH pode ser executado para distinguir entre acertos reais e falsos positivos (por exemplo, o ensaio de malaquita verde).

A medida e a análise da cinética da intensidade da fluorescência em todos os poços exigem um leitor da placa rapidamente bastante digitalizar a placa inteira em menos do que ~ 90 − 60 segundos.

Significância do método em relação aos métodos existentes/alternativos

Oposto ao leitura "tradicional" baseado na absorvência¹⁶,^17,18,¹⁹,²⁰, o ensaio de ATPase acoplado NADH modificado aqui apresentado confia na fluorescência de NADH. Isso torna o ensaio mais sensível, permitindo ao usuário reduzir a intensidade da luz de excitação e, assim, proteger NADH ou os inibidores contra a decomposição fotoquímica.

Embora o ensaio tenha sido geralmente considerado como não adequado para o manuseio de grande número de amostras³², os pequenos volumes de reação alcançados aqui (20 μL) em um formato 384-well o tornam propício para aplicações de triagem de throughput semialto, especialmente se a determinação de constantes inibitórias for considerada.

Métodos alternativos geralmente dependem da detecção do fosfato inorgânico produzido pela enzima ATPase. Por exemplo, [γ-32P] ATP pode ser usado como um substrato para a ATPase e, subsequentemente, o fosfato inorgânico liberado pode ser medido com base em sua radioatividade. O ensaio é sensível; no entanto, requer o manuseio de substâncias radioativas e a ATP remanescente deve ser separada do fosfato inorgânico (por exemplo, pela adsorção de ATP em carvão vegetal)³³. No ensaio verde malaquita acima mencionado, o fosfato reage com molibdato condições ácidas e o complexo de foshomolisbdata resultante vincula o corante verde malaquita causando uma mudança em seu espectro de absorção^{19,21, 22,23,24}. Este método também requer a têmpera da reação ATPase; Conseqüentemente, é usado na maior parte como um ponto final-ensaio, especial no formato elevado da taxa de transferência. Em contraste com o monitoramento contínuo da reação de ATPase no ensaio acoplado ao NADH, um ensaio de Endpoint simplesmente assume cursos de tempo lineares e não pode revelar artefatos que levam a não-linearidades. Compostos que interagem com a malaquita verde ou o complexo formado também podem levar a artefatos²¹. Além disso, o ensaio de malaquite verde é muito sensível à contaminação por fosfato²⁴. Por outro lado, o ensaio acoplado ao NADH não é sensível à contaminação por ADP, pois a ADP (que está sempre presente em vários níveis em amostras de ATP) é rapidamente transformada em ATP por PK no início da reação. Não há necessidade de têmpera ou separação dos produtos. Um outro ensaio fluorométrica para a medida de taxas de ATPase foi desenvolvido já acoplando a hidrólise do ATP à reação catalisada pelo fosforilase do nucleosídeo³⁴. No entanto, esse ensaio não utiliza um ciclo de regeneração ATP, portanto, a determinação das taxas de reação inicial pode ser muito mais desafiador.

Futuras aplicações ou direções do método

Muitas enzimas que dependem da atividade da ATPase têm sido exploradas como alvos potenciais de drogas. Estes incluem proteínas do motor citoesquelético pertencentes às famílias cinesina³⁵ e dynein³⁶ e o DNA helicases³⁷, todos os quais são os efetores terminais em diversas vias de sinalização. O ensaio descrito aqui pode ser facilmente otimizado para a descoberta de medicamentos e projetos de desenvolvimento envolvendo qualquer enzima catalisando uma reação em que a ADP é um produto.

Os autores não têm nada a revelar.

Este trabalho foi apoiado por uma subvenção do Instituto Nacional de distúrbios neurológicos e AVC e Instituto Nacional de abuso de drogas NS096833 (CAM).