Применение биослойной интерферометрии (BLI) для изучения белково-белковых взаимодействий в транскрипции

Взаимодействие транскрипционных факторов (TFs) с РНК-полимеразой обычно изучается с помощью анализов свау. Мы применяем технологию биослойной интерферометрии (BLI) для характеристики взаимодействия GrgA с хламидиальной РНК-полимеразой. По сравнению с анализами стягивания, BLI обнаруживает ассоциацию и диссоциацию в реальном времени, обеспечивает более высокую чувствительность и является высокой количественной.

Фактор транскрипции (TF) является белок, который регулирует экспрессию генов, взаимодействуя с РНК-полимераза, другой TF, и / или шаблон ДНК. GrgA является новым активатором транскрипции, найденным специально в облике внутриклеточного бактериального патогена Хламидиоз. Белковые анализы с использованием бисера сродства показали, что GrgA связывает два фактора, а именно:⁶⁶ и^28,которые распознают различные наборы промоутеров для генов, продукты которых по-разному необходимы на стадиях развития. Мы использовали BLI для подтверждения и дальнейшей характеристики взаимодействий. BLI демонстрирует несколько преимуществ по сравнению с выдвижной: 1) Он показывает в режиме реального времени ассоциации и диссоциации между обязательными партнерами, 2) Он генерирует количественные кинетические параметры, и 3) Он может обнаружить привязки, что выдвижной анализы часто не обнаруживаются. Эти характеристики позволили нам вывести физиологические роли GrgA в регуляции экспрессии генов в хламидиозе,и возможные подробные механизмы взаимодействия. Мы представляем, что эта относительно доступная технология может быть чрезвычайно полезна для изучения транскрипции и других биологических процессов.

Транскрипция, которая производит молекулы РНК с использованием ДНК в качестве шаблона, является самым первым шагом экспрессии генов. Бактериальный синтез РНК начинается после связывания РНК-полимераза(RNAP) голефермента к целевому промоутеру 1,². Голензим RNAP (RNAPholo) состоит из многосубунитая каталитического ядра (РНАПкор) и коэффициента, который необходим для распознавания последовательности промотора. Активаторы и репрессоры транскрипции, которые в совокупности называются TFs, регулируют экспрессию генов через связывающие компоненты РНАПКОР, факторы и/или ДНК. В зависимости от организма, значительная часть его генома может быть посвящена TFs, которые регулируют транскрипцию в ответ на физиологические потребности и экологические сигналы³.

Хламидиоз является обликовой внутриклеточной бактерией, ответственной заразличные заболевания у людей и животных 4,^5,6,7. Например, Chlamydia trachomatis, возможно, номер один венерических патогенов в организме человека во всем мире, и ведущей причиной слепоты в некоторых слаборазвитых странах^4,5. Хламидиоз имеет уникальный цикл развития, характеризующийся двумя чередующимися клеточными формами, терминированными элементарным телом (EB) и ретикулированным телом (RB)^9. В то время как ЭБ способны выжить во внеклеточной среде, они неспособны к распространению. EBs ввести клетки хозяина через эндоцитоз и дифференцировать в более большие RBs в vacuole в цитоплазме хозяина в течение нескольких часов после прививки. Больше не заразны, RBs размножаться через двоичные деления. Около 20 ч, они начинают дифференцировать обратно к EBs, которые выходят из клеток-хозяев около 30-70 ч.

Прогрессирование цикла развития хламидийного регулируется транскрипцией. В то время как супербольшинство из почти 1000 генов хламидийных выражены во время среднего цикла, во время которого РБ активно реплицируются, только небольшое количество генов транскрибируются сразу после вступления EBs в клетки-хозяина, чтобы инициировать преобразование EBs в RBs, и другой небольшой набор генов транскрибируются или все чаще транскрибируются, чтобы дифференциация РБ в EBs^10,11.

Геном хламидийного кода кодирует три фактора, а именно:^66,28 и⁵⁴. 66 , что эквивалентно ведению домашнего хозяйства^{No 70} кишечной палочки и других бактерий, отвечает за распознавание промоторов генов раннего и среднего цикла, а также некоторых поздних генов, в то время как для распознавания генов раннего и среднего цикла требуется²⁸ и⁵⁴ евро транскрипция некоторых поздних генов. Несколько генов, какизвестно, несут как No 66-зависимых промоутер и No 28-зависимых промоутер¹².

Несмотря на сложный цикл развития, лишь небольшое количество TFs были найдены в хламидиоза¹³. GrgA (ранее аннотированный как гипотетический белок CT504 в C. trachomatis serovar D и CTL0766 в C. trachomatis L2) является Chlamydia-специфическимTF, первоначально признанным активатором генов No 66-зависимых¹⁴. Аффинити вытягивания анализы показали, что GrgA активирует их транскрипции, связывая как^{No 66} и ДНК. Интересно, что позже было найдено с тем, что GrgA также совместно осаждает с²⁸, и активирует транскрипцию от 28-зависимых промоутеров in vitro¹⁵. Чтобы исследовать, имеет ли GrgA сходные или различные сходства для^{No 66} и^{No 28,}мы прибегли к использованию BLI. BLI анализы показали, что GrgA взаимодействует с^{No 66} в 30-кратном более высоком сродстве, чем с^28,предполагая, что GrgA может играть дифференцированные роли в 66-зависимой транскрипции и^{28-зависимой}транскрипции ¹⁵.

BLI обнаруживает интерференционную модель белого света, которая отражается от слоя обездвиженого белка на кончике биосенсора, и сравнивает его с внутренним эталонным слоем^16. Благодаря анализу этих двух интерференционных моделей, BLI может предоставить ценную и в режиме реального времени информацию о количестве белка, привязанного к кончику биосенсора. Белок, который обездвижен к кончику биосенсора, называется лигандом и, как правило, обездвижен с помощью общего антитела или эпитопа (например, поли-Его- или биотин-тег), который имеет сродство к ассоциированной частицы (например, NTA или Стрептавидин) на кончике биосенсора. Связывание вторичного белка, называемого анализным, с лигандой на кончике биосенсора создает изменения в непрозрачности биосенсора и, следовательно, приводит к изменениям в интерференционных моделях. При повторении в течение различных концентраций аналита, BLI может предоставить не только качественную, но и количественную информацию о сродстве между лигандом и аналитом¹⁶.

Насколько нам известно, мы были первыми, кто использовал BLI для характеристики белково-белковых взаимодействий в транскрипции¹⁵. В этой публикации мы демонстрируем, что фрагмент GrgA,который ранее был показан как необходимый для 28-связной, действительно опосредует привязку. Данная рукопись посвящена шагам анализов BLI, а также генерации графиков BLI и параметров связывающей кинетики. Методы производства (и очистки) лигандов и аналитов здесь не охватываются.

1. Подготовка белков

1. Используйте диализный мешок (с соответствующим размером отсечения) для диализа каждого белка, который будет использоваться для анализов BLI (включая лиганд с его тегами и анализ) против 1000 томов буфера BLI (25 мм Tris-HCl, 150 мм NaCl, 0,1 мМ EDTA, 10 мм 2Cl , 0,1 мм DTT, pH 8.0, предварительно охлажденный до 4 градусов по Цельсию) при 4 C для 4 ч.
   ПРИМЕЧАНИЕ: BLI анализы требуют лиганд присутствовать в концентрациях, которые насыщает связывающих сайтов на биосенсорине и анализ, чтобы быть высоко очищены так, что моляры концентрации анализ, которые реагируют с лигандом известно. Методологии выражения и очищения белков, отмеченных его и стрептными, здесь не освещаются, но можно найти в предыдущих публикациях^14,15. Хотя эта система не требует, чтобы лиганд был в высокоочищенной форме, важно диализировать даже неочищенные лиганды в буфер BLI, чтобы свести к минимуму сдвиги в бело-световых помех, вызванных любыми изменениями буфера во время асссе.
2. Переключитесь на свежий буфер BLI и продолжайте диализ еще 4 ч.

2. Установка биосенсора и асссеивания

1. Приблизительно за 10 минут до начала ассоциации пипетка 200 л буфера BLI в трубку ПЦР.
2. Удалите Ni-NTA-биосенсор из оригинальной упаковки, удерживая широкую часть биосенсора с помощью руки в перчатках.
3. Поместите биосенсор над ПЦР-трубкой так, чтобы только стеклянная кончик биосенсора погружалась в буфер BLI.
4. Держите наконечник биосенсора погруженным в воду, по крайней мере 10 минут, чтобы обеспечить полную гидратацию.
   1. Убедитесь, что стеклянный кончик Ni-NTA-биосенсора не касается ничего, кроме буфера BLI во время вышеуказанного шага.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол использует Ni-NTA-биосенсор в сочетании с его тегами лиганд. При необходимости, SA-Streptavidin-биосенсор может быть использован в сочетании с биотинилатамиличенной лиганд вместо этого, если: (i) как лиганд и analyte нести Его теги или (ii) ни один из них не делает.
5. Включите машину BLItz.
6. Убедитесь, что машина подключена к компьютеру через порт вывода данных USB в задней части машины.
7. На компьютере откройте связанное с этим программное обеспечение (например, BLItz Pro) и нажмите на Advanced Kinetics на левой стороне экрана.
8. На программном обеспечении введите всю соответствующую информацию об эксперименте (включая название эксперимента, описание, идентификатор образца и концентрацию белка) под каждым соответствующим заголовком.
9. Нажмите на тип Biosensor и выберите Ni-NTA из выпадающего меню.
   1. Под заголовком «Параметры запуска» убедитесь, что шейкер настроен на включение.
   2. Под заголовком «Список типов шагов» убедитесь, что в списке 5 элементов: начальный базовый упор, загрузка, базовый универсал, ассоциация и диссоциация.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Продолжительность каждого шага может быть изменена по умолчанию по мере необходимости. Для достижения оптимальных результатов используйте минимум 30 с для начального базового и базового уровня; и 120 с для ассоциации и диссоциации. Продолжительность шага загрузки (от 120 до 240 с) будет зависеть от концентрации лиганда и сродства тега Его эпитопа на лиганде к Ni-NTA-биосенсору.
10. Удалите гидратированный Ni-NTA-биосенсор из трубки ПЦР и прикрепите его к биосенсорному креплению на машине, сдвинув широкую часть биосенсора на крепление.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не позволяйте биосенсор высохнуть во время эксперимента.
11. Поместите в него черную микроцентрифуговую трубку 0,5 мл в держатель трубки машины и пипетку 400 л буфера BLI.
12. Убедитесь, что ползунок машины расположен таким образом, что держатель трубки расположен перед черной стрелкой на машине.
13. Закройте крышку машины так, чтобы наконечник биосенсора погружался в буфер в микроцентрифуговой трубке.
14. Нажмите далее на программное обеспечение, чтобы начать запись исходного базового.

3. Загрузка лиганда на биосенсор

1. После того, как начальный базовый шаг закончил запись, откройте обложку машины.
2. Переместите ползунок вправо так, чтобы держатель капли (вместо держателя трубки) располагался перед черной стрелкой.
3. Пипетка 4 л диализированного лиганда (от шага 1.1) на держатель падения и закройте крышку машины.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Оптимальная концентрация лиганда, который будет использоваться может варьироваться для каждого белка. Концентрация от 1,0 до 2,0 мг/мл обычно достаточна для насыщения NTA на кончике биосенсора в 240 с.
4. На программное обеспечение, нажмите Далее, чтобы начать загрузку.

4. Стирка дополнительного лиганда

1. После того, как шаг загрузки закончил запись, откройте обложку машины.
2. Переместите ползунок влево так, чтобы держатель трубки вновь находился перед черной стрелкой.
3. Закройте крышку машины и убедитесь, что кончик биосенсора погружается в буфер BLI трубки в держателе трубки.
4. Нажмите Далее еще раз на программное обеспечение, чтобы начать запись базового.

5. Ассоциация аналита к лиганду

1. После того, как базовый шаг закончил запись, откройте обложку машины.
2. Удалите держатель капли и очистите его, промывив любой белок и промыв его двойной деионизированной водой (ddH₂O) в общей сложности 5 раз.
   1. Используйте салфетку, чтобы очистить поверхность держателя капли после мытья.
3. Замените держатель капли обратно на машину.
4. Переместите ползунок на машине вправо так, чтобы держатель капли снова находился перед черной стрелкой.
5. Пипетка 4 Зл диализированного аналита (от шага 1.1) на держатель падения и закройте крышку машины.
6. На программное обеспечение, нажмите Далее, чтобы начать ассоциации.

6. Диссоциация аналита от лиганд

1. После того, как шаг Ассоциации закончил запись, откройте обложку машины.
2. Переместите ползунок на машине вправо так, чтобы держатель трубки вновь располагался перед черной стрелкой.
3. На программном обеспечении, нажмите Далее, чтобы начать диссоциацию.
4. После того, как шаг диссоциации закончил запись, откройте обложку машины.
5. Удалите держатель капли и трубку держатель.
6. Промыть как с ddH₂O тщательно смыть любой белок.
7. Удалите биосенсор и отбросьте его безопасно.

7. Повторяющиеся взаимодействия с различными концентрациями

1. Повторите шаги 2-7 для одной и той же пары лиганд-аналитов, используя различные концентрации аналита.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация аналита, возможно, потребуется скорректировать на нескольких трассах, прежде чем получить оптимальные результаты. По нашему опыту, соотношение 1:5:10 концентраций анализов, начиная с 75 нм, обычно является адекватным.

8. Анализ данных с помощью программного обеспечения

1. После того, как все запуски закончились, сохранить данные о программном обеспечении, нажав файл, а затем сохранить эксперимент, как на левой стороне экрана.
2. Под заголовком Run Data выберите «Коррекция шагов» и «Фиттинг» (1:1) и нажмите «Анализ» для генерации кинетической передачи данных.
3. Чтобы извлечь количественные данные в лист и создать графики, нажмите на Экспорт в CSV и сохраните записанные данные в виде файла .csv. Откройте файл .csv с помощью программного обеспечения электронной таблицы.
   1. Чтобы наиболее эффективно показать кинетику Ассоциации и Диссоциации, удалите все точки участка до базового шага и нормализуй все последующие точки участка из конечного базового значения.

Через BLI анализы, мы ранее установили, что связывание GrgA до^{No 28} зависит от 28 аминокислот среднего региона (остатки 138-165) GrgA¹⁵. Соответственно, по сравнению с N-терминально Его помечены полной длины GrgA (NH-GrgA), GrgA удаления конструкции не хватает этого региона (NH-GrgA-138-165) было снижение ассоциации ставка и увеличение диссоциации, что приводит к 3 миллионов раз потери общего сродство (Таблица 1). Здесь мы демонстрируем, что эта средняя область непосредственно связывает²⁸ в отсутствие остального белка GrgA. В этих экспериментах, средний регион помечены N-терминально Его-тег (NH-GrgA138-165) был использован в качестве лигана, который был впервые обездвижен к кончику биосенсора Ni-NTA (Рисунок 1A). После смывания несвязанного NH-GrgA138-165 с биосенсора, в режиме реального времени связь с аналитом^{No 28} была зарегистрирована после добавления²⁸. Наконец, после стирки была зафиксирована диссоциация в реальном времени. Записи экспериментов с тремя различными концентрациями аналитов, начиная с 30 с до связывания лиганда и заканчивая 2 минутами после начала стирки, показаны на рисунке 1A. Чтобы лучше визуализировать взаимодействие лиганд-аналитика, мы удаляем данные до добавления лиганда и сбросим базовый урядный до 0, чтобы получить рисунок 1B.

Значения кинетических параметров для взаимодействия фрагмента NH-GrgA138-165 с No²⁸ представлены в таблице 1. По сравнению с взаимодействием NH-GrgA X^28, взаимодействие NH-GrgA138-165 X и²⁸ отображает трендовое статистически значимое снижение на 60% в кг_а, высоко статистически значимое увеличение на 64% в к_д , и высоко статистически значимое 3,5-кратное увеличение K_D. Эти изменения свидетельствуют о том, что по сравнению с NH-GrgA, NH-GrgA138-165 связывает²⁸ медленнее, отделяется от²⁸ евро быстрее, и имеет снижение общего сродства с²⁸. Таким образом, остатки 138-165 в GrgA связывает^{No 28,} но с уменьшенным сродством по сравнению с полной длиной GrgA.

Рисунок 1: 28 аминокислот среднего региона GrgA связывает²⁸ в пробирке.
(A) Изменения в режиме реального времени в световых интерференционных моделей, записанных в четыре этапа: (i) привязка NH-GrgA138-165 (Лиганд) к биосенсору Ni-NTA, (ii) мыть, (iii) связывание NS-28 (Analyte) в разных концентрациях к обездвиженным NH-GrgA-138-165 (Лиганд) и (iv) последующая стирка. (B) Улучшенная визуализация ассоциации лиганд-аналита и диссоциации после удаления значений в первых двух стадиях от (A) и сброс исходной линии. Панель B модифицирована от Desai et al., 2018¹⁵. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Таблица 1: Мутант GrgA, содержащий только остатки аминокислот 138-165, связывает^{No 28,} несмотря на более низкое сродство по сравнению с полнометражным GrgA.
BLI анализы были выполнены с Ni-NTA биосенсоров с использованием его помечены полнометражный GrgA или удаление мутантов в качестве лигандов и очищенных Strep-тегами^{No 28} в качестве анализна. Графики записей показаны на рисунке 1. Значения кинетических параметров (средние и стандартные отклонения) были сгенерированы с помощью связанного программного обеспечения¹⁷. k _a (постоянная скорость ассоциации) определяется как количество комплексов, образуются на с в 1 молярном растворе A и B. k_d (постоянная скорость диссоциации) определяется как количество комплексов, распадающихся в секунду. K _D (диссоциация равновесия постоянной), определяется как концентрация, при которой 50% лиганд связывающих сайтов заняты аналитиков, k_d разделены на к_a. n, количество экспериментальных повторов. значения p были рассчитаны с помощью 2-хвостых тестов студента t. Кинетические параметры для NH-GrgA и NH-GrgA-138-165 были от Desai et al., 2018¹⁵.

Белково-белковые взаимодействия имеют решающее значение для регуляции транскрипции и других биологических процессов. Они наиболее часто изучаются с помощью анализов свайпов. Хотя анализы вытягивания относительно легки для выполнения, они плохо количественные и могут не обнаружить слабые, но биологически значимые взаимодействия. Для сравнения, путем обнаружения в режиме реального времени ассоциации и диссоциации между лигандой и аналит, BLI обеспечивает ассоциации и диссоциации скорость константы, а также, общее сродство.

По сравнению с анализами стягивания, анализы BLI предлагают более высокую чувствительность. Например, взаимодействия GrgA-Я²⁸ обнаруживаются с более низкими концентрациями nM анализов BLI, но не путем анализа вытягивания (неопубликованные данные). В отличие от вытягивания, BLI не полагается на обнаружение антитела, которые могут значительно повлиять на чувствительность.

Что еще более важно, АНАЛИЗы BLI могут обеспечить механистическое понимание взаимодействия между белками, в то время как анализы вытягивания не могут. Об этом свидетельствует взаимодействие^{No 28} с различными конструкциями GrgA. По сравнению с NH-GrgA, NH-GrgA-138-165 и NH-GrgA138-165 страдают только 60% потери в к_в связке²⁸. Эти выводы согласуются с нашими предыдущими данными BLI, показывающими, что GrgA, не имеющая своих остатков N-терминала 64, имеет уменьшенное сродство с^{No 28,}предполагая, что N-терминальная последовательность GrgA способствует связыванию²⁸ евро. Несмотря на то, что NH-GrA-138-165 и NH-GrgA138-165 имеют аналогичные значения k_a в связке^{No 28,}первый имеет 91 000 раз выше k_d, чем последний. Эти результаты показывают, что связывание 138-165 вызывает структурные изменения в GrgA, значительно стабилизируя комплекс.

С более длинной историей чем BLI, резонанс плазмон поверхности (SPR) может также quantify взаимодействия протеина-белка в реальном времени^18,19. Хотя чувствительность BLI, как полагают, ниже, чем у SPR²⁰, первый в настоящее время превосходит последний по рентабельности. Например, стоимость биосенсоров SPR намного выше, чем у биосенсоров BLI.

Из-за характера основного принципа SPR, он находится под сильным влиянием микрофлюики средств, окружающих белок. Таким образом, эксперименты с участием некоторых инструментов SPR требуют значительного восприятия со стороны исследователя, чтобы обеспечить оптимальные условия буфера^21,22,23,24. С другой стороны, современные приборы BLI имеют очень ограниченный диапазон контроля температуры²⁵ и, как таковые, плохо приспособлены для определения термодинамических параметров (таких как энталпи и свободная энергия Гиббса) для данного взаимодействия.

Глицерол, широко используемый криопротектор, несовместим с BLI, несмотря на его широкую химическую совместимость. Поэтому очень важно удалить глицерол из лиганда и сделать дополнительный прогноз диализом. Полученные белки без глицерола должны храниться при 4 градусах Цельсия, что может привести к повышенной нестабильности и неточным кинетические параметры. Мы рекомендуем, чтобы анализы BLI проводились вскоре после диализа, особенно если несовместимые кинетические параметры получены из разных времен. Точные сроки, в течение которых BLI анализы должны быть завершены будет варьироваться между белками и будут зависеть от их концентрации.

Как и в SPR, BLI был использован для малых молекул скрининга²⁶. Учитывая, что новые инструменты BLI предлагают высокие возможности скрининга, мы представляем, что BLI может стать очень полезным для идентификации и характеристики малых молекул, которые облегчают или мешают белково-белковым взаимодействиям.

Авторам нечего раскрывать.

Эта работа была поддержана Национальными институтами здравоохранения (Гранты AI122034 и AI140167) и Фондом здравоохранения Нью-Джерси (Грант 20-18).