Applicazione dell'interferometria biostrato (BLI) per lo studio delle interazioni tra proteine e proteine nella trascrizione

Le interazioni dei fattori di trascrizione (TF) con la polimerasi dell'RNA sono di solito studiate utilizzando saggi pulldown. Applichiamo una tecnologia di interferometria biostrato (BLI) per caratterizzare l'interazione di GrgA con la mistidiaRNA polimerasi. Rispetto ai test pulldown, BLI rileva l'associazione e la dissociazione in tempo reale, offre una maggiore sensibilità ed è altamente quantitativa.

Un fattore di trascrizione (TF) è una proteina che regola l'espressione genica interagendo con la polimerasi dell'RNA, un altro TF e/o il DNA del modello. GrgA è un nuovo attivatore di trascrizione trovato specificamente nel patogeno batterico intracellulare obbligatorio Chlamydia. L'abbattimenti delle proteine che utilizzano perline di affinità hanno rivelato che laGrgA lega due fattori, vale a dire il^{valore di 66} , che riconoscono diversi gruppi di promotori per i geni i cui prodotti sono necessari in modo differenziale nelle fasi di sviluppo. Abbiamo usato BLI per confermare e caratterizzare ulteriormente le interazioni. BLI dimostra diversi vantaggi rispetto al pulldown: 1) Rivela l'associazione in tempo reale e la dissociazione tra i partner di legame, 2) Genera parametri cinetici quantitativi, e 3) Può rilevare attacchi che i saggi pulldown spesso non riescono a rilevare. Queste caratteristiche ci hanno permesso di dedurre i ruoli fisiologici di GrgA nella regolazione dell'espressione genica in Chlamydiae possibili meccanismi di interazione dettagliati. Prevediamo che questa tecnologia relativamente conveniente può essere estremamente utile per studiare la trascrizione e altri processi biologici.

La trascrizione, che produce molecole di RNA usando il DNA come modello, è il primo passo dell'espressione genica. La sintesi dell'RNA batterica inizia dopo il legame dell'ologassi dell'RNA polimerasi (RNAP) a un promotore bersaglio^1,2. L'oloenzima RNAP (RNAPholo) è costituito da un nucleo catalitico multi-subunità (RNAPcore) e da un fattore di z, che è necessario per riconoscere la sequenza promotrice. Attivatori di trascrizione e repressori, collettivamente ritiditi TF, regolano l'espressione genica attraverso i componenti di legame dell'RNAPcore, dei fattori e/o del DNA. A seconda dell'organismo, una parte significativa del suo genoma può essere dedicata ai TF che regolano la trascrizione in risposta a i bisogni fisiologici e i segnali ambientali³.

La clamidia è un batterio intracellulare obbligato responsabile di una varietà di malattie nell'uomo e negli animali^4,5,6,7,8. Ad esempio, la clamidia transatide è probabilmente il numero uno patogeno sessualmente trasmissibile negli esseri umani in tutto il mondo, e una delle principali cause di cecità in alcuni paesi sottosviluppati^4,5. La clamidia ha un ciclo di sviluppo unico caratterizzato da due forme cellulari alternate definite corpo elementare (EB) e corpo reticolato (RB)⁹. Mentre, EBs sono in grado di sopravvivenza in un ambiente extracellulare, sono incapaci di proliferazione. Gli EB entrano nelle cellule ospiti attraverso l'endocitosi e si differenziano in MB più grandi in un vacuolo nel citoplasma ospite entro ore dopo l'inoculazione. Non più infettivi, gli MB proliferano attraverso la fissione binaria. Circa 20 h, iniziano a differenziarsi di nuovo agli EB, che escono dalle celle ospiti intorno a 30-70 h.

La progressione del ciclo di sviluppo della clamidia è regolata dalla trascrizione. Mentre una supermaggioranza dei quasi 1.000 geni clamidici è espressa durante il ciclo intermedio durante il quale gli RB si stanno replicando attivamente, solo un piccolo numero di geni viene trascritto immediatamente dopo l'ingresso di EB nelle cellule ospiti per avviare la conversione di Gli EB in MB e un altro piccolo insieme di geni sono trascritti o sempre più trascritti per consentire la differenziazione degli MB in EB^10,11.

Il genoma clamidiale codifica tre fattori, vale a dire⁶⁶,²⁸ e⁵⁴. ⁶⁶, che è equivalente alla pulizia di 70 e altri batteri, è responsabile del riconoscimento dei promotori di geni precoci e a metà ciclo, nonché di alcuni geni in ritardo, mentre sono necessari²⁸ e ⁵⁴ la trascrizione di alcuni geni tardivi. Sono noti che diversi geni trasportano sia un promotore dipendente da⁶⁶usd che un promotore dipendente da^{28USD 12}.

Nonostante un ciclo di sviluppo complicato, solo un piccolo numero di TF sono stati trovati in clamidiae¹³. GrgA (precedentemente annotato come una proteina ipotetica CT504 in C. trachomatis serovar D e CTL0766 in C. trachomatis L2) è un TF specifico di Chlamydiainizialmente riconosciuto come un attivatore di geni dipendenti da^66. I saggi di tracciamento dell'affinità hanno dimostrato che GrgA attiva la loro trascrizione legando sia il DNA di⁶⁶ che quello del DNA. È interessante notare che, in seguito è stato trovato con che GrgA co-precipita anche con²⁸, e attiva la trascrizione da^{28-dipendenti}promotori in vitro¹⁵. Per verificare se GrgA ha affinità simili o diverse per i valori⁶⁶ e²⁸, abbiamo fatto ricorso all'utilizzo di BLI. I saggi BLI hanno dimostrato che il GrgA interagisce con 66 volte con un'affinità 30 volte superiore rispetto a quella di²⁸, suggerendo che GrgA può svolgere ruoli differenziali nella trascrizione dipendente da⁶⁶USD e nella trascrizione dipendente da^{28 15}.

BLI rileva il modello di interferenza della luce bianca che si riflette da uno strato di proteine immobilizzate sulla punta di un biosensore e lo confronta con quello di un livello di riferimento interno¹⁶. Attraverso l'analisi di questi due modelli di interferenza, BLI può fornire informazioni preziose e in tempo reale sulla quantità di proteine legate alla punta del biosensore. La proteina che viene immobilizzata sulla punta del biosensore è chiamata ligando, ed è generalmente immobilizzata con l'aiuto di un anticorpo comune o di un tag epitopo (ad esempio, un poli-His- o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotina-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un'affinità per una particella associata (come NTA o biotin-tag) che ha un Streptavidin) sulla punta del biosensore. Il legame di una proteina secondaria, indicato come analita, con il ligando sulla punta del biosensore crea cambiamenti nell'opacità del biosensore e quindi si traduce in cambiamenti nei modelli di interferenza. Quando si ripete su diverse concentrazioni dell'analita, BLI può fornire non solo informazioni qualitative ma anche quantitative sull'affinità tra il ligando e l'analita¹⁶.

Per quanto ne sappiamo, siamo stati i primi ad impiegare BLI per caratterizzare le interazioni proteina-proteina nella trascrizione¹⁵. In questa pubblicazione, dimostriamo che un frammento di GrgA, che in precedenza è stato dimostrato essere necessario per l'associazione^28,media effettivamente l'associazione. Questo manoscritto si concentra sui passi dei saggi BLI e sulla generazione di grafici BLI e parametri di cinetica legante. I metodi per la produzione (e la purificazione) di ligandi e analiti non sono coperti qui.

1. Preparazione delle proteine

1. Utilizzare un sacchetto di dialisi (con una dimensione di taglio appropriata) per dialisipare ogni proteina da utilizzare per i saggi BLI (compresi sia il ligando His-tagged che l'analyte) contro 1.000 volumi del buffer BLI (25 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1 mM EDTA, 10 mM MGCl₂ , 0,1 mM DTT, pH 8,0, pre-raffreddato a 4 gradi centigradi) a 4 gradi centigradi per 4 h.
   NOTA: I saggi BLI richiedono che il ligando sia presente a concentrazioni che saturano i siti di legame sul biosensore e l'analita per essere altamente purificati in modo che le concentrazioni molare dell'analita che reagiscono con il ligando siano altamente purificate. Le metodologie per l'espressione e la purificazione delle proteine con etichettatura His e Strep non sono trattate qui, ma possono essere trovate nelle pubblicazioni precedenti^14,15. Anche se questo sistema non richiede che il ligando sia in forma altamente purificata, è essenziale diallyze anche ligando non purificati al buffer BLI al fine di ridurre al minimo i cambiamenti nei modelli di interferenza di luce bianca causati da eventuali modifiche del buffer durante il saggio.
2. Passare al buffer BLI fresco e continuare la dialisi per altri 4 h.

2. Idratazione del biosensore e set-up di analisi

1. Circa 10 minuti prima dell'inizio di un'analisi, pipetta 200 -L del tampone BLI in un tubo PCR.
2. Rimuovere un biosensore Ni-NTA dalla confezione originale tenendo l'ampia porzione del biosensore con una mano guantata.
3. Posizionare il biosensore sul tubo PCR in modo che solo la punta di vetro del biosensore sia sommersa nel buffer BLI.
4. Mantenere la punta del biosensore sommersa per almeno 10 min per garantire la piena idratazione.
   1. Verificare che la punta di vetro del Bi-NTA-biosensor non tocchi altro che il buffer BLI durante la fase precedente.
      NOTA: questo protocollo utilizza un biosensore Ni-NTA in combinazione con un ligando con etichettatura His. Se necessario, un biosensore SA-Streptavidin può essere utilizzato in combinazione con un ligando biotinylato se: (i) sia il ligando che l'analita portano un suo tag o (ii) nessuno dei due lo fa.
5. Accendere la macchina BLItz.
6. Assicurarsi che la macchina sia collegata al computer tramite una porta di uscita dati USB sul retro della macchina.
7. Sul computer, aprire il software associato (ad esempio, BLItz Pro) e fare clic su Cinetica avanzata sul lato sinistro dello schermo.
8. Sul software, digitare tutte le informazioni appropriate sull'esperimento (inclusi il nome dell'esperimento, la descrizione, l'ID di esempio e la concentrazione proteica) sotto ogni rispettiva intestazione.
9. Fare clic su Tipo di biosensore e scegliere Ni-NTA dal menu a discesa.
   1. Sotto l'intestazione Impostazioni di esecuzione , verificare che lo Shaker sia impostato su Abilita.
   2. Sotto l'intestazione Elenco tipi di passaggio verificare che siano elencati 5 elementi: Linea di base iniziale, Caricamento, Linea di base, Associazione e Dissociazione.
      NOTA: la durata di ogni passaggio può essere modificata rispetto all'impostazione predefinita in base alle esigenze. Per ottenere risultati ottimali, utilizzare un minimo di 30 s per la linea di base iniziale e la linea di base; e 120 s per l'Associazione e la Dissociazione. La durata del passo di caricamento (compreso tra 120 e 240 s) dipenderà dalla concentrazione del ligando e dall'affinità del tag His-epitope sul ligando al bisensore Ni-NTA.
10. Rimuovere il biosensore Ni-NTA-idratato dal tubo PCR e apporrlo al supporto del biosensore sulla macchina facendo scorrere l'ampia porzione del biosensore sul supporto.
    NOTA: Non lasciare asciugare il biosensore durante l'esperimento.
11. Inserire un tubo di microcentrifuga nera da 0,5 ml nel supporto del tubo della macchina e in una pipetta 400 l del tampone BLI.
12. Verificare che il dispositivo di scorrimento della macchina sia posizionato in modo che il supporto del tubo sia posizionato davanti alla freccia nera sulla macchina.
13. Chiudere il coperchio della macchina in modo che la punta del biosensore si sommerge nel buffer nel tubo di microcentrifuga.
14. Fare clic su Avanti nel software per iniziare a registrare la linea di base iniziale.

3. Caricamento del ligando sul biosensore

1. Al termine della registrazione della linea di base iniziale, aprire il coperchio della macchina.
2. Spostare il dispositivo di scorrimento a destra in modo che il supporto di goccia (invece del supporto del tubo) si trovi davanti alla freccia nera.
3. Pipetta 4 - L di un ligando dializzato His-tagged (dal passo 1.1) sul supporto di goccia e chiudere il coperchio della macchina.
   NOTA: La concentrazione ottimale del ligando da utilizzare può variare per ogni proteina. Una concentrazione tra 1,0 e 2,0 mg/mL è di solito adeguata a saturare l'NTA sulla punta del biosensore in 240 s.
4. Sul software, fare clic su Avanti per iniziare il caricamento.

4. Lavaggio del ligando aggiuntivo

1. Al termine della registrazione del passaggio Caricamento, aprire il coperchio della macchina.
2. Spostare il dispositivo di scorrimento a sinistra in modo che il supporto del tubo sia nuovamente posizionato davanti alla freccia nera.
3. Chiudere il coperchio della macchina e assicurarsi che la punta del biosensore sia sommersa nel buffer BLI del tubo nel supporto del tubo.
4. Fare di nuovo clic su Avanti nel software per iniziare a registrare la linea di base.

5. Associazione dell'analita al ligando

1. Al termine della registrazione del passaggio di base, aprire il coperchio della macchina.
2. Rimuovere il supporto goccia e pulirlo con il pipeting di qualsiasi proteina e sciacquandolo con acqua a doppio deionizzato (ddH₂O) per un totale di 5 volte.
   1. Utilizzare una pulizia del tessuto per pulire la superficie del supporto goccia dopo il lavaggio.
3. Sostituire nuovamente il supporto di goccia sulla macchina.
4. Spostare il cursore sulla macchina a destra in modo che il supporto goccia è ancora una volta situato di fronte alla freccia nera.
5. Pipetta 4 - L di un analizzato dialisse (dal punto 1.1) sul supporto di goccia e chiudere il coperchio della macchina.
6. Sul software, fare clic su Avanti per iniziare l'associazione.

6. Dissociazione dell'analita dal ligando

1. Al termine della registrazione del passaggio di associazione, aprire il coperchio della macchina.
2. Spostare il cursore sulla macchina a destra in modo che il supporto del tubo sia ancora una volta situato davanti alla freccia nera.
3. Nel software, fare clic su Avanti per iniziare Dissociazione.
4. Al termine della registrazione della fase di dissociazione, aprire il coperchio della macchina.
5. Rimuovere il supporto per la goccia e il supporto del tubo.
6. Risciacquare entrambi con ddH₂O accuratamente per lavare via qualsiasi proteina.
7. Rimuovere il biosensore e scartarlo in modo sicuro.

7. Ripetizione di interazioni con concentrazioni diverse

1. Ripetere i passaggi da 2 a 7 per la stessa coppia ligando-analita utilizzando diverse concentrazioni di analiti.
   NOTA: Potrebbe essere necessario regolare la concentrazione dell'analita su più rampe prima di ottenere risultati ottimali. Nella nostra esperienza, un rapporto di 1:5:10 di concentrazioni di analiti, a partire da 75 nM, è di solito adeguato.

8. Analisi dei dati mediante il software

1. Al termine di tutte le esecuzioni, salvare i dati nel software facendo clic su File e quindi su Salva esperimento con nome sul lato sinistro dello schermo.
2. Sotto l'intestazione Esegui dati, selezionare Correzione e adattamento passo (1:1) e fare clic su Analizza per generare dati cinetici.
3. Per estrarre i dati quantitativi in un foglio di lavoro e generare grafici, fare clic su Esporta in CSV e salvare i dati registrati come file CSV. Aprire il file CSV utilizzando il foglio di calcolo.
   1. Per visualizzare in modo più efficace la cinetica di associazione e dissociazione, rimuovere tutti i punti del tracciato prima del passo della linea di base e normalizzare tutti i punti del tracciato successivi dal valore della linea di base finale.

Attraverso i test BLI, in precedenza abbiamo stabilito che il legame di GrgA a²⁸ è dipendente da una regione media di 28 amminoacidi (residui 138-165) di GrgA¹⁵. Di conseguenza, rispetto a GrgA (NH-GrgA) a lunghezza piena etichettati con N-terminale, un costrutto di delezione GrgA privo di questa regione (NH-GrgA-138-165) ha registrato una diminuzione del tasso di associazione e un aumento del tasso di dissociazione, che ha portato a una perdita complessiva di 3 milioni di affinità (Tabella 1). Qui, dimostriamo che questa regione centrale lega direttamente 28 in assenza del resto della proteina GrgA. In questi esperimenti, la regione centrale etichettata con un His-tag N-terminally (NH-GrgA138-165) è stato utilizzato come il ligando, che è stato prima immobilizzato sulla punta di un biosensore Ni-NTA (Figura 1A). Dopo aver lavato nH-GrgA138-165 dal biosensore, è stata registrata un'associazione in tempo reale con l'analita -²⁸ dopo l'aggiunta di²⁸. Infine, la dissociazione in tempo reale è stata registrata dopo il lavaggio. Le registrazioni di esperimenti con tre diverse concentrazioni di analiti a partire da 30 s prima della rilegatura del ligando e terminano 2 minuti dopo l'inizio del lavaggio sono mostrate nella Figura 1A. Per visualizzare meglio l'interazione ligando-analita, rimuoviamo i dati prima dell'aggiunta del ligando e reimpostiamo la linea di base su 0 per derivare Figura 1B.

I valori dei parametri cinetici per l'interazione del frammento NH-GrgA138-165 con il valore²⁸ sono riportati nella tabella 1. Rispetto all'interazione NH-GrgA X^{- 28,} l'interazione NH-GrgA138-165 X²⁸ ha mostrato una riduzione statisticamente significativa del 60% in k_a, un aumento altamente statisticamente significativo del 64% in k_d , e un aumento di 3,5 volte molto significativo dal punto di vista statistico in K_D. Questi cambiamenti dimostrano che, rispetto a NH-GrgA, NH-GrgA138-165 associa più lentamente, dissocia to-28 più velocemente, e ha una minore affinità generale con 28 . Pertanto, i residui 138-165 in GrgA si legano a^28, ma con affinità ridotta rispetto al GrgA a lunghezza intera.

Figura 1: Una regione centrale di 28 amminoacidi di GrgA si lega a²⁸ in vitro.
(A) Cambiamenti in tempo reale nei modelli di interferenza della luce registrati da in quattro fasi: (i) rilegatura di NH-GrgA138-165 (Ligand) a un biosensore Ni-NTA, (ii) lavaggio, (iii) rilegatura di NS-- NH-GrgA-138-165 (Ligand), e (iv) lavaggio successivo. (B) Visualizzazione migliorata dell'associazione ligando-analita e dissociazione in seguito alla rimozione dei valori nelle prime due fasi da (A) e alla reimpostazione della linea di base. Il pannello B viene modificato da Desai et al., 2018¹⁵. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Tabella 1: Un mutante di GrgA, contenente solo residui di aminoacidi 138-165, lega²⁸ nonostante la minore affinità rispetto al GrgA a lunghezza intera.
I test BLI sono stati eseguiti con biosensori Ni-NTA utilizzando GrgA a lunghezza intera etichettata Con His o soppressione di mutanti come ligando e purificati Strep-tagged n.²⁸ come analita. I grafici delle registrazioni sono illustrati nella Figura 1. I valori dei parametri cinetici (medie e deviazioni standard) sono stati generati con il software associato¹⁷. k _a (costante tasso di associazione) è definito come il numero di complessi formati per s in una soluzione molare di 1 molare di A e B. k_d (costante tasso di dissociazione) è definito come il numero di complessi che decadono al secondo. K (in vi, _D (costante di equilibrio di dissociazione), definita come la concentrazione alla quale il 50% dei siti di rilegatura del ligando sono occupati dagli analiti, è k_d diviso per k_a. n, numero di ripetizioni sperimentali. i valori p sono stati calcolati utilizzando i test t di Student a due code. I parametri cinetici per NH-GrgA e NH-GrgA-138-165 erano di Desai et al., 2018¹⁵.

Le interazioni tra proteine e proteine sono cruciali per la regolazione della trascrizione e di altri processi biologici. Sono più comunemente studiati attraverso i saggi pulldown. Anche se i saggi pulldown sono relativamente facili da eseguire, sono scarsamente quantitativi e potrebbero non riuscire a rilevare interazioni deboli ma biologicamente significative. In confronto, rilevando l'associazione e la dissociazione in tempo reale tra un ligando e un analita, BLI fornisce costanti di associazione e tasso di dissociazione, nonché, affinità complessiva.

Rispetto ai saggi pulldown, i saggi BLI offrono una maggiore sensibilità. Ad esempio, le interazioni GrgA-28 vengono rilevate con concentrazioni nM inferiori di analiti da BLI, ma non con saggi pulldown (dati non pubblicati). A differenza del pulldown, BLI non si basa su un anticorpo di rilevamento, che può influenzare significativamente la sensibilità.

Ancora più importante, le analisi BLI possono fornire informazioni meccanicistiche sull'interazione tra proteine, mentre i saggi pulldown non possono. Ciò è esemplificato dalle interazioni di²⁸ con diversi costrutti GrgA. Rispetto a NH-GrgA, NH-GrgA-1138-165 e NH-GrgA138-165 subiscono solo una perdita del 60% in k_a in binding :²⁸. Questi risultati sono coerenti con i nostri precedenti dati BLI che mostrano che GrgA privo dei suoi residui N-terminal 64 ha una minore affinità con²⁸, suggerendo che la sequenza N-terminale di GrgA contribuisce all'associazione n.^28. Anche se NH-GrgA-138-165 e NH-GrgA138-165 hanno valori simili k_in rilegatura²⁸, il primo ha un k d superiore di 91.000 volte rispetto al secondo. Questi risultati indicano che il legame di 138-165 provoca cambiamenti strutturali in GrgA, stabilizzando notevolmente il complesso.

Con una storia più lunga di BLI, la risonanza del plasmone superficiale (SPR) può anche quantificare le interazioni proteina-proteina in tempo reale^18,19. Mentre si ritiene che la sensibilità di BLI sia inferiore a quella di SPR^20,la prima supera attualmente la seconda in termini di economicità. Ad esempio, i costi dei biosensori SPR sono molto più elevati di quelli dei biosensori BLI.

A causa della natura del principio di base di SPR, è fortemente influenzato dalla microfluidica dei supporti che circondano la proteina. Pertanto, gli esperimenti che coinvolgono alcuni strumenti SPR richiedono una notevole percezione da parte del ricercatore per garantire condizioni ottimali di buffer^21,22,23,24. D'altra parte, gli attuali strumenti BLI presentano una gamma di controllo della temperatura molto limitata²⁵ e, in quanto tali, non sono adatti per determinare i parametri termodinamici (come l'enthalpy e l'energia libera di Gibbs) per una data interazione.

Glicerolo, un crioprotectant comunemente usato, è incompatibile con BLI, nonostante la sua ampia compatibilità chimica. Pertanto, è fondamentale rimuovere il glicerolo dal ligando e dall'analita per dialisi. Le proteine prive di glicerolo risultanti devono essere immagazzinate a 4 gradi centigradi, il che può portare a una maggiore instabilità e a parametri cinetici imprecisi. Raccomandiamo che i saggi BLI vengano eseguiti subito dopo la dialisi, in particolare se si ottengono parametri cinetici incoerenti in momenti diversi. L'esatto lasso di tempo entro il quale i test BLI dovrebbero essere completati varia tra le proteine e sarà influenzato dalle loro concentrazioni.

Come con SPR, BLI è stato utilizzato per lo screening di piccole molecole²⁶. Considerando che gli strumenti BLI più recenti offrono opzioni ad alto throughput per lo screening, immaginiamo che BLI possa diventare molto utile per l'identificazione e la caratterizzazione di piccole molecole che facilitano o interferiscono con le interazioni proteina-proteina.

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo lavoro è stato supportato da National Institutes of Health (Grants - AI122034 e AI140167) e dalla New Jersey Health Foundation (Grant - PC 20-18).